生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)：2-GFP的基因克隆

1、一、 獲取外源基因（PCR）二、構(gòu)建重組DNA（T連接）三、重組DNA的轉(zhuǎn)化四、重組DNA的篩選（藍(lán)白斑）五、重組DNA的鑒定（酶切）實(shí)驗(yàn)思路PCR轉(zhuǎn)化篩選鑒定T連接一、獲取外源基因1.堿裂解法提取質(zhì)粒2.PCR擴(kuò)增目的基因GFP（一）儀器：恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、超凈工作臺(tái)、臺(tái)式離心機(jī)、高壓滅菌鍋（二）材料：含pEGFP-N1質(zhì)粒的大腸桿菌DH5（三）試劑： LB培養(yǎng)基（液體、固體）Bioteke質(zhì)粒提取試劑盒（北京百泰克，中國(guó)）溶液 S1 裂解液 S2中和液 S3 洗滌液W(去蛋白)洗脫液儀 器 材 料 基本原理 1、堿裂解法基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異；高堿性條件下，染色

2、體DNA和質(zhì)粒DNA變性；當(dāng)以高鹽緩沖液調(diào)節(jié)其pH值至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA復(fù)性并保存在溶液中，染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心形成沉定去除；50mmol/L 葡萄糖25mmol/L TrisCl(pH8.0)10 mmol/L EDTA (pH8.0)2 mg/mL溶菌酶作用：溶菌酶，水解細(xì)菌細(xì)胞壁EDTA,鰲合金屬離子使金屬酶失活葡萄糖，維持滲透壓注意：菌液一定懸浮均勻，不能有結(jié)塊溶液 SI 0.2 mol/ L NaOH1% SDS作用：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是穩(wěn)定的，加入S2，該系統(tǒng)pH值高達(dá)12.6，促使染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性。要溫和操作，避免

3、基因組DNA斷裂。該步驟可看到菌液逐漸變清亮。注意：時(shí)間勿太久，動(dòng)作要溫柔，輕輕顛倒幾次溶液 S2 5mol/L 乙酸鉀 60 ml冰乙酸 11.5ml水 28.5ml作用：調(diào)pH值到中性，使變性的質(zhì)粒DNA能夠復(fù)性，并能穩(wěn)定存在。而高鹽有利于變性的大分子染色體DNA,RNA,以及SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物凝聚而沉淀。該步驟會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀。注意：復(fù)性時(shí)間不宜過長(zhǎng)溶液 S3 2、離心層析柱基本原理 硅基質(zhì)膜在高鹽、低pH值狀態(tài)下選擇性地結(jié)合溶液中的質(zhì)粒DNA；去蛋白液和漂洗液將雜質(zhì)和其它細(xì)菌成分去除；低鹽，高pH值的洗脫緩沖液將純凈質(zhì)粒DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫；菌液離心13000rpm,1min棄上

4、清瞬時(shí)離心徹底棄上清加250l 溶液S1旋渦振蕩懸浮沉淀加250l 溶液S2加350l 溶液S3顛倒數(shù)次放置3-5min離心13000rpm,10min取上清600l加到吸附柱中離心13000rpm,1min棄濾液，加入600l洗滌液W113000rpm,1min離心（1）（2）（3）（4）（5）（6）（7）（8）（9）棄濾液，加入600l洗滌液W2（10）離心13000rpm,1min放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間加40l洗脫液離心13000rpm,1min（13）PCR擴(kuò)增 / -20保存?zhèn)溆貌僮鞑襟E 顛倒數(shù)次棄濾液（12）空柱離心13000rpm,2minPCR轉(zhuǎn)化篩選鑒定T連接

