食品安全快速檢測技術7-分子雜交技術

1、分子雜交技術一、分子雜交種類二、分子雜交的一般程序三、雜交樣品膜的制備 四、標記探針的制備五、分子雜交與結(jié)果檢測六、核酸分子雜交實驗因素的優(yōu)化整理ppt整理ppt分子雜交技術分子生物學中用于檢測生物樣本中是否含有特定的生物分子的一門技術。樣 品 制 備電 泳雜 交轉(zhuǎn) 膜結(jié)果顯示探 針 制 備分 子 雜 交 流 程 圖整理ppt核酸分子雜交整理ppt一. 分子雜交種類 1. 按其分子種類劃分 1） DNA雜交探針為DNA或RNA 2） RNA雜交探針為DNA或cDNA 3） 蛋白質(zhì)免疫分析探針為抗體整理ppt2. 按樣品制備過程劃分 1） 原位雜交(in situ hybridization)

2、i. 原位菌落雜交 ii. 原位噬菌斑雜交 iii. 原位細胞雜交 iv. 原位組織塊雜交 原位裂解細胞，不需要分離DNA，RNA或蛋白質(zhì)樣品，可同時處理大量樣品，常用于目的基因的篩選或檢測某類細胞或組織中是否存在某一特定的DNA、RNA或蛋白質(zhì)序列。一. 分子雜交種類 整理ppt3）印跡轉(zhuǎn)移雜交(blotting hybridization) 先純化樣品，然后使不同大小的分子在凝膠上分離，轉(zhuǎn)移到固體基質(zhì)上，與探針雜交。該法可檢測出感興趣分子的分子量。用于轉(zhuǎn)移的方法有： i. 擴散法 ii. 毛細管法 iii. 電泳轉(zhuǎn)移法 iv. 真空轉(zhuǎn)移法。 根據(jù)轉(zhuǎn)移對象的不同分為Southern印記法（D

3、NA）、Northern印跡法（RNA）和Western 印跡法（蛋白質(zhì)）。一. 分子雜交種類 2）斑點雜交(dot hybridization) 先分離DNA，RNA或蛋白質(zhì)，然后將樣品液直接點在固體基質(zhì)上進行雜交，放射自顯影后，判斷是否有雜交及其雜交強度，主要用于基因缺失或拷貝數(shù)改變的檢測，半定量分析。整理ppt 它利用兩種探針與待測DNA結(jié)合，先將不帶標記的探針固定在基質(zhì)上，然后用待測樣品與之雜交，洗去非特異性結(jié)合后，再與第二種帶標記的探針雜交。這種方法可用于粗制DNA樣品，可檢測出0.2ng的DNA樣品 4) 夾心雜交法(sandwich hybridization)一. 分子雜交種類

4、 整理ppt1) DNA和RNA的雜交 制備DNA或RNA樣品與固定基質(zhì)結(jié)合80真空固定預雜交加入標記探針雜交洗滌放射自顯影或顯色反應。 2）蛋白質(zhì)的免疫分析 制備蛋白質(zhì)樣品與固定基質(zhì)結(jié)合常溫空氣中固定封閉劑封閉 一抗反應洗滌二抗-酶偶聯(lián)物反應洗滌顯色反應（EIA） 或 一抗放射標記物洗滌放射自顯影（RIA）二、 分子雜交的一般程序整理ppt1. 固定基質(zhì)的種類與特性 1）硝酸纖維素濾膜(Nitrocellulose filter, NCF) 可與三類大分子的結(jié)合，其機理不清楚，可能為被動吸附。 NCF不能結(jié) 合小分子DNA，RNA和蛋白質(zhì)（20,000）優(yōu)點：i. 用于DNA，RNA雜交分析

