微生物工程2.菌種及來源2h

1、第二章 微生物工程菌種第一節(jié)生產(chǎn)菌種來源第二節(jié)發(fā)酵工業(yè)常用微生物1第一節(jié) 生產(chǎn)菌種來源2微生物工程工業(yè)生產(chǎn)水平的三個決定要素: 生產(chǎn)菌種的性能發(fā)酵和提取工藝條件生產(chǎn)設(shè)備獲得優(yōu)良的生產(chǎn)菌種是實現(xiàn)高水平微生物工程工業(yè)生產(chǎn)的第一環(huán)節(jié)。3一、菌種分離與篩選工作程序 發(fā)酵工業(yè)上使用的微生物菌種，最初都是從自然界中分離篩選出來的。分離與篩選菌種的具體做法一般分4個步驟：樣品采集增殖培養(yǎng)純種分離生產(chǎn)性能測定4 調(diào)查研究（包括資料查閱）試驗方案設(shè)計 采樣第一次增殖培養(yǎng)第一次平板分離第二次增殖培養(yǎng)第二次平板分離增殖條件探索根據(jù)實際情況進(jìn)行定量或半定量測定第一次原種斜面第二次原種斜面初篩（1株1瓶）定量或半定量測

2、定篩 選 工 作 程 序5第三次平板分離第三次原種斜面復(fù)篩第四次平板分離不純第四次原種斜面再復(fù)篩種子培養(yǎng)初步工藝條件摸索較優(yōu)菌株1株3-5瓶保藏及進(jìn)一步做生產(chǎn)性能試驗或作為育種的出發(fā)菌株某些必要試驗和毒性試驗第三次菌種保藏6二、分離與篩選的設(shè)計要求在篩選所需菌株時應(yīng)考慮以下一些重要指標(biāo)：1、菌的營養(yǎng)特征一般要求采用廉價的培養(yǎng)基或使用來源豐富的原料2、菌的生長溫度3、菌的穩(wěn)定性4、菌的產(chǎn)物得率和產(chǎn)物在培養(yǎng)液中的濃度5、菌對所采用的設(shè)備和生產(chǎn)過程的適應(yīng)性6、容易從培養(yǎng)液中回收產(chǎn)物3-6是用來衡量菌種的生產(chǎn)性能，如能滿足這幾條，便有希望成為效益高的生產(chǎn)菌株7三、含微生物樣品的采集較復(fù)雜；應(yīng)根據(jù)分離目

3、的靈活掌握土壤（豐富、 5-25cm、土質(zhì)、酸堿度、植被狀況、地理條件、季節(jié)）食品 、海水、動物、植物、極端環(huán)境 根據(jù)微生物的營養(yǎng)類型采樣森林土中有相當(dāng)多枯枝落葉和腐爛的木頭，富含纖維素，適合利用纖維素作碳源的纖維素酶產(chǎn)生菌生長。肉類加工廠附近、飯店排污溝，易分離到蛋白酶和脂肪酶產(chǎn)生菌。面粉加工廠等場所易分離到產(chǎn)淀粉酶、糖化酶的菌根據(jù)微生物的生理特性采樣篩選高溫酶產(chǎn)生菌通常從溫泉、火山爆發(fā)處、堆肥等采樣；篩選產(chǎn)低溫酶的微生物，可從冰窖、南極、深海等采樣分離耐高滲透壓酵母菌，可到甜果、蜜餞、甘蔗渣堆積處采樣8樣品的預(yù)處理目的：提高分離效率方法： （表2-2含微生物材料的標(biāo)本預(yù)處理方法）物理方法：

