產(chǎn)酶微生物的分離與應(yīng)用

1、產(chǎn)酶微生物的分離與應(yīng)用 摘要：介紹了環(huán)境中產(chǎn)酶微生物尤其是產(chǎn)纖維素酶和漆酶的真菌和細(xì)菌種類，并將產(chǎn)酶細(xì)菌和真菌的做了對比，闡述了從環(huán)境中分離產(chǎn)酶微生物的方法及菌株和產(chǎn)物的鑒定方法。以及特別羅列了纖維素酶在制漿造紙、飼料工業(yè)、污水治理、紡織洗滌、食品和堆肥等領(lǐng)域的應(yīng)用情況。最后，展望了酶的應(yīng)用領(lǐng)域和未來研究方向。 關(guān)鍵詞：產(chǎn)纖維素酶微生物；纖維素酶；菌株分離；菌株鑒定；酶活測定；纖維素酶應(yīng)用領(lǐng)域Separation and application of enzyme producing microorganismsYang Feng-ping(College of life science, N

2、anjing Normal University) Abstract:This paper introduces the enzyme producing microorganism in the environment especially species of fungi and bacteria producing cellulase and laccase, and the enzyme producing bacteria and fungi were compared, expounds the method of isolation and identification meth

3、ods of enzyme producing microflora and strains from the environment and product. And special lists the application of cellulase in pulping and papermaking, feed industry, sewage treatment, textile washing, food and compost etc. Finally, prospects of the field of enzyme and future research. Keywords:

4、cellulase producing microorganisms;cellulase;Strains isolated;strain identificatio- n;enzyme activity determination;cellulase application field自然界中蘊(yùn)藏著巨大的微生物資源，它們散布于整個地球的各個角落，而且在不同的環(huán)境下生存的微生物都有其完全不同的代謝方式，能分解利用不同的底物。這一特征就為微生物酶品種的多樣性提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。特別是當(dāng)基因工程介入時，動植物細(xì)胞中存在的酶，幾乎都能夠利用微生物細(xì)胞獲得。因此，有計(jì)劃和仔細(xì)地篩選微生物菌種，通常可以獲得能

5、夠生產(chǎn)幾乎任何一種酶的適當(dāng)菌株。土壤和海水這兩大類資源寶庫的開發(fā)具有重要意義。我們可以從土壤、腐木篩選相應(yīng)的產(chǎn)酶微生物，從污水中篩選各種能夠產(chǎn)生分解糖類、脂類、蛋白質(zhì)、纖維素、木質(zhì)素、環(huán)烴、芳香物質(zhì)、有機(jī)磷農(nóng)藥、氰化物及某些人工合成的聚合物酶的微生物1。在極端環(huán)境可篩選嗜熱微生物、嗜堿微生物、嗜鹽微生物、嗜酸微生物、耐高壓微生物等，并開發(fā)極端微生物酶品種。進(jìn)入21世紀(jì)以來，各國已在生物產(chǎn)業(yè)研究中投入了巨大的財(cái)力和科研力量。隨著能源、資源和環(huán)境問題的日趨嚴(yán)重， 生物資源利用已被全球廣泛重視，成為世界各國的戰(zhàn)略性研究重點(diǎn)。在自然界中， 纖維素類物質(zhì)是最廉價(jià)、最豐富的一類可再生資源，是人類社會賴以生

6、存的基本物質(zhì)來源。全世界植物體生成量每年高達(dá)1 500億t干物質(zhì)，其中有50%以上為纖維素和半纖維素2。采用生物酶催化技術(shù)可將農(nóng)作物、樹木和其他植物及其殘?bào)w、畜禽糞便、有機(jī)廢棄物等生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為工業(yè)原料，達(dá)到合理、可循環(huán)利用自然生物資源的目的。擔(dān)子菌亞門( Basidiomycotina)、層菌綱(Hymenomycetes)、半知菌亞門(Deuteromycotina)、絲孢綱(Hyphomycets)和子囊菌亞門(Ascomycotina)的部分真菌都具有很強(qiáng)的產(chǎn)生纖維素酶和漆酶的能力，備受生化工業(yè)領(lǐng)域的關(guān)注。其中，白腐菌、褐腐菌和軟腐菌是自然界中降解木材的主要真菌3。在過去的30多年里，有

