流式細(xì)胞儀器的工作原理

1、第1章 儀器結(jié)構(gòu)和原理流式細(xì)胞技術(shù)是一種定量分析技術(shù)。定量測量在細(xì)胞生物學(xué)中之所以重要，是因為要想鑒別出一個細(xì)胞群體，主要是依據(jù)細(xì)胞特殊標(biāo)記物的數(shù)量，而不僅是依據(jù)標(biāo)記物的存在與否。多參數(shù)相關(guān)分析可以對細(xì)胞固有的性質(zhì)，例如光散射的測量與定量測定細(xì)胞的特征如外表受體、和DNA同時進(jìn)行。當(dāng)然，必要時還可同時再測定胞漿內(nèi)抗原、核內(nèi)抗原等等。這樣，就有可能從一個復(fù)雜的細(xì)胞混合體中，識別出某一個特定的細(xì)胞亞群。由于只有對大量的細(xì)胞進(jìn)行測量才能發(fā)現(xiàn)稀有的亞群并把它分選出來，所以快速測量是必需的。這里所謂分選即流式細(xì)胞分選術(shù)，是根據(jù)所測定的各種細(xì)胞性質(zhì)的不同組合，從細(xì)胞群體中將某個亞群分選出來，以對它進(jìn)行功能

2、研究、形態(tài)學(xué)研究、進(jìn)一步培養(yǎng)或做其它的分析。本公司是生產(chǎn)流式細(xì)胞儀的主要廠家，我們生產(chǎn)了一系列臺式和落地型的流式細(xì)胞儀，并研發(fā)生產(chǎn)了FCM所用的各種單克隆抗體和熒光試劑。臺式機(jī)FACScan、FACSort、 FACSCalibur等易于操作，穩(wěn)定性好，分析速度快，適合在臨床實驗室中應(yīng)用。落地型機(jī)器(如FACSAria、FACSVantage SE、FACSVantage Diva等) 具有快速分選功能，功能齊全，分析靈活，適合根底科學(xué)與生物醫(yī)學(xué)研究。我們此次主要介紹臺式機(jī)的結(jié)構(gòu)及其工作原理。2.1 流式細(xì)胞儀的工作原理流式細(xì)胞儀一般都包括液流系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng)和電子系統(tǒng)，某些機(jī)型還可選配分選系統(tǒng)

3、。待測樣本中的細(xì)胞經(jīng)液流系統(tǒng)傳送依序地通過流式細(xì)胞儀中激光照射的區(qū)域，細(xì)胞受激光的激發(fā)產(chǎn)生信號，被信號接收器接受并放大，這些放大了的信號經(jīng)計算機(jī)分析處理，并以圖表的形式直觀地顯示出來；通過分選系統(tǒng)還可以將某些類型的細(xì)胞群體篩選出來。流式細(xì)胞儀產(chǎn)生并分析的信號主要有光散射信號和熒光信號。光散射信號的強(qiáng)弱可以反映細(xì)胞的大小、形態(tài)及胞漿顆?；某潭鹊?。依熒光素的不同，用不同波長的光激發(fā)，發(fā)射出不同波長的熒光，可顯示不同的顏色，在不同的實驗體系中，這些熒光信號就可以反映不同的細(xì)胞生物學(xué)特性。將待測細(xì)胞染色后制成單細(xì)胞懸液。用一定壓力將待測樣品壓入流動室，不含細(xì)胞的平衡緩沖液在高壓下從鞘液管噴出，鞘液管

4、入口方向與待測樣品流成一定角度，這樣，鞘液就能夠包繞著樣品高速流動，組成一個圓形的流束，待測細(xì)胞在鞘液的包被下單行排列，依次通過激光照射區(qū) (液柱與入射的激光束垂直相交點(diǎn)稱為檢測區(qū))，被熒光染色的細(xì)胞受強(qiáng)烈的激光照射后發(fā)出各色熒光，同時產(chǎn)生光散射。熒光信號由與激光束垂直的90度方向通過光學(xué)系統(tǒng)透鏡、光欄、濾片和光檢測器等收集。熒光和側(cè)向角散射光檢測器是光電倍增管，前向角散射光檢測器是光電二極管。在前向小角2-10度進(jìn)行檢測的散射光信號稱為“前向角散射光。這種光散射信號反映了細(xì)胞的體積。細(xì)胞發(fā)出的熒光信號和光散射信號同時被90度角方向的熒光光電倍增管和前向光電二極管接收，被放大積分后轉(zhuǎn)換為電子信