5、一、獲取外源基因（PCR）PCR反應(yīng)體系H2O 6l質(zhì)粒DNA（pEGFP-N1）2l引物GFP1 (10M)1l引物GFP2 (10M)1lPremix Taq10l總體積20l取0.2 ml PCR反應(yīng)管一支，用微量加樣槍按下述順序分別加入各試劑(注意每換一種試劑換一個(gè)新吸頭)： 如配好的反應(yīng)液較多沾到管壁上，可將PCR反應(yīng)管置離心機(jī)中瞬時(shí)離心，使反應(yīng)液集中于管底，然后將反應(yīng)管放到基因擴(kuò)增儀(PCR儀)上 .PCR轉(zhuǎn)化篩選鑒定T連接一、獲取外源基因（PCR）PCR參數(shù)設(shè)置 94預(yù)變性5分鐘后開始以下循環(huán) 94 30 秒 56 30 秒 30 循環(huán) 72 1 分鐘 72 7 分鐘 4 保溫實(shí)

6、驗(yàn)過程約1小時(shí)50分鐘PCR轉(zhuǎn)化篩選鑒定T連接一、獲取外源基因（PCR）瓊脂糖凝膠電泳凝膠準(zhǔn)備膠床準(zhǔn)備鋪膠靜置膠床置于電泳槽中加電泳緩沖液拔梳子上樣電泳取出凝膠拍照PCR轉(zhuǎn)化篩選鑒定T連接一、獲取外源基因（PCR）+-1234每組上1個(gè)樣品1. DL2000 DNA Marker（ 5 l ）2. PCR產(chǎn)物 （ 5 l ）瓊脂糖凝膠電泳操作瓊脂糖凝膠的制備上樣：每孔上一個(gè)樣品，加樣前，樣品先與6上樣緩沖液混勻(如預(yù)加有染料物質(zhì)，可省此步)電泳 ：電壓80120v；2030min結(jié)果觀察：凝膠成像儀 PCR轉(zhuǎn)化篩選鑒定T連接一、獲取外源基因（PCR）瓊脂糖凝膠電泳試劑說明Loading Buf

7、fer上樣緩沖液DL2000 DNA Marker組成： EDTA甘油 增大溶液密度 溴酚藍(lán)指示劑二甲苯胺藍(lán)指示劑0.5TBE, 0.5-1.4%濃度的膠中，遷移率為溴酚藍(lán)=300bp雙鏈線狀DNA二甲苯胺藍(lán)=4kbp雙鏈線狀DNATAKARA pMDTM18T Vector Cloning KitPCR轉(zhuǎn)化篩選鑒定T連接二、構(gòu)建重組DNA（T連接）連接反應(yīng)體系16反應(yīng)30分鐘實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組pMDTM18T Vector1 l1 lPCR擴(kuò)增產(chǎn)物1 lControl Insert DNA1 l超純水-ddH2O3 l3 lSolution I 5 l5 l總體積10 l10 lPCRT連接篩選鑒

8、定轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)流程：轉(zhuǎn)化三、重組DNA的轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌100 l連接產(chǎn)物10 l冰浴中30分鐘混勻42水浴 90秒冰浴1-2分鐘 涂板培養(yǎng)過夜勿動(dòng)加入800l LB培養(yǎng)液37振蕩培養(yǎng)45分鐘熱激感受態(tài)細(xì)菌的制備離心4000rpm，30秒棄500ul上清，余下部分混勻用于涂板第二天早上觀察結(jié)果，置于4冰箱PCRT連接篩選鑒定圖示轉(zhuǎn)化過程：轉(zhuǎn)化三、重組DNA的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)培養(yǎng)基感受態(tài)細(xì)胞100 l37培養(yǎng)45分鐘PCRT連接篩選鑒定涂板：取適量體積的轉(zhuǎn)化細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有適當(dāng)抗生素的LB固體平板上，用滅過菌的玻璃棒涂布均勻。室溫放置幾分鐘，倒置平皿37培養(yǎng)過夜。轉(zhuǎn)化三、重組DNA的轉(zhuǎn)化選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基成份