7、關(guān)白腐菌的研究主要集中在木素降解酶系方面；有關(guān)軟腐菌的研究則集中在纖維素降解酶系方面；而有關(guān)褐腐菌的研究主要集中在降解木質(zhì)纖維素機(jī)制方面。其中，研究最多的為黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium )及其所產(chǎn)生的木素過氧化物酶( Lignin peroxidase， 簡稱LiP)和錳過氧化(Mn-dependent peroxidase，簡稱MnP)及漆酶對芳香化合物的降解能力4。纖維素酶在食品、飼料、醫(yī)藥、紡織、洗滌劑和造紙等眾多工業(yè)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。按照酶的作用特性可將纖維素酶分為堿性纖維素酶和酸性纖維素酶2大類5。目前，很多能夠產(chǎn)生纖維素酶和漆酶的生物

8、資源尚未得到充分的開發(fā)和利用，鑒于此，筆者簡述了自然界中的產(chǎn)酶微生物及其應(yīng)用領(lǐng)域。1產(chǎn)酶微生物1.1 產(chǎn)酶真菌 擔(dān)子菌、子囊菌和半知菌是產(chǎn)生纖維素酶和漆酶的主要菌種，雖然不同菌種產(chǎn)生的酶和作用底物具有差異， 使用目的也不同，但其所產(chǎn)酶服務(wù)人類的目的是相同的，即提高自然界現(xiàn)有資源的利用率。目前，已研究過的產(chǎn)酶微生物有6：1.1.11 擔(dān)子菌黃孢原毛平革菌、彩絨革蓋菌 、毛云芝菌、粗毛蓋菌、三色革裥菌、射脈菌、鳳尾菇、糙皮側(cè)耳、朱紅密孔菌 、血紅栓菌、多孔菌、冬擬多孔菌、層孔菌、豹斑革耳、偏腫擬栓菌、密粘褶、硫色絢孔菌、茯苓、臥孔菌、靈芝、蜜環(huán)菌、雙孢菇、從孢薪菇、灰蓋鬼傘、金針菇、平菇、糙皮側(cè)耳

9、 、茶薪菇、潔麗香菇、香菇 。1.1.2 半知菌腐皮鐮孢、綠色木霉、里氏木霉 、康氏木霉、黑曲霉、構(gòu)巢曲霉、繩狀青霉、變幻青霉、灰腐質(zhì)霉、細(xì)粘束孢霉。1.1.3 子囊菌長喙殼、嗜熱毛殼菌、疣孢漆斑菌、嗜熱子囊菌。真菌產(chǎn)生的纖維素酶一般在酸性或中性偏酸條件下水解纖維素底物。真菌纖維素酶通常為胞外酶，酶被分泌到培養(yǎng)基中，用過濾和離心等方法可較容易地得到無細(xì)胞酶制品。目前，木霉、里氏木霉和黑曲霉，是生產(chǎn)飼用纖維素酶的主要真菌，也是公認(rèn)的安全微生物，不產(chǎn)生毒素、產(chǎn)量高、酶系全、活性高、較穩(wěn)定， 是應(yīng)用最廣的纖維素酶生產(chǎn)菌。漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，與抗壞血酸氧化酶和哺乳動物血漿銅藍(lán)蛋白同源，均屬于藍(lán)

10、色多銅氧化酶家族。漆酶在自然界中分布于多種植物、真菌，少數(shù)昆蟲和細(xì)菌中分泌漆酶的真菌主要為擔(dān)子菌亞門的白腐真菌。1.2 產(chǎn)酶細(xì)菌 纖維素分解性細(xì)菌廣泛存在于腐植土、木材、枯枝落葉和草、木本植物體內(nèi)，又分為好氧性細(xì)菌和厭氧性細(xì)菌。好氧性細(xì)菌如纖維單胞菌屬、纖維弧菌屬、噬胞菌屬等可分解纖維素；而厭氧條件下纖維素分解過程中，一些厭氧性的芽孢梭菌屬的細(xì)菌起到了重要作用。此外，枯草桿菌、假單孢桿菌和纖維單孢菌可產(chǎn)生胞外內(nèi)切纖維素酶7。2真菌和細(xì)菌產(chǎn)生酶的差異細(xì)菌的纖維素酶存在于細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)纖維素與細(xì)胞接觸時才能被分解，這種酶不易從培養(yǎng)基中提取出來。真菌的纖維素酶為胞外酶，可分泌到細(xì)胞體外進(jìn)入培養(yǎng)介質(zhì)中，容