5、號輸入多道1024道脈沖高度分析儀，并在計算機(jī)屏幕上，以一維直方圖、二維位圖、或三維圖形顯示出來?；?qū)D形和數(shù)據(jù)直接輸入聯(lián)機(jī)專用的計算機(jī)，或存入磁盤以備分析。計算機(jī)快速而精確地將所測數(shù)據(jù)計算出來，結(jié)合多參數(shù)分析，從而實現(xiàn)了細(xì)胞定量分析。2.2 液流系統(tǒng)液流系統(tǒng)的主要功能是將細(xì)胞依序送到測量區(qū)流動室接受檢測。2.2.1 流動室Flow Cell臺式機(jī)多采用密閉式液流系統(tǒng)，因此液流壓力與鞘液流流速皆為原廠預(yù)設(shè)，需要人為調(diào)整，故而操作簡單。加上儀器內(nèi)之激光光路亦為原廠預(yù)先調(diào)設(shè)，因此較適用于臨床檢驗與根底科研。流動室(Flow Cell)是儀器核心部件，由石英玻璃制成，被測樣品在此與激光相交。這種流動

6、室的光學(xué)特性良好，流速較慢，因而細(xì)胞受照時間長，可收集的細(xì)胞信號光通量大，配上廣角收集透鏡，可獲得很高的檢測靈敏度和測量精度。流動室是樣品與鞘液相互混合的小室參見圖例。流動室內(nèi)充滿鞘液，樣品試管中的細(xì)胞被一高于整個液流系統(tǒng)的壓力推入流動室中，與鞘液相混后，經(jīng)由流動室中心之微細(xì)水路向上游動，鞘液那么在此時包被水路，并藉由流體原理，使細(xì)胞能以單一細(xì)胞之形態(tài)，逐一流經(jīng)最窄的水路到達(dá)測量區(qū)，而與激光光交會。常使用的鞘液流為等張溶液如phosphate-buffered saline，假設(shè)配合特殊實驗可改用無菌的細(xì)胞培養(yǎng)液。2.2.2 控制樣品的流速實驗樣品的檢測速度可以通過改變樣品試管中的壓力來控制，

7、儀器面板中有三種預(yù)設(shè)樣品的流速；高速為每分鐘60微升，中速為每分鐘36微升，低速為每分鐘12微升。改變樣品的檢測速度會影響細(xì)胞向上游動的水路的直徑大小，同時影響實驗數(shù)據(jù)的變異系數(shù)。高速時水路的直徑大，受測細(xì)胞可偏離水路中軸，或左或右移動而增加變異系數(shù)。這一現(xiàn)象在某些要求低變異數(shù)的實驗中，需要防止，如做DNA分析時流速必須較低，控制在每秒兩百個細(xì)胞左右可到達(dá)較佳的結(jié)果；一般做淋巴細(xì)胞外表抗原分析時那么無流速限制，可以高達(dá)每秒上千個細(xì)胞，而無損儀器辨識力。2.3 光學(xué)系統(tǒng)儀器中含有一系列光學(xué)元件，包括激發(fā)光源、透鏡、光柵和濾片等，它們的主要功能是產(chǎn)生并收集熒光、光散射等信號。激光器激光根本沿著直線

8、傳播，發(fā)散角小，很容易聚焦到與細(xì)胞同一數(shù)量級。激光的亮度高，即在單位面積、單位立體角內(nèi)輸出功率特別大。激光還具有良好的單色性，這些特點(diǎn)使激光成為細(xì)胞儀光源的首選。FACSCalibur 根本配有一支波長488 nm 的氬離子激光器。氬離子激光器也是目前最常被使用在流式細(xì)胞儀中的光源。FACSCalibur可選配第二根氣冷式激光器，產(chǎn)生之635 nm波長之紅色光束，配合APC、TOTO-3、TO-PRO-3等紅光激發(fā)染料的使用見表一，可應(yīng)用于四色熒光之分析。用雙激光光源的儀器擴(kuò)大了其分辨的標(biāo)記信號范圍和種類。2.3.3 濾片流式細(xì)胞儀中所用的濾片有很多種，有帶通濾片、長通濾片、短通濾片等。長波通