5、時結(jié)果可靠，靈敏，本底低。 ii. 用于蛋白質(zhì)分析時，容量大（80g/cm2)；可直接染色；分辨率高； 不需要預激活；易于操作 缺點： 結(jié)合低分子蛋白質(zhì)不穩(wěn)定，反復使用探針次數(shù)有限（2-3次） 2）重氮化紙：DBM紙與DPT纖維素紙最大特點是能結(jié)合小分子的DNA，RNA和蛋白質(zhì)，共價結(jié)合，可用不同 探針進行多次雜交分析。該類基質(zhì)結(jié)合生物大分子的能力差，需要激活，分析蛋白質(zhì)時最好用放射性標記物。這類基質(zhì)對生物大分子是主動吸附。 三、 雜交樣品膜的制備 整理ppt 3) 尼龍膜 i. 陽離子尼龍膜 i) 容量大, 蛋白質(zhì)可結(jié)合480g/cm2 ii) 可結(jié)合不同大小的DNA，RNA和蛋白質(zhì)。 ii

6、i) 韌性好 iv) 可用于電轉(zhuǎn)移 v) 可進行反復多次雜交試驗 vi) 廣泛的化學耐受性和可高溫消毒 *不能用于蛋白質(zhì)的直接染色。 ii. 尼龍66 廣泛用于核酸印跡分析，靜電荷可從pH4時陽離子狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)閜H7時陰離子狀態(tài)，電轉(zhuǎn)移時要注意。 4）離子膜 i. DEAE-纖維素紙 ii. CM-纖維素紙三、 雜交樣品膜的制備 整理ppt2. 固定基質(zhì)的選擇依據(jù) 1）強度，耐久性，操作簡便 2）高信噪比（低本底高信號） 3）生物大分子的結(jié)合容量和穩(wěn)定性 4）重現(xiàn)性好三、 雜交樣品膜的制備 整理ppt3. 各種雜交樣品膜的制備 1）原位雜交樣品膜的制備 i. 原位菌落雜交樣品膜(1) 在含有選擇

7、性抗生素的瓊脂平板上放一張硝酸纖維素濾膜。 (2) 用無菌牙簽將各個菌落先轉(zhuǎn)移至濾膜上,再轉(zhuǎn)移至含有選擇性抗生素但未放濾膜的瓊脂主平板上。應按一定的格子進行劃線接種(或打點)。每菌落應分別劃線于兩個平板的相同位置上。最后，在濾膜和主平板上同時劃一個含有非重組質(zhì)粒（如pBR322)的菌落。 (3) 倒置平板,于37培養(yǎng)至劃線的細菌菌落生長到0.5-1.0mm的寬度。 (4) 用已裝防水黑色繪圖墨水的注射器針頭穿透濾膜直至瓊脂,在3個以上的不對稱位置作標記。在主平板大致相同的位置上也作上標記。 (5) 用Parafilm膜封好主平板,倒置貯放于4,直至獲得雜交反應的結(jié)果。 (6) 裂解細菌,按下述

8、方法,使釋放的DNA結(jié)合于硝酸纖維素濾膜。 整理ppt i) 細胞培養(yǎng)（高密度，幾百十萬個菌落或低密度，幾百個以下） ii) 細菌細胞原位裂解與DNA變性 ii. 原位噬菌斑雜交樣品膜 i) 細胞感染和噬菌斑形成（10,000-20,000/平板） ii) 噬菌體轉(zhuǎn)移用NCF作影印 iii) DNA變性與固定（與上同）三、 雜交樣品膜的制備 整理ppt 2） 斑點雜交樣品膜的制備 制備樣品點樣固定（可用斑點雜交儀或直接點樣）三、 雜交樣品膜的制備 整理ppt3）轉(zhuǎn)移雜交樣品膜的制備 i. 擴散法（Difusion blotting method ) 簡單但不能定量轉(zhuǎn)移，與電轉(zhuǎn)比較只能轉(zhuǎn)移25-