11、易被提取，可制成酶制劑，在各種酶解生產(chǎn)中廣泛使用。真菌和細(xì)菌纖維素酶的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域( Cellulose Binding Domain 簡稱CBD)的三維結(jié)構(gòu)不同，真菌CBD由33 36個氨基酸組成，具有高度同源性，而細(xì)菌CBD 由100110個氨基酸組成，同源性較低。真菌外切酶的CBD 結(jié)構(gòu)形狀呈/ 楔型0， 一面親水，另一面疏水。真菌纖維素酶合成后分泌到胞外，其對纖維素的降解是內(nèi)、外切酶之間的協(xié)同作用。而細(xì)菌(枯草桿菌、假單孢桿菌、纖維單孢菌) 可產(chǎn)生胞外內(nèi)切纖維素酶，但無外切纖維素酶的形成。通常，細(xì)菌纖維素酶的降解效率低于真菌8。細(xì)菌纖維素酶產(chǎn)量少、活性低、酶系單一，不能分泌到胞外。

12、絲狀真菌具有諸多優(yōu)點(diǎn): ¹ 產(chǎn)生纖維素酶為胞外酶，便于分離和提?。划a(chǎn)酶效率高，產(chǎn)生纖維素酶的酶系結(jié)構(gòu)較合理，相互間可發(fā)生強(qiáng)烈的協(xié)同作用；可同時產(chǎn)生許多半纖維素酶、果膠酶、淀粉酶等。大部分真菌產(chǎn)酸性纖維素酶，有利于在畜禽胃腸道內(nèi)發(fā)揮作用，所以目前飼用纖維素酶大多來源于真菌9。試驗(yàn)結(jié)果表明，由真菌和細(xì)菌組成的混合菌分解纖維素的能力明顯強(qiáng)于其中任何一種單一菌株。3產(chǎn)酶微生物的分離鑒定3.1 采樣用取樣鏟，將表層5cm左右的浮土除去，取525cm處的土樣1025g，裝入事先準(zhǔn)備好的塑料袋內(nèi)扎好。北方土壤干燥，可在1030cm處取樣。給塑料袋編號并記錄地點(diǎn)、土壤質(zhì)地、植被名稱、時間及其他環(huán)境條

13、件10。 一般樣品取回后應(yīng)馬上分離，如果不能及時分離，則可事先用選擇性培養(yǎng)基做好試管斜面，隨身帶走。3.1.1土壤有機(jī)質(zhì)含量和通氣狀況 525cm土層，適合微生物生長，每克土中含菌數(shù)約幾十萬到幾十億個。酵母菌分布土層最淺，約510cm，霉菌和好氧芽孢桿菌也分布在淺土層。3.1.2地理?xiàng)l件南方土壤比北方土壤中的微生物數(shù)量和種類都要多，特別是熱帶和亞熱帶地區(qū)的土壤。3.1.3土壤酸堿度和植被狀況 偏堿土壤環(huán)境，適合于細(xì)菌、放線菌生長。偏酸的土壤環(huán)境下，霉菌、酵母菌生長旺盛。 植物根部的分泌物有所不同，即植被對微生物分布也有一定的影響。如葡萄或其他果樹在果實(shí)成熟時，其根部附近土壤中酵母菌數(shù)量增多11

14、。3.1.4季節(jié)條件不同季節(jié)微生物數(shù)量有明顯的變化，冬季溫度低，氣候干燥，微生物生長緩慢，數(shù)量最少。到了春天隨著氣溫的升高，微生物生長旺盛，數(shù)量逐漸增加。由于氣候條件在南方秋季采土樣最為理想。3.1.5根據(jù)微生物營養(yǎng)類型每種微生物對碳、氮源的需求不一樣，分布也有差異。微生物的營養(yǎng)需求和代謝類型與其生長環(huán)境有著很大的相關(guān)性。森林土富含纖維素，適合纖維素酶產(chǎn)生菌的生長。3.1.6根據(jù)微生物的生理特性在篩選一些具有特殊性質(zhì)的微生物時，需根據(jù)該微生物獨(dú)特的生理特性到相應(yīng)的地點(diǎn)采樣。篩選高溫酶產(chǎn)生菌時，通常到溫度較高的南方，或溫泉、火上爆發(fā)處及北方的堆肥中采樣；3.2富集培養(yǎng)富集培養(yǎng)是在目的微生物含量較

