響應(yīng)面法優(yōu)化豆粕中大豆異黃酮的提取工藝設(shè)計(jì)研究

1、 PAGE7 / NUMPAGES7 響應(yīng)面法優(yōu)化豆粕中大豆異黃酮的提取工藝研究阮洪生，葛文中，秦學(xué)功，安紅波某八一農(nóng)墾大學(xué)生命科技學(xué)院 （某 163319）摘要：以豆粕為原料，以染料木素含量為指標(biāo)通過單因素實(shí)驗(yàn)初步得到提取工藝條件，再根據(jù)BoxBenhnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原則，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用3因素3水平的響應(yīng)面分析法，建立了大豆異黃酮含量與各影響因子的回歸方程，并得到以大豆異黃酮含量為響應(yīng)值的響應(yīng)面圖和等高線圖，進(jìn)而得出豆粕中大豆異黃酮的最佳提取工藝條件：溫度78.94、乙醇濃度59.28、乙醇用量為20.85：1、每次提取2h，提取2次。在此條件下，染料木素的理論提取量為1

2、2.03g/g。關(guān)鍵詞：響應(yīng)面法；大豆異黃酮；提取工藝大豆異黃酮是存在于大豆中的生物活性成分，主要來源于豆科植物的莢豆類，其含量最高為0.1%0.5%。目前發(fā)現(xiàn)的大豆異黃酮共有12種，分為游離型苷元和結(jié)合型糖苷兩類1，其藥效物質(zhì)為游離型的染料木素、大豆苷元和黃豆黃素?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，除具有抗氧化作用外，大豆異黃酮還可作為雌性激素治療的替代品，用于改善婦女更年期綜合癥，并具有降低血液膽固醇、防止骨質(zhì)疏松及抑制癌細(xì)胞生長的作用2。此外，大豆異黃酮還具有防止心血管疾病、抗菌等多種功能，已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等行業(yè)36。本實(shí)驗(yàn)立足于我國資源優(yōu)勢，采用脫脂后的豆粕為原料提取其中的大豆異黃酮成分，適應(yīng)

3、保健食品和醫(yī)藥工業(yè)的需要，為大豆的綜合利用開辟新的途徑。本實(shí)驗(yàn)采用脫脂后的豆粕為原料，乙醇水溶液為溶劑，染料木素的含量為指標(biāo)，根據(jù)影響有效成分提取因素，實(shí)驗(yàn)中采用響應(yīng)面分析法(ResponseSurface Analysis)進(jìn)行設(shè)計(jì)，該法利用多元二次回歸方程擬合因素與指標(biāo)之間的函數(shù)關(guān)系，通過對象迎面的等值線分析尋求最優(yōu)工藝參數(shù)。1材料與方法1.1 原料與試劑95%乙醇，某新春化工廠；豆粕，某吉慶豆業(yè)某；染料木素（含量測定用，純度大于99%），某思科華生物技術(shù)某；其他試劑均為分析純。1.2 儀器與設(shè)備TU1800紫外可見分光光度計(jì)(普析通用儀器某公司)、恒溫水溶鍋（某精密科學(xué)儀器某）、LD5A

4、離心機(jī)（某英泰儀器某）。1.3大豆異黃酮含量測定方法 參考文獻(xiàn)方法7采用染料木素為對照品的紫外分光光度法。在260nm處測得吸光度，以對照品微克x為橫坐標(biāo)，以測得的吸光度值y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，y=0.026+3.748x, r=0.9998。1.4單因素實(shí)驗(yàn)選取溫度、溶劑濃度、乙醇用量3個可能影響提取效果的因素做單因素實(shí)驗(yàn)，以確定相關(guān)因素及各因素的合適X圍。1.5響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇對大豆異黃酮提取效果有影響的因素，實(shí)驗(yàn)中采用響應(yīng)面分析法進(jìn)行設(shè)計(jì), 做溫度、溶劑濃度、乙醇用量的3因素3水平共17個實(shí)驗(yàn)點(diǎn)(5個中心點(diǎn))的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn),運(yùn)用SAS RSREG(Re