9、濾片只允許某一波長以上的光線通過而將此波長以下的光線濾掉，如650nm 長波通濾片只允許PerCP發(fā)射的紅色熒光通過，而488nm的激發(fā)光及FITC發(fā)射的525nm綠光全部被阻。帶通濾片的應(yīng)用那么正好相反，它只允許某一特定波長的光線通過，例如一530 nm帶通濾片只允許FITC發(fā)射的530 nm綠色熒光通過，而其它波長的熒光全部被阻斷。FACSCalibur 根本配備有 (1) 帶通濾片：488/10, 530/30, 585/42 Bandpass 四色機(jī)型： 661/16。 (2) 長通濾片：650 Longpass (四色機(jī)型：670 LP) 。(3) 長波通二色性反射鏡：DM640 L

10、ongPass。 (4) 短波通二色性反射鏡：DM560 ShortPass。同時，測定側(cè)方散射光時，加用雙向分色濾片Dichromic 90/10 beam splitter。圖示FACSCalibur流式細(xì)胞儀中濾片的根本設(shè)置。2.4 電子系統(tǒng)電子系統(tǒng)主要有三個功能：(1) 將光學(xué)信號轉(zhuǎn)換成電子信號。 (2) 分析所輸出的電流信號，以脈沖高度、寬度、積分面積顯示。 (3) 量化信號并傳至計算機(jī)。光電探測器Photodetectors：光電探測器的用途是將光學(xué)信號轉(zhuǎn)換成電子信號。FACSCalibur細(xì)胞儀使用兩類探測器：硅晶光電二極管及光電倍增管PMT。光電二極管與光電倍增管各有其優(yōu)點(diǎn)，光

11、電倍增管在光線較弱時有很好的穩(wěn)定性，而當(dāng)光線很強(qiáng)時光電二極管就比光電倍增管穩(wěn)定，所以FACSCalibur在探測FSC時用光電二極管；在探測熒光與SSC時，由于光信號較FSC弱得多，所以探測器靈敏度是主要因素，必須使用光電倍增管。光電倍增管接收外來的光子信號并釋出光電子，利用磁場將光子撞擊到倍增電極上釋出電子，再撞擊到下一個倍增電極產(chǎn)生更多的電子，經(jīng)過這一連串的撞擊能放大并產(chǎn)生相當(dāng)多的電子，最后再以陽極收集最終所有的電子，并產(chǎn)生輸出電流信號。使用光電倍增管的優(yōu)點(diǎn)除了可提高光信號之外，真正信號與噪聲之比值也較高。2.4.2 信號的產(chǎn)生及處理光電二極管及光電倍增管所輸出的電流信號，經(jīng)由初步放大器p

12、re-amplifier轉(zhuǎn)換成電壓，再經(jīng)由主波放大器main pulse amplifier將所需之信號放大與處理參見圖。信號的放大可以使用線性linear或?qū)?shù)logarithmic兩種型態(tài)，一般前向及側(cè)向角散射光光的信號使用線狀放大，因為散射光變異范圍較??；而由于熒光信號變異范圍較大，所以多使用對數(shù)放大，唯一例外的是DNA分析時是使用線性放大，因為希望維持熒光信號與DNA含量的正比關(guān)系。2.5 散射光的測量在流式細(xì)胞儀中，從光的散射信號可以得到非常有價值的數(shù)據(jù)，因為細(xì)胞對光的散射是細(xì)胞在未遭受任何破壞情況下固有的特性，所以可以用散射光的信號對未染色的活細(xì)胞進(jìn)行分析。細(xì)胞在液流中通過測量區(qū)時