9、50%的蛋白質(zhì)。整理ppt ii. 毛細管法 (Capillary blotting method )毛細管轉(zhuǎn)移法借助吸水紙吸收轉(zhuǎn)移緩沖液時所產(chǎn)生的牽引力量將DNA或RNA自膠體轉(zhuǎn)移至膜上。要轉(zhuǎn)印完全，起碼需要作用6 h以上。 雖然所需花費的時間比較長，以其不須要特別的儀器設備，毛細管轉(zhuǎn)移法目前仍被普遍采用。 Southern、Northern印跡整理pptiii. 電轉(zhuǎn)移法 (electro blotting ) ：半干法和濕法電轉(zhuǎn)。iv. 真空轉(zhuǎn)移法 (Vaccum bllotting ) 轉(zhuǎn)移速度與凝膠的厚度成反比，在相同轉(zhuǎn)移率（50%）時，真空法比毛細管法快13倍，其損失僅6%，而毛細

10、管法損失率20%。整理ppt v. 各種轉(zhuǎn)移方法的比較 i) 擴散法和毛細管法：操作簡便，不需要特殊轉(zhuǎn)移儀器，但轉(zhuǎn)移效率低,（擴散法為70%，毛細管法80%）耗時多。 ii) 電轉(zhuǎn)移法：效率高，耗時少，需特殊轉(zhuǎn)移儀，對轉(zhuǎn)移條件要求較嚴。 iii) 真空轉(zhuǎn)移法：效率高，耗時最少，需特殊真空轉(zhuǎn)移儀。vi. 轉(zhuǎn)移的最佳條件 i) 固定基質(zhì)的選擇 ii) 轉(zhuǎn)移前預處理：DNA和RNA分子變性，蛋白質(zhì)則需除去凝膠中的SDS。 iii)大分子的轉(zhuǎn)移對于分子量較大的DNA片段，必須進行原位斷裂后再進行轉(zhuǎn)移，斷裂DNA分子最佳長度為1-2kb。 其步驟是： 0.25M HCl處理凝膠兩次（每次15分鐘）水洗0

11、.5M NaOH/1M NaCl兩次，每次15分鐘轉(zhuǎn)移。 對于大分子蛋白質(zhì)，可采用下述三種方法之一： 解偶聯(lián)劑使凝膠解聚；蛋白酶作用；轉(zhuǎn)移緩沖液中加入SDS。整理ppt四. 標記探針的制備 1. 標記化合物的種類 1）放射性同位素標記物125I，3H，14C用于蛋白質(zhì)標記；32P，3H，35S用于核酸標記，其中32P和35S使用頻率高。32P標記核苷酸的位或位，35S則是標記核苷酸的位.整理ppt 2) 非放射性標記物 i. 生物素 分離自蛋黃的水溶性維生素，它可以和分離自蛋清中的一種堿性蛋白抗生物素蛋白牢固地結(jié)合。每個抗生物素蛋白可結(jié)合4個生物素分子。此外，鏈霉菌抗生蛋白與生物素結(jié)合更牢固，

12、可大大提高其靈敏度。 生物素可以經(jīng)過化學法與不同的化合物結(jié)合形成標記化合物。 ii. 半抗原 包括汞，2-乙酰胺二苯丙茂，地高辛配體和金屬銪。 地高辛配體是一種脂質(zhì)半抗原，可將其連在dUTP（脫氧尿三磷酸）上，然后用酶將其摻入新合成鏈中。檢測上述標記物的方法是利用二抗-酶偶聯(lián)物反應和顯色反應。整理ppt iii. 蛋白質(zhì)檢測標記物 i) 酶偶聯(lián)二抗（0.05ng） ii) 蛋白質(zhì)A（來自金黃色葡萄球菌）?？勺饔糜诖蠖鄶?shù)哺乳動物的IgG（免疫球蛋白），靈敏度較低（5ng） iii) 免疫金（immunogold） 0.1-0.5ng3) 兩類標記化合物的比較 i. 靈敏度 i ) 檢測蛋白質(zhì)，兩