9、：Amp、X-gal、IPTG的LBPCRT連接篩選鑒定轉(zhuǎn)化三、重組DNA的轉(zhuǎn)化對(duì)照試驗(yàn)的設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)組連接對(duì)照組對(duì)照組對(duì)照組對(duì)照組DNAPCR產(chǎn)物/藍(lán)白T載體連接產(chǎn)物Control DNA/藍(lán)白T載體連接產(chǎn)物純質(zhì)粒DNA感受態(tài)細(xì)菌100l100l100l100l100l平板LB/Amp+/IPTG/X-galLB/Amp+/IPTG/X-galLB/Amp+/IPTG/X-galLB/Amp+LB/Amp-預(yù)期藍(lán)白斑藍(lán)白斑菌落多無菌落有菌落作用成功檢測(cè)T載體試劑檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率檢測(cè)抗生素活性及感受態(tài)有無污染檢測(cè)感受態(tài)活性PCRT連接篩選鑒定附：感受態(tài)細(xì)菌的制備（CaCl2法）轉(zhuǎn)化三、重組DNA的轉(zhuǎn)化

10、挑取一DH5單菌落于2.5ml LB培養(yǎng)液中37過夜培養(yǎng)取其中500 l菌液于一含50mlLB培養(yǎng)液的錐形瓶中，37振搖培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.3-0.4之間（旋轉(zhuǎn)搖床200300r/min，培養(yǎng)液調(diào)零，每隔2030min測(cè)量）取50ml菌液置于離心管內(nèi)，4 4500g離心5分鐘加入30ml ,100mM的冰冷CaCl2溶液，搖蕩重懸細(xì)胞，冰浴30分鐘4 4500g離心5分鐘收集細(xì)胞后，加2 ml ,100mM的冰冷CaCl2溶液輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置幾分鐘,即成感受態(tài)細(xì)胞懸液。感受態(tài)細(xì)胞分裝成100 l的小份，暫且不用的貯存于-70可保存半年。 取其中一份進(jìn)行轉(zhuǎn)化。PCRT連接篩選鑒定圖示

11、：感受態(tài)細(xì)菌的制備（CaCl2法）轉(zhuǎn)化三、重組DNA的轉(zhuǎn)化37振蕩培養(yǎng)過夜37振蕩培養(yǎng)至OD600=0.30.4分裝凍存PCRT連接轉(zhuǎn)化鑒定藍(lán)白斑篩選（ -互補(bǔ),IPTG/X-gal ）四、重組DNA的篩選（藍(lán)白斑）篩選PCRT連接轉(zhuǎn)化鑒定四、重組DNA的篩選（藍(lán)白斑）篩選-互補(bǔ)藍(lán)白篩選PCRT連接轉(zhuǎn)化鑒定四、重組DNA的篩選（藍(lán)白斑）篩選37振蕩培養(yǎng)過夜接種于4mlLB/Amp+培養(yǎng)液中挑單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)PCRT連接轉(zhuǎn)化篩選從擴(kuò)大培養(yǎng)的菌液中提取重組質(zhì)粒DNA，再進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切，瓊脂糖凝膠水平電泳，觀察結(jié)果。五、重組DNA的鑒定（酶切）鑒定PCRT連接轉(zhuǎn)化篩選五、重組DNA的鑒定（酶切）

12、鑒定12000rpm1 min菌體沉淀溶液S1250 l劇烈震蕩裂解液S2250 l顛倒混勻4-6次350 l溫和地顛倒混勻6-8次12000rpm10 min室溫靜置35min至出現(xiàn)白色絮狀沉淀取600 l上清至吸附柱管12000rpm30s12000rpm 30s10000rpm2 min取吸附柱至另一新EP管洗脫液50 l12000rpm1 min室溫靜置1min棄濾液空柱收集洗脫液備用棄濾液2. 懸浮細(xì)胞1. 收集細(xì)胞3. 裂解細(xì)胞4. 中和7. 洗脫5. 過柱分離中和液S3菌液質(zhì)粒DNA的提取棄濾液600 l 洗滌液W12000rpm 30s600 l 洗滌液WPCRT連接轉(zhuǎn)化篩選五