4、熱處理；膜過濾法；離心法化學(xué)方法： 1%幾丁質(zhì)；碳酸鈣誘餌法： 石蠟；花粉；蛇皮；頭發(fā)9四、含微生物樣品的富集培養(yǎng)富集(enrichment)培養(yǎng) 是在目的微生物含量較少時，根據(jù)微生物的生理特點，設(shè)計一種選擇性培養(yǎng)基，創(chuàng)造有利的生長條件，使目的微生物在最適的環(huán)境下迅速地生長繁殖，數(shù)量增加，由原來自然條件下的劣勢種變成人工環(huán)境下的優(yōu)勢種，以利分離到所需的菌株。這種方法又被稱為施加選擇性壓力分離法。10 其要領(lǐng)是提供一些有利于所需菌株生長或不利于其他菌型生長的條件，例如，供給特殊的基質(zhì)或加入某些抑制劑?？刂蒲蹩蓪⒑醚跷⑸锖蛥捬跷⑸锓珠_；高溫下培養(yǎng)可將嗜熱微生物和非嗜熱微生物分開；控制pH可分離

5、嗜酸或嗜堿微生物；高糖或高鹽培養(yǎng)基可分離耐高滲透壓微生物；在分離培養(yǎng)中加入抗生素或某試劑可增加選擇性（表2-4）如： 分離真菌可在土豆培養(yǎng)基中加入鏈霉素； 分離細(xì)菌或放線菌可在培養(yǎng)基中加入制霉菌素等11 選擇性分離原理和技術(shù)生長條件的選擇與控制原理控制營養(yǎng)成分 控制培養(yǎng)基酸堿度 添加抑制劑 控制培養(yǎng)溫度 控制通氣條件 選擇性分離技術(shù)富集液體培養(yǎng)技術(shù)固體培養(yǎng)技術(shù)12A.富集液體培養(yǎng)增加混合菌群中所需菌株數(shù)量的一種技術(shù)技術(shù)特點：給混合菌群提供一些有利于目的菌株生長或不利于目的菌以外的其他菌型生長的條件培養(yǎng)方式分批培養(yǎng)方式：以最大比生長速率 （max）篩選，存在選擇壓力的控制、移種時間和次數(shù)等問題連

6、續(xù)培養(yǎng)方式：以比生長速率（ ）篩選 需注意，所需菌型生長的結(jié)果有時會改變培養(yǎng)基的性質(zhì)，從而改變選擇壓力。 重復(fù)移植幾次后接種少量已富集的培養(yǎng)物到固體培養(yǎng)基上。 移植時間是關(guān)鍵，應(yīng)在所需菌種確已占優(yōu)勢的情況下進(jìn)行。13 ABS0基質(zhì)濃度對A、B兩種菌的比生長速率（）的影響 當(dāng)SS0時，富集什么菌株？14連續(xù)富集培養(yǎng)技術(shù)分離菌株的優(yōu)點 分離的菌株特別適合連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)過程有利于分離具有某種工業(yè)生產(chǎn)特性的菌株可以篩選出能共生的穩(wěn)定混合培養(yǎng)物 15B. 固體培養(yǎng)技術(shù)常用于分離某些酶產(chǎn)生菌 選擇壓力：在選擇培養(yǎng)基中加入所需酶的基質(zhì) 16五、利用固體平板的生化反應(yīng)進(jìn)行分離 利用特殊的分離培養(yǎng)對大量混雜微生物

7、進(jìn)行初步分離的方法。 分離培養(yǎng)基是根據(jù)目的微生物特殊的生理特性或利用某些代謝產(chǎn)物生化反應(yīng)來設(shè)計的。 可顯著提高分離效率 透明圈法 變色圈法 生長圈法 抑菌圈法 171、透明圈法 分離水解酶產(chǎn)生菌時較多采用，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、核酸酶等； 在平板培養(yǎng)基中加入溶解性較差的底物，使培養(yǎng)基混濁； 能分解底物的微生物便會在菌落周圍產(chǎn)生透明圈，圈的大小初步反應(yīng)菌株利用底物的能力。18土壤經(jīng)巴氏消毒，以減少不產(chǎn)芽孢的微生物；然后鋪在pH8-9的瓊脂培養(yǎng)基（含有均勻的不溶性蛋白質(zhì)）表面；堿性蛋白酶產(chǎn)生菌能消化平板上的不溶性蛋白質(zhì)，產(chǎn)生一透明圈。例如用此法分離產(chǎn)生堿性蛋白酶的芽孢桿菌19 分離某種產(chǎn)生有機(jī)