13、，經(jīng)激光照射，細(xì)胞向空間360 度角的所有方向發(fā)射光線，散射的信號與細(xì)胞的大小、形狀、質(zhì)膜、和細(xì)胞內(nèi)部的折射率有關(guān)。在流式細(xì)胞術(shù)中常用的有前向角散射光FSC和側(cè)向角散射光SSC，前者亦稱0度角散射，后者亦稱90度角散射。2.5.1 前向角散射光FSC前向角散射光亦稱小角散射或0度角散射。一般我們僅能說前向角散射光的強(qiáng)度與細(xì)胞的大小有關(guān)。對同一個細(xì)胞群體，散射光強(qiáng)的，其細(xì)胞大一些；而散射光弱的，其細(xì)胞小一些。究竟更準(zhǔn)確的關(guān)系是什么，因細(xì)胞不同、處理方法不同、固定方法不同，以致我們無法講出更精確的結(jié)論。甚至當(dāng)細(xì)胞是非球形的如雞紅血球、扁平狀的精子時，由于細(xì)胞在液流中空間取向的不同，也可導(dǎo)致對同型細(xì)

14、胞測得的前向角散射光信號完全不同，這是必須注意的。2.5.2 側(cè)向角散射光SSC 側(cè)向角散射光亦稱90度角散射或大角散射，收集到的是細(xì)胞通過測量區(qū)時側(cè)方向的散射光。側(cè)向角散射光的強(qiáng)度與有關(guān)細(xì)胞內(nèi)部的精細(xì)結(jié)構(gòu)和顆粒性質(zhì)有關(guān)。當(dāng)然，側(cè)向角散射光光也與細(xì)胞形狀、大小有關(guān)，但這不屬于側(cè)向角散射光獲取數(shù)據(jù)的主要方面。 以上所有的散射光與入射光波長一致，這是散射光與熒光的最大不同之點(diǎn)。散射光的探測器可以是硅光二極管，也可以是光電倍增管，前者多用于探測前向角散射光，后者用于探測側(cè)向角散射光光。在實際使用中，儀器首先是對光散射信號進(jìn)行測量。因為通過測量區(qū)的每個細(xì)胞不管它是否已被染色都能散射光線，所以光散射分析

15、與熒光探針聯(lián)合使用時，可鑒別出樣品中被染色的細(xì)胞和未染色的細(xì)胞，光散射測量最有效的用途，是從非均一的群體中鑒別出某些亞群。用前向角散射和側(cè)向角散射光雙參數(shù)測定，可從不加任何染料的小鼠全骨髓中鑒別出假設(shè)干個亞群。舉例而言，流式細(xì)胞儀可依據(jù)光散射信號將人白細(xì)胞分成三個亞群，淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞與粒細(xì)胞：淋巴細(xì)胞FSC與SSC都小，單核細(xì)胞FSC大與SSC中等，而粒細(xì)胞FSC與SSC都大。2.5.3 電壓閥值的設(shè)定 由于流式細(xì)胞儀的高敏感度，只要溶液中稍有雜質(zhì)就很容易產(chǎn)生一微小電壓信號，所以必須設(shè)定電壓閥值threshold voltage，所有進(jìn)入的信號必須高于此閥值才被接收為信號，操作者一般對前向

16、角散射光設(shè)定閥值，來排除雜質(zhì)或細(xì)胞碎片或體積變小的死細(xì)胞。2.5.4 線性測量和對數(shù)測量的選擇散射光測量時通常使用線性放大器，即放大器的輸出與輸入是線性關(guān)系，輸入增大1倍，輸出也增大1倍。線性放大器適用在較小范圍內(nèi)變化的信號以及代表生物學(xué)線性過程的信號。前向角散射光和DNA測量即屬于這一類。但測量中有時需要用對數(shù)放大器，它的輸出與輸入是對數(shù)關(guān)系。如果原來輸出為l，當(dāng)輸入增大到原來的10倍時，輸出是2；當(dāng)輸入又增大10倍時，輸出為3，等等。如側(cè)向角散射光光由于信號大小變化范圍較大，有時用對數(shù)放大器可能好一些。2.6 熒光測量當(dāng)一個物體受到光能激發(fā)后，物體中的電子到達(dá)高的能階激發(fā)狀態(tài)，當(dāng)它回復(fù)到原