13、種方法差不多。 ii) 檢測核酸，放射法比酶法敏感。 ii. 穩(wěn)定性 酶法探針可在4保存一年，放射性標記需每次制備。 iii. 安全性 非放射性標記安全。 iv. 效率 非放射性標記所需時間短。整理ppt2. 標記探針的制備方法 1）鏈標記法 2) 末端標記 3) 標記化合物的純化 整理ppt1）鏈標記法 i. 切口移位法 ds-DNA+DNase I+DNApol I+dNTP(32P-dCTP) ii. 隨機DNA引物延伸法 ds-DNAss-DNA-(6n,t)Klenow片段+dNTP(32P) iii. 反轉(zhuǎn)錄法 mRNA+dNTP(32P) cDNA（標記） iv. 轉(zhuǎn)錄法 含有待

14、標記DNA片段的重組質(zhì)粒+NTP(32P)RNA（標記） SP6聚合酶 v. 引物延伸法 含待標記DNA的單鏈DNA分子(M13mp系列)+引物(15-17n.t)+dNTP(32P)待標記DNA鏈 vi. T4 DNA聚合酶法 ds-DNAT4 DNA聚合酶, 無dNTP3-5外切酶活性加入dNTP和標記核苷酸新合成鏈（32P）整理ppt2) 末端標記 i. 5-末端標記 ss-和ds-DNA, RNA脫磷酸化反應 (CIP) T4DNA連接酶(-32P )ATP ii. 3-末端標記 i) TdT加尾反應，用于dsDNAii) 補齊反應 iii) T4 RNA連接酶反應 RNA-OH+*p

15、Np（3-5-二磷酸核苷）+ATPRNA-*pNPp+pA+ppi 3) 標記化合物的純化 i. 柱層析 利用Sephadex G-50，前峰-標記物，后峰-核苷酸 ii. 旋轉(zhuǎn)柱層析 快速，簡便, 可同時純化多個樣品。下一節(jié)整理ppt雙鏈DNA標記法一切口移位法 （Nick Translation）原理及過程：反應體系中DNA酶I隨機在探針DNA上打開缺口，然后利用DNA聚合酶I 5 3外切酶活性，在缺口處按5 3方向切除單核苷酸；在切除的同時DNA聚合酶I有5 3的聚合酶活性，在缺口處3端鏈接底物中的單核苷酸，彌補缺口處的核苷酸鏈。隨著反應的進行，缺口平移，并且底物中被標記的單核苷酸被隨機

16、摻入。DNA聚合酶I的兩種作用交替進行，探針即被標記。 Nick Translation返回整理ppt雙鏈DNA標記法二隨機引物法（6核苷酸引物標記法） 原理及過程：利用E.coli DNA聚合酶I的Klenow亞單位，合成含有標記核苷酸的DNA鏈。Klenow具有5 3聚合酶活性。被標記的DNA（探針）變性成單鏈，引物與模板結(jié)合。在Klenow的催化下，以引物3端為起點，沿模板3 5方向合成DNA新鏈。反應體系中含有標記的dNTP,隨機摻入新合成的DNA鏈中，探針即被標記。返回整理ppt 1. 核酸雜交步驟與結(jié)果檢測 1）預雜交： 預雜交液中常加入鮭魚精DNA，若標記探針是cDNA或RNA，

17、預雜交液中還需加入多聚A以阻止特異性結(jié)合, 42 4-6h或過夜。 2）雜交：探針100變性，迅速冷卻，加入預雜交液中，42一天五. 分子雜交與結(jié)果檢測3）洗滌：2SSC+0.1%SDS常溫洗滌兩次，1SSC+0.1%SDS 65洗滌兩次，每次15分鐘。若使用低聚核苷酸探針，洗滌溫度按下式計算： T=4GC+2AT * 高強度與低強度雜交：若具高度特異性同源序列，采用高強度雜交條件；若使低同源性DNA之間雜交，則采用低強度雜交條件。這兩種條件之差異表現(xiàn)在雜交液和洗滌液的離子強度以及雜交和洗滌時的溫度。整理ppt4）放射自顯影或顯色反應 使用放射性同位素標記物，采用放射自顯影。若采用非放射性同位