8、酸的菌株時，也通常采用透明圈法初篩 在選擇培養(yǎng)基中加入碳酸鈣，使平板呈混濁狀，產(chǎn)酸菌能夠把菌落周圍的碳酸鈣水解，形成清晰的透明圈 透明圈的大小不能完全作為選擇高產(chǎn)菌的依據(jù)，因為在深層培養(yǎng)中的產(chǎn)酶單位與平板上圈的大小之間并不完全成正比。 但作為初篩的手段是有意義的202、變色圈法 對于一些不易產(chǎn)生透明圈產(chǎn)物的產(chǎn)生菌，可在底物平板中加入指示劑或顯色劑，使目的微生物菌落周圍呈現(xiàn)變色圈，從而能被快速鑒別出來。21 用含0.2%果膠為唯一碳源的培養(yǎng)基平板，對含微生物樣品進(jìn)行分離，待菌落長成后，加入0.2%剛果紅溶液染色4h，具有分解果膠能力的菌落周圍便會出現(xiàn)絳紅色水解圈。如： 篩選果膠酶產(chǎn)生菌甘油三丁酸

9、酯為底物羅丹明B為指示劑熒光圈又如：分離解脂微生物豆油作底物中性紅（紅黃. 6.88.0. ）指示菌落周圍呈紅色圈22233、生長圈法 通常用于分離篩選氨基酸、核苷酸和維生素的產(chǎn)生菌將待檢菌涂布于高濃度工具菌并缺少所需營養(yǎng)物的平板上進(jìn)行培養(yǎng)，若某菌株能合成平板所需的營養(yǎng)物，在該菌株的菌落周圍便會形成一個混濁的生長圈 工具菌（指示菌）是一些相對應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型菌株如：嘌呤營養(yǎng)缺陷型大腸桿菌與不含嘌呤的瓊脂混合倒平板，在其上涂布含菌樣品保溫培養(yǎng)，周圍出現(xiàn)生長圈的菌落即為嘌呤產(chǎn)生菌244、抑菌圈法 常用于抗生素產(chǎn)生菌的分離篩選 工具菌采用抗生素的敏感菌若被檢菌能分泌某些抑制菌生長的物質(zhì)，如抗生素等，便

10、會在該菌落周圍形成工具菌不能生長的抑菌圈2526六、隨機(jī)分離方法 有些微生物的產(chǎn)物對產(chǎn)生菌的篩選沒有任何選擇性好處，因此常隨機(jī)地分離所需菌種，為此發(fā)展了一些快速篩選方法并歸納出高產(chǎn)培養(yǎng)基成分的選擇準(zhǔn)則如下：1）制備一系列的培養(yǎng)基，其中有各種類型的養(yǎng)分成為生長限制因素。2）使用一聚合或復(fù)合形式的生長限制成分3）避免使用容易同化的碳（如葡萄糖）或氮（如NH4+），它們可能引起分解代謝阻遏。4）確定含有所需的輔因子（如Co2+、Mg2+、Mn2+、Fe2+）5）加入緩沖液以減少pH變化27七、一些生物活性物質(zhì)產(chǎn)生菌的分離 抗生素抗腫瘤藥物酶抑制劑生長因子等等281、抗生素產(chǎn)生菌的分離抑菌圈法、擴(kuò)散法