17、有的狀態(tài)時，多余的能量就以光的形式輻射出來。這就是說當(dāng)一個物體吸收了紫外光或者短波光的能量，它能發(fā)射出比原來吸收的波長更長的光的特性，這種現(xiàn)象稱為熒光。2.6.1 熒光測量的意義 熒光信號可以反映不同的細(xì)胞生物學(xué)特性。如用熒光染料標(biāo)記的單克隆抗體特異性地與細(xì)胞外表的抗原、受體或膜糖蛋白結(jié)合，在激光的激發(fā)之下，發(fā)出一定波長的熒光。熒光信號的強(qiáng)度反映了膜抗原、受體或糖蛋白的相對數(shù)量，對熒光信號進(jìn)行收集分析，就可以實現(xiàn)對細(xì)胞亞群和功能等的分析。用DNA染料對DNA進(jìn)行染色，染料通過一定方式與DNA鏈接合，在激光的激發(fā)下，染料發(fā)出熒光，測定熒光的強(qiáng)度，就可得出相對DNA的含量，進(jìn)而可對細(xì)胞周期時相進(jìn)行

18、分析。用特定的熒光染料還可對細(xì)胞鈣離子濃度、細(xì)胞內(nèi)pH值以及細(xì)胞膜電位等進(jìn)行測定。2.6.2 熒光染料的選擇 選擇熒光染料的依據(jù)就是要了解儀器的光源系統(tǒng)，同時考慮染料的激發(fā)光譜。激發(fā)光波長應(yīng)盡可能接近熒光染料的激發(fā)光譜峰值。探測器的選擇 儀器在同時檢測多種熒光時，每個熒光檢測器只允許一種指定波長的熒光信號進(jìn)入而被檢測，因此使用者必須選用適當(dāng)?shù)臒晒庑盘柦邮掌鳎拍苁盏阶钫_的信號。選擇檢測器的依據(jù)就是要了解熒光染料的發(fā)射光譜。以三色FACSCalibur為例，如果熒光光譜峰值落在綠色范圍515-545 nm波長，選用第一熒光檢測器；如果光譜峰值落在橙紅色范圍564-606nm，選用第二熒光檢測器

19、；如果熒光光譜峰值落在深紅色范圍650nm，選用第三熒光檢測器。表一、常用熒光染料之光學(xué)特性測量參數(shù)熒光染料吸光波長(nm)熒光波長(nm)標(biāo)示抗體用染劑Fluorescein, FITC490520Phycoerythrin-R, PE480578Peridinin-chlorophyll, PerCP490677490680Cy-Chrome495670PE-Cyanine 5480670Allophycocyanine, APC650660APC-Cy7650770核酸含量分析Ethidium Bromide510595Propidium Iodide536617Acridine Ora

20、nge480 (+ DNA)450 (+ RNA)520650Thiazole Orange509533細(xì)胞存活率Propidium Iodide5366177-Amino Actinomycin D545647YOYO-1, YO-PRO-1491509Ethidium Monoazide493620TOTO-3, TO-PRO-3642661報導(dǎo)基因GFP S65A, S65C475506GFP S65L, S65T486510細(xì)胞膜電位DiO-C6(3)485525粒腺體膜電位Rhodamine 123485546細(xì)胞內(nèi)pH值BCECF-AM488Ratio 520/620SNARF1-

21、AM514Ratio 587/640細(xì)胞內(nèi)鈣濃度Fluo3-AM506528Calcium Green-1488530Fura Red488660H2O2 sensitiveDihydrorhodamine 123505534DCFH-DA505535O2- radical sensitiveHydroethidine518605Esterase sensitiveFluorescein -DA495525線性測量和對數(shù)測量的選擇 熒光測量常使用對數(shù)放大器。因為在免疫學(xué)的一個樣品中、可能有的細(xì)胞未被染色僅有自發(fā)熒光，為陰性群體；被染上色的細(xì)胞特異性熒光可能比自發(fā)熒光強(qiáng)數(shù)倍到數(shù)十倍，是為陽性群體；有時還會有一些被染色的細(xì)胞，其熒光比自發(fā)熒光強(qiáng)數(shù)百