生物制藥工藝學(xué)實驗課件3 超濾法分離溶菌酶和鹽析濃縮溶菌酶

1、蛋清中提取溶菌酶實驗三 超濾法分離溶菌酶和鹽析濃縮溶菌酶實驗?zāi)康恼莆粘瑸V分離技術(shù)的原理和操作；掌握鹽析的原理和操作。實驗流程超濾法進(jìn)一步分離溶菌酶透過液鹽析法沉淀溶菌酶透析法除鹽實驗材料溶液：0.5M NaOH溶液透析緩沖液：0.1M磷酸鈉緩沖液（pH7.0）其他材料：透析袋（800010000Da），超濾膜（30kD），固體硫酸銨，研缽，搗杵等。實驗原理超濾分離技術(shù)原理：它是一種膜分離技術(shù)，它的特點是使用不對稱多孔膜，根據(jù)分子的大小來分離溶液中的大分子物質(zhì)與小分子物質(zhì)。它是一種流體切向流動和壓力驅(qū)動的過濾過程。2、分離方式：切向流過濾切向流過濾：溶液沿與超濾膜平行的方向流動，可避免濃差極化，

2、提高超濾速度。 封頭過濾：溶液流動方向與過濾方向一致，隨著過濾的進(jìn)行，膜表面形成的濾餅層厚度逐漸增大，流速逐漸降低。3、超濾分離過程示意圖4、選擇超濾膜截留分子量：阻留率達(dá)90%以上的最小被截留物質(zhì)的分子量。膜的材質(zhì)：非特異性吸附低，耐酸堿性好。 Hydrosart膜：纖維素衍生膜，對蛋白質(zhì)非特異性吸附低，在pH2-14酸堿度范圍內(nèi)使用，可以用1N NaOH 清洗再生多次，流量恢復(fù)率高。 5、超濾的基本流程選擇合適的膜包（考察膜的截留分子量等）；將膜包固定在夾具中（不超過膜的耐受壓力）；選擇合適的切向流速率（不超過膜包的最大允許背壓）；超濾結(jié)束后要沖洗膜包；觀察回流液速率，確定是否預(yù)過濾溶液。

3、觀察水透過通量，適時清洗膜包；膜包需保存在含防腐劑的溶液中。鹽析沉淀蛋白質(zhì)原理：大量鹽離子自身的水合作用降低了自由水的濃度，使蛋白質(zhì)分子周圍的水化膜層減弱乃至消失，蛋白質(zhì)相互聚集而沉淀。大量的鹽離子能夠中和蛋白質(zhì)表面的電荷，使蛋白質(zhì)之間的靜電斥力降低，導(dǎo)致蛋白質(zhì)相互聚集而沉淀。由于蛋白質(zhì)分子的水化膜被破壞，暴露出其疏水區(qū)域，蛋白質(zhì)的疏水區(qū)域越多，越易沉淀。2、優(yōu)點：較少引起蛋白質(zhì)變性；3、缺點：在鹽析過程中，易產(chǎn)生共沉現(xiàn)象，故分辨率不高；鹽析后需進(jìn)行脫鹽步驟。4、注意事項：蛋白質(zhì)濃度可適當(dāng)降低，以減少共沉；pH值一般選擇在蛋白質(zhì)的等電點附近，鹽析效率高；在高鹽下，蛋白質(zhì)的溶解度一般隨溫度的升高

4、而降低，因此，通常鹽析在室溫下進(jìn)行鹽析。透析除鹽1、原理：在常壓下，依靠小分子物質(zhì)的擴(kuò)散運動將兩類分子量差別較大的物質(zhì)分離開來。2、注意事項透析袋要留一定空間，以防透析袋脹裂，和因透析袋膨脹引起膜孔徑的變化；透析裝置常加上攪拌系統(tǒng)，并定期或連續(xù)更換新鮮的溶劑，以提高透析效率。3、透析袋：一般是再生纖維素，具有親水性、惰性和良好的物理性能，可再生。4、透析袋的預(yù)處理：50乙醇煮沸1h，再分別用50乙醇、0.01mol/L NaHCO3 和0.001mol/L EDTA溶液依次洗滌，最后用蒸餾水浸洗，存放與70乙醇溶液中。透析示意圖實驗步驟超濾分離（四組同學(xué)的溶菌酶洗脫液合并超濾）：將溶菌酶洗脫液

5、以合適的流速經(jīng)過超濾膜（進(jìn)口壓力不超過 2.0bar ），收集透過液，回流液（吸取 200L于dorf管中，標(biāo)記為“6”），當(dāng)透過液與回流液體積比約為3:1時，超濾可結(jié)束。超濾結(jié)束后，需要用50mM 磷酸緩沖液沖洗膜包；當(dāng)透過液與回流液體積比約為1:1時，沖洗即可結(jié)束。 如果透過液流速減慢，需要用0.5M NaOH溶液清洗膜包，然后再用蒸餾水將堿液沖洗干凈。2、鹽析：在透過液中加入研細(xì)的固體硫酸銨粉末（邊攪拌邊加入），硫酸銨的終濃度為35（即100mL 溶液中 35g 硫酸銨），室溫下靜置約2030min，4度、10000rpm、20min。3、透析除鹽：取少量 0.1M 磷酸鈉緩沖液（pH7.0）溶解沉淀，裝入透析袋中，置于適量的0.1M 磷酸鈉緩沖液室溫下攪拌透析過夜，次