基因工程的基本操作步驟PPT通用課件[通用]

1、1、基因工程包括哪些步驟？3、基因工程中的核心環(huán)節(jié)是哪一步？4、基因表達(dá)載體導(dǎo)入到受體細(xì)胞有哪些方法？5、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞就會成功表達(dá)嗎？ 如何檢測和鑒定？2、什么是目的基因？獲取的方法有哪些方法？ 思考討論問題：基因工程的基本操作程序一、目的基因的獲取二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞四、目的基因的檢測與鑒定 主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因(一）目的基因 目前被廣泛提取使用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲基因、植物抗病基因（抗病毒、抗細(xì)菌)、人胰島素基因等。一、目的基因的獲?。ǘ┇@取目的基因的方法1、從基因文庫中直接獲取2、PCR技術(shù)擴(kuò)增3、化學(xué)方法直接人工合成1、從基因文庫中直接

2、獲?。?）基因文庫的概念部分基因文庫： 基因組DNA文庫： 將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫含有一種生物的全部基因只包含了一種生物的部分基因，如:cDNA文庫（2）基因文庫的建立方法提取某種生物的全部DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼该盖幸欢ù笮〉腄NA片段將DNA片段與運(yùn)載體連接導(dǎo)入受體菌中儲存基因組文庫方法一：直接分離法某種生物的單鏈mRNA單鏈互補(bǔ)DNA雙鏈cDNA片段導(dǎo)入受體菌中儲存與運(yùn)載體連接cDNA文庫反（逆）轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶方法二：反轉(zhuǎn)錄法-cDNA的合成流程圖解PCR技術(shù)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR擴(kuò)增儀DNA半保留復(fù)

3、制的基本原理一段已知目的基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸一對引物熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶）模板DNA2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因原理：前提：條件：利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因53GG TC35 AGCC53引物GG高溫變性低溫退火中溫延伸1.目的基因DNA受熱變性，解鏈；53 AG 引物2.引物與單鏈互補(bǔ)結(jié)合；3.合成鏈在DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸。蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列目的基因推測推測化學(xué)合成3、人工合成 核心二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建功能：使目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞并有效表達(dá)，而且要能穩(wěn)定存在且遺傳給后代。基因表達(dá)載體的構(gòu)建 1）用一定的限制酶切割質(zhì)粒，使其出

4、現(xiàn)一個切口，露出黏性末端。 2）用同一種限制酶切斷目的基因，使其產(chǎn)生相同的黏性末端。 3）將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的切口處，再加入適量DNA連接酶，形成了一個重組DNA分子（重組質(zhì)粒） 目的基因與運(yùn)載體的結(jié)合過程，實(shí)際上是不同來源的基因重組的過程。編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)啟動子 啟動子：位于基因首端一段能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列。沒有啟動子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。 RNA聚合酶:能夠識別啟動子上的結(jié)合位點(diǎn)并與其結(jié)合的一種蛋白質(zhì). 終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，它能阻礙RNA聚合酶的移動，并使其從DNA模板鏈上脫離下來，使轉(zhuǎn)錄終止。終止子編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)啟動

5、子終止子A G G T C A C G T C GT C C A G T G C A G CRNA聚合酶A G G U C A C G U C G基因表達(dá)載體的組成：b、目的基因a、啟動子c、終止子d、標(biāo)記基因e、復(fù)制原點(diǎn)1、下列屬于獲取目的基因的方法的是 利用mRNA反轉(zhuǎn)錄形成 從基因組文庫中提取 從受體細(xì)胞中提取 利用PCR技術(shù) 利用DNA轉(zhuǎn)錄 人工合成 A. B. C. D.小試牛刀2、1997年，科學(xué)家將動物體內(nèi)的能夠合成胰島素的基因與大腸桿菌的DNA分子重組，并且在大腸桿菌中表達(dá)成功。請據(jù)右下圖回答問題。(1)此圖表示的是采取_合成基因的方法獲取_基因的過程。(2) 圖中DNA是以為

6、_ _ 模板，形成單鏈DNA，在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得了所需要的目的基因。人工 目的 控制胰島素合成的信使RNA 小試牛刀(3) 圖中代表 ，它往往含 基因，以便對目的基因的檢測。重組DNA分子 標(biāo)記 常用的受體細(xì)胞： 有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動植物細(xì)胞等。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的原理借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。三、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法1、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法2、基因槍法3、花粉管通道法土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法示意圖將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞的方法顯微注射法將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞方法宿主細(xì)胞（大腸桿菌）感受態(tài)細(xì)胞（大腸桿菌）Ca2+四、目的基因的檢測與

7、鑒定首先：其次：最后：還要：要檢測轉(zhuǎn)基因生物的DNA上是否插入目的基因DNA分子雜交技術(shù) 分子探針檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA檢測目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)個體生物學(xué)水平的鑒定 不能，受體細(xì)胞必須表現(xiàn)出特定的性狀，才能說明目的基因完成了表達(dá)。 受體細(xì)胞攝入DNA分子后就說明目的基因完成了表達(dá)嗎？若不能表達(dá)，要對抗蟲基因再進(jìn)行修飾。多細(xì)胞生物的檢測，將每個受體細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)并誘導(dǎo)發(fā)育成完整個體，檢測這些個體是否攝入目的基因，攝入的基因是否表達(dá)（是否表現(xiàn)出相應(yīng)的性狀）。淘汰無變化的個體，保留有相應(yīng)變化的個體進(jìn)一步培養(yǎng)、研究。例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達(dá)。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表