11、、生物自顯影法等試驗菌的選擇是關(guān)鍵（關(guān)系到靈敏度、活性、抗菌譜等）采用聯(lián)合試驗菌（枯草桿菌和綠色產(chǎn)色鏈霉菌或巴氏梭狀芽孢桿菌）分離到黃霉素采用專一性強(qiáng)的篩選技術(shù)也是檢出新抗生素的有效方法主要是利用抗生素作用機(jī)制相關(guān)的酶、酶抑制劑、激活劑等建立的篩選技術(shù)如棒酸（clavulanic acid）的發(fā)現(xiàn)：通過鑒定氨芐青霉素和待測樣品對-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生菌克雷氏菌的協(xié)同抑制作用292、抗腫瘤藥物產(chǎn)生菌的分離 臨床上有效的抗腫瘤藥物大多是直接作用于核酸或抑制核酸生物合成的物質(zhì) 大部分具有抗菌或抗真菌的活性 現(xiàn)發(fā)展出利用微生物篩選作用于DNA 的抗腫瘤藥物的方法，如生化誘導(dǎo)分析法30生化誘導(dǎo)分析法（Biolo

12、gical induction analysis; BIA）是采用測定溶源性噬菌體阻遏物支配下的啟動子控制的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的酶活性的方法。即將E.coli lacZ 連接在噬菌體的PL啟動子下當(dāng)DNA損傷時，誘發(fā)阻遏蛋白CI分解， PL啟動子啟動lacZ 基因轉(zhuǎn)錄，表達(dá)出-半乳糖苷酶。測定-半乳糖苷酶活性，可檢測能損傷DNA的抗腫瘤藥物的存在。 X-Gal （5-Bromo-4-chloro-3-indolyl -D-galactopyranoside; 5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷）作顯色底物； 反應(yīng)后呈藍(lán)色313、酶抑制劑產(chǎn)生菌的分離 某些酶與病理相關(guān) 如果某種化合物能在體外抑制某關(guān)

13、鍵的人體酶， 它就可能在體內(nèi)有藥理作用 選擇與生理和病理關(guān)系明確的酶作為靶酶 靶 區(qū) 靶 酶抗高血壓 血管緊張素轉(zhuǎn)移酶抗糖尿病 -淀粉酶、蔗糖酶等抗血脂癥 縮合酶抗組氨 組氨酸脫羧酶、組氨-N-甲基轉(zhuǎn)移酶324、生長因子產(chǎn)生菌的分離 通過觀察分離菌能否促進(jìn)營養(yǎng)缺陷型菌株的生長，來檢測生長因子產(chǎn)生菌。分離培養(yǎng)基上培養(yǎng)被殺死的菌落周圍有無檢測菌的生長圈影印到能支持生長因子產(chǎn)生菌生長的培養(yǎng)基上Uv照射殺死菌落鋪上一層含相應(yīng)生長因子缺陷型菌株33第二節(jié) 發(fā)酵工業(yè)中常用微生物34（一） 細(xì)菌351、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) 分布廣，常存在于枯草、土壤等，一般為腐生菌； 在醬油、

14、醬類和白酒制曲時，如果水分含量大，溫度較高，就容易造成枯草桿菌迅速繁殖；不僅消耗原料蛋白質(zhì)和淀粉，而且生成刺眼鼻的氨味，造成曲子發(fā)粘發(fā)臭，使制曲失敗。 能產(chǎn)生大量淀粉酶和蛋白酶 AS1.393 蛋白酶 BF7658 -淀粉酶362、大腸桿菌(Escherichia coli) 可利用大腸桿菌制取天冬氨酸、蘇氨酸、纈氨酸等 大腸桿菌的谷氨酸脫羧酶在工業(yè)上被用來進(jìn)行谷氨酸的定量分析 基因工程的很好材料373、乳酸桿菌(Lactobacillus sp.) 革蘭氏陽性，無芽孢，厭氧或兼性厭氧 可生產(chǎn)乳酸 干酪的成熟、乳脂的酸化和腌菜、泡菜制作384、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetob

15、utyleum) 芽孢卵形，中生或次端生，使芽孢囊膨大成梭狀或鼓槌形 專性厭氧 發(fā)酵生產(chǎn)丙酮丁醇395、腸膜狀明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides) G+、微需氧至兼性厭氧，生長需要纈氨酸和谷氨酸 在蔗糖液中形成特征性葡聚糖黏液（2025C促使形成） 可生產(chǎn)葡聚糖 使糖汁變粘而無法加工，為糖廠有害菌406、醋酸菌 (Acetobacter) 不形成芽孢，G，好氣性 分兩群：1）只將乙醇氧化成醋酸 2）將產(chǎn)生的醋酸繼續(xù)氧化成CO2和水 可生產(chǎn)醋酸 417、棒狀桿菌 (Corynebacterium) 以葡萄糖為原料發(fā)酵產(chǎn)生酸，是谷氨酸和其他氨基酸的高產(chǎn)菌 生產(chǎn)谷氨酸等 如