5、sponse surface regression)程序?qū)?7個實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)值進(jìn)行回歸分析?；痦?xiàng)目：某市科研課題豆粕中大豆異黃酮的提取與精制工藝研究（SGG2005-034）。作者簡介：阮洪生（1973-），男，碩士，講師，主要從事中藥學(xué)的教學(xué)和科研工作。2結(jié)果與分析2.1 單因素實(shí)驗(yàn)2.1.1最佳乙醇濃度的確定稱取5克豆粕，提取溫度80，乙醇用量201，提取2次，每次2h，分別以50%、60%、70%、80%、95%的乙醇濃度進(jìn)行提取，按照1.3含量測定條件測定其染料木素含量，結(jié)果見表1。表1 不同乙醇濃度的提取情況Table1 Effects of ethanol concentrati

6、on on the soysaponins of soybean residue乙醇濃度（）Ethanol concentration5060708095染料木素（g/g）6.3912.175.706.389.03從表1數(shù)據(jù)可以看出，隨著乙醇濃度的變化，染料木素的含量有一定的變化，但乙醇濃度60%時(shí)，染料木素的含量達(dá)到最高值，以60%乙醇提取較好。2.1.2最佳提取溫度的確定稱取5克豆粕，乙醇濃度60%，提取2次，每次2h，乙醇用量201，分別以提取溫度50、60、70、80、90進(jìn)行提取，按照1.3含量測定條件測定其染料木素含量，結(jié)果見表2。表2 不同溫度的提取情況Table 2 Effec

7、ts of tempreture on the soysaponins of soybean residue提取溫度（）tempreture5060708090染料木素（g/g）6.658.149.3911.699.74從表2數(shù)據(jù)可以看出，隨著提取溫度的變化，染料木素的含量也有變化，但提取溫度80時(shí)含量最高，故提取溫度確定為80。2.1.3最佳乙醇用量的確定稱取5豆粕，乙醇濃度60%，提取溫度80，分別以5：1、10：1、15：1、20：1、25：1進(jìn)行提取，提取2次，每次2h，按照1.3含量測定條件測定其染料木素含量，結(jié)果見表3。表3不同物料比的提取情況Table 3 Effects of

8、ratio on the soysaponins of soybean residue乙醇用量（w/v）Ratio1：51：101：151：201：25染料木素（g/g）6.599.0710.6511.819.74從表3數(shù)據(jù)可以看出，隨物料比的變化，染料木素的含量有所變化，但是物料比在1：20時(shí)，染料木素的含量最高，故物料比最終確定為1：20。2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)2.2.1 響應(yīng)面分析法分析因素的選取及實(shí)驗(yàn)結(jié)果本實(shí)驗(yàn)選擇溫度、溶劑濃度、乙醇用量3個因素，做了3因素3水平共17個實(shí)驗(yàn)點(diǎn)(5個中心點(diǎn))的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。表4為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表5。表4 提取工藝因素水平表Table 4 L

9、evel values of each factor水 平Level因 素乙醇濃度（%）ethanol concentration(x1)乙醇用量（ w/v）ethanol quantity(x2)提取溫度（）temperature(x3)-15015700602080170259017個實(shí)驗(yàn)點(diǎn)可分為兩類：其一是析因點(diǎn)，自變量取值在各因素所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，共有14個析因點(diǎn)；其二是零點(diǎn)，為區(qū)域的中心點(diǎn)，零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，用以估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差，以染料木素的提取率為響應(yīng)值，經(jīng)回歸擬合后，確定函數(shù)表達(dá)式。表5響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)方案與結(jié)果Table 5experiment designed and the re

10、sults實(shí)驗(yàn)號Numberx1x2x3R1（g/g）1-1-106.3366721-106.283333-1107.4300041106.040005-10-17.14667610-16.086677-1017.1900081016.5666790-1-16.786671001-110.19000110-116.37667120117.533331300011.720001400011.820001500011.883331600012.016671700012.296672.2.2模型的建立與顯著性檢驗(yàn)用Design Expert軟件，對表5中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，選擇對響應(yīng)值顯著的各項(xiàng)

11、，可得乙醇濃度、提取溫度()及乙醇用量（w/v）與大豆異黃酮的二次多項(xiàng)回歸方程：回歸方程為：Y=11.947334-0.390834X1+0.676249X2-0.317918X3-3.199500X12-0.334165X2*X1-2.225334X22+0.109168X3*X1-0.561668X3*X2-2.000332X32對回歸方程進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)、方差分析及各因素最佳點(diǎn)值分析，結(jié)果見表6、表7和表8。表6 回歸模型系數(shù)及其顯著性檢驗(yàn)表Table 6 Regression coefficient and significance test參數(shù)項(xiàng)parameter自由度DF回歸系數(shù)Co