13、、重組DNA的鑒定（酶切）鑒定H2O6 l10 M 酶切緩沖液2 l 重組質(zhì)粒DNA 10 l (5001000ng)Hind III1 l EcoR I1 l 總體積20 l 在一個(gè)潔凈的離心管中混勻下列反應(yīng)物： 混合后37 水浴12h質(zhì)粒DNA的酶切分析操作PCRT連接轉(zhuǎn)化篩選五、重組DNA的鑒定（酶切）鑒定+-1234每組上2個(gè)樣品1. DL5000 DNA Marker( 5 l )2. 提取的重組質(zhì)粒DNA ( 5 l )3. 重組質(zhì)粒DNA酶切產(chǎn)物 ( 5 l )瓊脂糖凝膠電泳操作瓊脂糖凝膠的制備上樣：加樣前，樣品先與6上樣緩沖液混勻電泳 ：電壓80120v；2030min結(jié)果觀察

14、：凝膠成像儀 PCRT連接轉(zhuǎn)化篩選五、重組DNA的鑒定（酶切）鑒定瓊脂糖凝膠電泳試劑說明Loading Buffer上樣緩沖液DL5000 DNA Marker組成： EDTA甘油 增大溶液密度 溴酚藍(lán)指示劑二甲苯胺藍(lán)指示劑0.5TBE, 0.5-1.4%濃度的膠中，遷移率為溴酚藍(lán)=300bp雙鏈線狀DNA二甲苯胺藍(lán)=4kbp雙鏈線狀DNAPCRT連接轉(zhuǎn)化篩選五、重組DNA的鑒定（酶切）鑒定插入740bpDNA片段質(zhì)粒大小為:2692bp+740bp=3432bp酶切片段大小為 ?酶切位點(diǎn)酶切位點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果預(yù)期分析PCRT連接轉(zhuǎn)化篩選附：五、重組DNA的鑒定（酶切）鑒定質(zhì)粒DNA三種構(gòu)

15、型：1.共價(jià)閉環(huán)超螺旋2.線性3.開環(huán)的雙鏈環(huán)狀在瓊脂糖凝膠電泳中的遷移率：共價(jià)閉環(huán)超螺旋DNA線性DNA開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA1: DL5000 DNA marker28: pEGFP-N1PCRT連接轉(zhuǎn)化篩選附：瓊脂糖凝膠電泳方法五、重組DNA的鑒定（酶切）鑒定1. 凝膠準(zhǔn)備 稱2g瓊脂糖置三角瓶中，加0.5TBE 200ml ； 蓋上牛皮紙，用橡皮筋捆緊 微波爐加熱n次，直至融解，1min/次，中高溫（一般35次）；2. 膠床準(zhǔn)備 將梳子垂直插入到膠床的小凹槽內(nèi)，梳齒底端和床面有1mm的間隙； 將膠床放在調(diào)整好的水平臺(tái)上；鋪膠：將冷卻至60的凝膠加入20 l熒光染料(有 毒)倒入準(zhǔn)備好的膠

16、床內(nèi)，凝膠厚度約5 mm；PCRT連接轉(zhuǎn)化篩選五、重組DNA的鑒定（酶切）鑒定室溫下靜置凝膠固化。將帶凝膠的膠床置于電泳槽中，并使樣品孔位于電場(chǎng)負(fù)極；向電泳槽中加入0.5TBE電泳緩沖液，越過凝膠表面即可；輕輕拔出固定在凝膠中的梳子；樣品準(zhǔn)備：向核酸樣品中加入約為樣品體積1/6的6Loading Buffer，用加樣器輕輕混勻；上樣：用加樣器吸取樣品，輕輕的加入到凝膠的樣品孔中，加樣量為510 l ；蓋上電泳槽，接通電源，開始電泳； 電泳條件：電壓80120v，時(shí)間2030分鐘；電泳結(jié)束后，切斷電源，取出凝膠。電泳結(jié)果分析：紫外檢測(cè)儀直接觀察電泳條帶； 取出凝膠，置于凝膠成像儀中觀察結(jié)果。PCRT連接轉(zhuǎn)化篩選五、重組DNA的鑒定（酶切）鑒定膠濃度（）線性DNA分子大?。╧b）0.35600.61200.70.8100.90.571.20.461.50.242.00.13瓊脂糖凝膠濃度與DNA分子的有效分離范圍本次電泳使用1.0%瓊脂糖凝膠PCRT連接轉(zhuǎn)化篩選五、重組DNA