16、北京棒桿菌AS1.299鈍齒棒桿菌AS1.542428、短桿菌 (Brevibacterium) 氨基酸、核苷酸工業(yè)生產(chǎn)中常用的菌種，也是酶法合成生產(chǎn)輔酶A的菌種439、黃單胞菌(Xanthomonas) 細(xì)胞直桿狀，G，無芽孢，極生鞭毛 在含蔗糖的瓊脂平板上形成圓形、邊緣整齊、粘稠光滑的黃色菌落；液體培養(yǎng)形成黃色粘稠的膠狀物莢膜多糖，其黃色為一種水溶性色素 野油菜黃單胞菌(X. campestris) 可以淀粉生產(chǎn)黃原膠(Xanthan gum)4410、假單胞菌(Pseudomonas)能發(fā)酵生產(chǎn)維生素B12、丙氨酸、谷氨酸、葡萄糖酸、色素、果膠酶；也能進(jìn)行類固醇（甾體）轉(zhuǎn)化；有些菌株可利

17、用烴類生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白。45（二） 放線菌因其菌落呈放射狀而得名屬原核微生物類群，在自然界中分布很廣，尤其在有機(jī)質(zhì)豐富的微堿性土壤中較多。大多腐生，少數(shù)寄生。產(chǎn)生多種抗生素（12 000余種，60%左右來自放線菌），經(jīng)濟(jì)價值大461、鏈霉菌屬 ( Streptomyces )47灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus) 產(chǎn)鏈霉素金霉素鏈霉菌 (Streptomyces aureofaciens)在PDA培養(yǎng)基上生長時，基內(nèi)菌絲產(chǎn)生金黃色色素 產(chǎn)金霉素紅霉素鏈霉菌 (Streptomyces erythreus) 產(chǎn)紅霉素龜裂鏈霉菌 (Streptomyces rimosus)菌落灰

18、白色，表面后期有皺折，呈龜裂狀 產(chǎn)土霉素482、小單胞菌屬 (Micromonospora) 菌絲體長入培養(yǎng)基內(nèi)，不形成氣生菌絲，在基內(nèi)菌絲體上長出 孢子梗，其頂端生一個球形、橢圓形孢子。 菌落致密，與培養(yǎng)基緊密結(jié)合，表面凸起，疣狀；菌落常為橙黃色、紅色、深褐色、黑色和蘭色。 多種可產(chǎn)抗生素，如棘孢小單胞菌（M. echinospora）產(chǎn)慶大霉素493、游動放線菌屬（Actinoplanes） 一般不形成氣生菌絲，孢囊在基內(nèi)菌絲上形成，孢囊孢子在孢囊內(nèi)盤卷或呈直線排列；孢子球形，有時端生1-40根鞭毛，能運(yùn)動。 濟(jì)南游動放線菌 (Actinoplanes tsinanesis) 產(chǎn)創(chuàng)新霉素(

19、creatmycin; 1964)504、諾卡氏菌屬 (Norcadia) 一般無氣絲，基絲培養(yǎng)十幾小時形成橫隔，并斷裂成桿狀或球狀孢子。 菌落較小，邊緣多呈樹根毛狀。 生產(chǎn)利福霉素、蚊霉素 等。515、孢囊鏈霉菌屬 (Streptosporangium)孢子絲盤卷成球形孢囊，內(nèi)形成孢囊孢子，孢囊孢子無鞭毛產(chǎn)多霉素、創(chuàng)新霉素52（三） 酵 母 菌單細(xì)胞真核，主分布于含糖質(zhì)較多的偏酸性環(huán)境中，如水果、蔬菜、花蜜和植物葉子上，以及果園土壤中。531、啤酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)根據(jù)長與寬的比例，分三組：第一組 長寬比為12 細(xì)胞多為圓形、卵圓形； 主要供生產(chǎn)啤酒、