12、efficient of regression標(biāo)準(zhǔn)誤差SEt值TvaluePrtIntercept111.9473340.31792037.58.0001X11-0.3908340.251337-1.560.1639X210.6762490.2513372.690.0311X31-0.3179180.251337-1.260.2464X1*X11-3.1995000.346445-9.24F顯著性Significance一次項(xiàng)35.6890790.05653.750.0680*二次項(xiàng)389.7334470.891059.19.0001*交互項(xiàng)31.7562170.01741.160.3908回

13、歸和997.1787430.964921.370.0003*失擬項(xiàng)33.3400001.110022.390.0058*純誤差40.2000000.0500誤差和73.5375490.505364注：*：P0.10；*：P0.05；*：P0.01；F0.01（9，7）=6.72。Note:*：P0.10；*：P0.05；*：PF0.01（9，7）=6.72，因此因變量與全體自變量之間的線性關(guān)系是高度顯著的，回歸方程的決定系數(shù)R2=0.9649,說明模型能解釋96.49%響應(yīng)值的變化，因而回歸方程的擬合程度很好。模型預(yù)測最大響應(yīng)值為12.035808。由SAS分析結(jié)果可算出各因素的最佳取值，如表

14、8。表8各因素最佳點(diǎn)值分析結(jié)果Table 8 analysis result of the different factor因素factor編碼Coding理論值（g/g）value乙醇濃度（%）-0.07178659.28214乙醇用量（倍）0.17063220.85316提取溫度（）-0.10538178.946192.2.3模型的驗(yàn)證 為了驗(yàn)證豆粕中大豆異黃酮提取模型方程的適用性，在最佳的溫度、乙醇濃度、物料比的實(shí)驗(yàn)水平上，重復(fù)實(shí)驗(yàn)5次。從實(shí)測值看出，模型預(yù)測值與實(shí)測值吻合極好。說明用此模型指導(dǎo)實(shí)踐應(yīng)具有非常好的效果。2.2.4 響應(yīng)因素水平的優(yōu)化由回歸方程所作的響應(yīng)曲面圖及其等高線圖，

15、見圖1-圖3。通過該組圖即可對任何兩因素交互影響豆粕中大豆異黃酮提取的效應(yīng)進(jìn)行分析與評價(jià)，并從中確定最佳因素水平X圍。圖1圖1乙醇用量與乙醇濃度對大豆異黃酮得率影響的響應(yīng)面及等高線圖Figure 1.Three-dimensional plot and corresponding contour plot of Soybean isoflavones yield at ratio of solvent to material and ethanol concentration圖2圖2提取溫度與乙醇濃度對大豆異黃酮得率影響的響應(yīng)面及等高線圖Figure 2.Three-dimensional p

16、lot and corresponding contour plot of Soybean isoflavones yield at extraction temperature and ethanol concentration圖3圖3提取溫度與乙醇用量對大豆異黃酮得率影響的響應(yīng)面及等高線圖Figure 3.Three-dimensional plot and corresponding contour plot of Soybean isoflavones yield at extraction temperature and ratio of solvent to material3 小

17、結(jié)實(shí)驗(yàn)中以染料木素含量為指標(biāo)，將響應(yīng)面分析法應(yīng)用于豆粕中大豆異黃酮的提取工藝上，通過對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析比較，確定最佳工藝條件為：乙醇濃度為59.28%、提取溫度78.94、物料比20.85（w/v），在此條件下大豆異黃酮的理論含量可達(dá)12.03（g/g）。由此可見，利用乙醇提取豆粕中大豆異黃酮是一個比較理想的方法，同時(shí)實(shí)踐也證明采用響應(yīng)面分析法對豆粕中大豆異黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化是非常有效的。參考文獻(xiàn)1 X洪斌.大豆生物活性物質(zhì)的開發(fā)與應(yīng)用M.：中國輕工業(yè)，2001.2 Song T T， Gendirch S，Murphy P A. Estrogenic activity of glycite

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20、echnology College, HLJ August First Land Reclamation University , (Da Qing 163319)Abstract：Using soybean residue as a raw material.The craft was searched with the concentrate of Genistein by single factor tests primarily,then according to the Box-Benhnken center united experimental design principles based on the single factor tests,the method of