18、素標記物，則采用顯色反應。顯色反應將依據(jù)偶聯(lián)的酶類而定。主要有兩種酶： i. 辣根過氧化物酶: 可將3，3-二氨基苯胺氧化成褐色沉淀或?qū)?-氯萘酚氧化成紫色沉淀物。 ii. 堿性磷酸酶的作用底物是5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸，在酶作用下，該化合物可轉(zhuǎn)變?yōu)樘m色沉淀物，該反應中釋放的氫離子可將硝基蘭四唑還原成深紫色沉淀，這些沉淀物都是沉積在酶的作用位點。 iii. 兩種酶偶聯(lián)物的比較 i) 堿性磷酸酶的靈敏度比辣根過氧化物酶高10倍左右，但噪聲大。 ii) 堿性磷酸酶的顯色反應可持續(xù)幾個小時，其顯色結(jié)果可長期保存，但辣根過氧化物酶的顯色反應僅能持續(xù)30分鐘。 5) 雜交結(jié)果整理ppt2. 蛋白質(zhì)的

19、免疫分析 封閉劑，明膠，牛血清蛋白，卵清蛋白等。雜交結(jié)果示意圖整理ppt六、核酸分子雜交實驗因素的優(yōu)化探針的選擇 在大多數(shù)情況下，可以選擇克隆的DNA或cDNA雙鏈探針 在檢測單鏈靶序列時應選用與其互補的DNA單鏈探針或RNA探針 長的雙鏈DNA探針特異性較強，適宜檢測復雜的靶核苷酸序列和病原體，但不適宜于組織原位雜交 整理ppt探針的標記方法 選擇什么標記方法主要視個人的習慣和可利用條件而定； 但還應考慮實驗的要求，如靈敏度和顯示方法等 一般認為放射性探針比非放射性探針的靈敏度高 在對靈敏要求不高時，可采用保存時間長的生物素探針技術和比較穩(wěn)定的堿性磷酸酶顯示系統(tǒng) 六、核酸分子雜交實驗因素的優(yōu)

20、化整理ppt探針的濃度總的來說，隨探針濃度增加，雜交率也增加在較窄的范圍內(nèi)，隨探針濃度增加，敏感性增加膜雜交中32P標記探針與非放射性標記探針的用量分別為510ng/ml和251000ng/ml，而原位雜交中，無論應用何種標記探針，其用量均為0.55.0g/ml 受不同類型標記物的固相支持物的非特異結(jié)合特性的影響 六、核酸分子雜交實驗因素的優(yōu)化整理ppt雜交率 現(xiàn)代雜交實驗無論在液相雜交還是固相雜交均在探針過剩的條件下進行 在探針過量的條件下，雜交率主要依賴于探針長度（復雜度）和探針濃度。下面列出的公式適用于過剩單鏈探針對靶序列雜交的情形 t1/2=ln2/kct1/2半數(shù)探針與固定靶序列雜交所需的時間（s）k =形成雜交體的速率常數(shù)mol/(Lxntxs)決定于探針長度（L）、探針復雜度（N）、溫度、離子強度、粘度和pHc =溶液中的探針濃度（mol/L）六、核酸分子雜交實驗因素的優(yōu)化整理ppt雜交最適溫度 雜交技術最重要的因素之一 反應溫度低于Tm 1015，堿基順序高度同源的互補鏈可形成穩(wěn)定的雙鏈，錯配對減少。若反應溫度再低（Tm-30），雖然互補鏈之間也可形成穩(wěn)定的雙鏈，但互補堿基配對減少，錯配對增多、氫鍵結(jié)合的更弱 最適復性溫度（Optimunm renaturation temperature, T