20、白酒和酒精及面包第二組 長寬比為2 多供生產(chǎn)葡萄酒、果酒用第三組 長寬比大于2 耐高滲透壓，供發(fā)酵甘蔗糖蜜生產(chǎn)酒精用54啤酒酵母在液體培養(yǎng)基中的生長行為有兩類：上面酵母發(fā)酵度較高，不易凝集沉淀，浮于上面下面酵母發(fā)酵度較低，易凝集沉淀55 啤酒酵母的應(yīng)用非常廣，常用于傳統(tǒng)的發(fā)酵行業(yè)，如啤酒、白酒、果酒、酒精、藥用酵母、面包制作，故又稱釀酒酵母。 近年來，利用啤酒酵母提取核酸、麥角固醇、細(xì)胞色素C、凝血質(zhì)和輔酶A等；生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白(SCP)可食用、藥用和作為飼料；它的轉(zhuǎn)化酶可用于轉(zhuǎn)化蔗糖，制造酒心巧克力。562、葡萄汁酵母 (Saccharomyces uvarum)與釀酒酵母相似，主要的區(qū)別在于

21、葡萄汁酵母能發(fā)酵棉子糖和蜜二糖 葡萄汁酵母常用于啤酒釀造的底層發(fā)酵，也可食用、藥用或作飼料。3、漢遜酵母 (Hansenula) 此屬酵母多能產(chǎn)生乙酸乙酯，從而增加產(chǎn)品的香味，可用于釀酒和食品工業(yè)。 但由于它能利用酒精作碳源，又能在飲料表面產(chǎn)生干皺的菌膜，所以又是酒精生產(chǎn)的有害菌。574、球擬酵母 (Toruiopsis) 此屬酵母有些種能產(chǎn)生不同比例的甘油、赤蘚糖、阿拉伯糖；有的能利用烴類生產(chǎn)蛋白質(zhì)。5、假絲酵母 (Candida) 能形成假絲，液體培養(yǎng)時能形成浮膜 可生產(chǎn)SCP、甘油、脂肪酶586、紅酵母 (Rhodotorula) 有明顯的紅色或黃色色素，很多種因生莢膜而形成粘質(zhì)狀菌落

22、可由菌體提取大量脂肪、-胡蘿卜素597、棉病針孢酵母(Nematspora gossypii) 又名棉病囊霉，能危害許多重要的經(jīng)濟(jì)作物，如棉花、柑橘、番茄等 該菌具有大量合成核黃素的能力，是核黃素生產(chǎn)的重要菌種608、畢赤氏酵母 ( Pichia ) 能利用石油或農(nóng)副產(chǎn)品及工業(yè)廢料產(chǎn)生菌體蛋白，有些菌株能生產(chǎn)麥角固醇、蘋果酸、磷酸甘露聚糖 近年來其在基因工程中的作用日益得到重視61（四） 霉 菌621、根霉(Rhizopus)米根霉 (Rhizopus oryzae) 淀粉酶活力極強(qiáng)，多作糖化酶使用；又由于具有較強(qiáng)的蛋白質(zhì)分解能力，也可用于制造腐乳。華根霉 (Rhizopus chinentis) 是釀酒所必須的重要霉菌，也是酸性蛋白酶和腐乳生產(chǎn)中的重要菌種。632、毛霉( Mucor )魯氏毛霉 ( Mucor rouxianus ) 從我國小曲中分離出來； 能糖化淀粉且能生成少量酒精； 能產(chǎn)生蛋白酶，有分解大豆蛋白的能力，常用來制作腐乳總狀毛霉 ( Mucor racemosus ) 是毛霉中分布最廣的一種，幾乎在各地土壤中、一些生霉的材