分析細菌的染色

1、分析細菌的染色1、學習微生物涂片、染色的基本技術，掌握細菌的簡單染色法。2、初步認識細菌的形態(tài)特征。3、學習細菌的革蘭氏染色原理和方法4 、了解細菌的特殊形態(tài)結構： 芽孢、莢膜、鞭毛的染色5、學習訓練無菌操作技術。實驗目的 簡單染色是利用單一染料對細菌進行染色的一種方法，適用于菌體一般形狀和細菌排列的觀察。 常用堿性染料進行簡單染色，因為在中性、堿性或弱酸性溶液中，細菌細胞通常帶負電荷，而堿性染料在電離時，其分子的染色部分帶正電荷，因此堿性染料的染色部分很容易與細菌結合使細菌著色，經染色后的細菌細胞與背景形成鮮明的對比，在顯微鏡下更易于識別。實驗原理1 細菌的簡單染色 常用作簡單染色的染料有：

2、美藍、結晶紫、堿性復紅等。 當細菌分解糖類產酸使培養(yǎng)基pH下降時，細菌所帶正電荷增加，此時可用伊紅、酸性復紅或剛果紅等酸性染料染色。實驗原理 (continued) 細菌細胞微小，透明，不易觀察，需染上顏色。利用單一染料對細菌進行染色，使經染色后的菌體與背景形成明顯的色差，從而能更清楚地觀察到其形態(tài)和結構。1、菌種枯草芽孢桿菌1218h培養(yǎng)物金黃色葡萄球菌24h培養(yǎng)物2、染色劑呂氏堿性美藍染液齊氏石碳酸復紅染液實驗材料 涂片干燥 固定染色水洗干燥鏡檢操作步驟 四、實驗步驟無菌操作菌懸液涂片干燥滴加無菌水固定取菌苔涂片操作步驟（continued） 1、涂片 取兩塊載玻片，各滴一小滴（或用接種環(huán)

3、沾?。┥睇}水（或無菌水）于玻片中央，用接種環(huán)以無菌操作分別從枯草桿菌和金黃色葡萄球菌斜面上挑取少許菌苔于水滴中，混合并涂成薄膜。 如用菌懸液或液體培養(yǎng)物，可用接種環(huán)挑取1-2環(huán)直接涂于載玻片上。 Notes: 1） 載玻片要潔凈無油跡 2）滴生理鹽水和取菌不宜過多 3）涂片要涂抹均勻，不宜過厚。操作步驟（continued） 3、固定固定的目的：1）使細胞質凝固，以固定細胞形態(tài)；2）并使菌體牢固地附著在載玻片上。固定方法：熱固定：涂面朝上，通過火焰數次注意：溫度不宜過高，以玻片背面不燙手為宜，否則會改變甚至破壞細胞形態(tài)操作步驟（continued） 2、干燥 室溫自然干燥4、染色 將玻片平放

4、于玻片擱架上，滴加染液于涂片上（染液剛好覆蓋涂片薄膜為宜）。 美藍染色1-2min；石碳酸復紅染色約1min。操作步驟（continued） 5、水洗倒去染液，用洗瓶（內裝自來水）輕輕沖洗，直至涂片上流下來的水無色為止；染色廢液收集在廢液缸中。Note: 水洗時，不要直接沖洗涂面，而應使水從載玻片的一端流下，水流不宜過急，以免涂片薄膜脫落。7、鏡檢 細菌個體微小，一般使用油鏡觀察細菌個體形態(tài)。操作步驟（continued） 6、干燥自然干燥或用電吹風吹干，也可用吸水紙吸干。7、鏡檢（continued）Notes: 必須等涂片完全干后才可滴加香柏油油鏡使用完畢，切記按規(guī)定步驟擦干凈，否則可能損

5、害鏡頭3）擦油鏡鏡頭方法：分三步 A）先用擦鏡紙揩去鏡頭上的香柏油 B）從雙層瓶的下層沾少許二甲苯滴在另一片擦鏡紙上 ，擦拭鏡頭； C）再用一小片擦鏡紙擦去鏡頭上可能殘留的二甲苯。操作步驟（continued） 2、革蘭氏染色單染色法：只能觀察微生物的大小、形狀、和細胞排列狀況，但不能鑒別微生物以及它的特殊構造等。復染色法：用兩種或兩種以上染色液進行染色，有協助鑒別微生物的作用，故也稱鑒別染色法。常用的有：革蘭氏染色法、抗酸染色法、芽孢染色法、莢膜染色法等。細菌細胞壁的結構G肽聚糖層較薄，交聯度低，含較多脂質，故用乙醇等有機溶劑脫色時溶解了類脂質，增加了細胞的通透性，使初染的結晶紫和碘的復合物

6、易于滲出，經沙黃復染呈紅色。G細胞壁結構致密，用乙醇脫色處理后，肽聚糖層孔徑縮小，通透性降低，故細菌仍保留初染時的紫色。革蘭氏染色的實驗原理細菌的特殊形態(tài)結構芽孢：休眠體，不利環(huán)境下產生，耐受各種極端環(huán)境。莢膜：多糖，包裹在菌體外圍，保護菌體鞭毛：運動，菌落形態(tài)。實驗材料大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌（24h培養(yǎng)物）、膠質芽胞桿菌革蘭氏染色液一套實驗步驟革蘭氏染色枯草桿菌的芽孢染色莢膜的染色繪圖、寫實驗報告革蘭氏染色的步驟1. 涂片2. 初染：在做好的涂面上滴加草酸銨結晶紫染液，染1分鐘，傾去染液，流水沖洗至無紫色。3. 媒染：先用新配的路哥氏碘液沖去殘水，而后用其覆蓋涂面1分鐘，后水

7、洗。4. 脫色：除去殘水后，滴加95%酒精進行脫色約1520秒，后立即用流水沖洗。5. 復染：滴加番紅染色液，染35分鐘，水洗后用吸水紙吸干。 6. 鏡檢：觀察染色結果并繪圖。Figure 1 - A Gram stain of Gram + Staphylococcus cells. Figure 2 - Gram stain of Gram E. coli cells3 枯草桿菌芽孢的染色1、制備菌液：加2-4滴蒸餾水于小試管中，用接種環(huán)從斜面挑取菌體2環(huán)于試管中充分混勻。2、加染色液：加孔雀綠3滴于小試管中。3、加熱：沸水浴，15-20分鐘。4、涂片：用接種環(huán)從小試管中取一環(huán)菌涂于一干凈載玻片上，制成涂片。5、干燥、火焰固定6、水洗：用水洗至流出的水中無綠色為止。7、復染：加復紅染色1-2分鐘。水洗，吸水紙吸干。、鏡檢：10 x ，40 x 、100X（油鏡）觀察。4細菌莢膜的染色莢膜負染色法： 1、制片：取潔凈的載玻片一塊，加一滴黑墨水，取少量的菌體放入墨水滴中混勻并涂片。 2、刮片：另取一載玻片，以三十度角將其邊緣浸入黑素中向右端拖動，將黑素涂成一薄層。 3、鏡檢：10 x ，40 x 物鏡觀察（注意物鏡不要接觸黑素，不要用油鏡觀察）實驗報告1、細菌簡單染色、革蘭氏染色的原理、方法和步驟。2 記錄所觀察到的染色結果，并繪圖2、思考題 1）制備細菌染色標本時應注意哪些環(huán)