15、少時，根據(jù)微生物的生理特點(diǎn)，設(shè)計(jì)一種選擇性培養(yǎng)基，創(chuàng)造有利的生長條件，使目的微生物在最適的環(huán)境下迅速地生長繁殖，數(shù)量增加，由原來自然條件下的劣勢種變成人工環(huán)境下的優(yōu)勢種，以利分離到所需要的菌株。富集培養(yǎng)主要根據(jù)微生物的碳、氮源、pH、溫度、需氧等生理因素加以控制12。富集產(chǎn)纖維素酶的菌時就需要一纖維素為唯一碳源富集纖維素降解菌。3.3 初篩通常是將分離出的菌種移植在一定組分的培養(yǎng)基上，此培養(yǎng)基成分需有篩選作用，用固體或液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，鑒定培養(yǎng)的是否為目標(biāo)菌。鑒別的方法常用有四類，分別是透明圈法、變色圈法、生長圈法、抑制圈法。篩選纖維素降解菌時一般在培養(yǎng)基中加入剛果紅，這樣當(dāng)所培養(yǎng)的菌降解了

16、培養(yǎng)基中的纖維素時就會在培養(yǎng)基上形成透明圈13。3.4復(fù)篩為了從初篩得到的微生物中篩選高產(chǎn)菌株需要對每一個菌株，用接近于生產(chǎn)的培養(yǎng)條件進(jìn)行復(fù)篩，再測定培養(yǎng)物的酶活力。復(fù)篩時一般選用1-2種培養(yǎng)基，在固定培養(yǎng)條件下對每一個菌株進(jìn)行復(fù)篩。菌株多時對每一個菌株做一份實(shí)驗(yàn)，從中擇優(yōu)汰劣。3.5菌株鑒定和產(chǎn)物鑒定3.5.1菌落特征觀察將菌株接種在適宜培養(yǎng)基上培養(yǎng)，之后連續(xù)觀察上面的菌株生長過程中菌落的表面平坦或是突出，邊緣粗糙或整齊，質(zhì)地均均勻與否，正反面顏色是否相同，氣味的有無及味道如何，菌落形狀和大小及菌株個體形態(tài)等特征14。然后根據(jù)真菌鑒定手冊或伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊進(jìn)行分析鑒定。3.5.2分子生物學(xué)

17、鑒定對細(xì)菌菌株的16SrRNA真菌菌株的18SrRNA序列進(jìn)行測序，并同GenBank 中序列進(jìn)行比對.確定未知種與同屬種之間的親緣關(guān)系。3.5.3產(chǎn)物酶的酶活測定酶活力測定常用的方法有終點(diǎn)法和動力學(xué)方法。動力學(xué)方法包括比色法、量氣法、滴定法、分光光度法、放射測量法、酶偶聯(lián)分析。其中分光光度法最常用，幾乎所有的氧化還原酶都使用該法測定。它是利用底物和產(chǎn)物光吸收性質(zhì)的不同，可直接測定反應(yīng)混合物中底物的減少量或產(chǎn)物的增加量。纖維素酶是一組酶的總稱包括：濾紙酶、-葡聚糖苷酶、內(nèi)切葡聚糖(CMC)酶、外切葡聚(CBH)酶15。所以測定纖維素酶的活力需要測定這四種酶的酶活。4.酶的應(yīng)用領(lǐng)域以纖維素酶為例

18、白腐菌降解機(jī)制復(fù)雜，技術(shù)難度較大。到目前為止，白腐菌的應(yīng)用研究主要集中在用過氧化物酶系預(yù)處理某些原料降低工業(yè)能耗，實(shí)現(xiàn)清潔生產(chǎn)，降解污染物等方面。4.1 制漿造紙 白腐菌用于生物制漿主要是直接用菌絲體或經(jīng)提取后的酶降解木質(zhì)素，在處理牛皮紙漿過程中取得較好效果。漆酶是潛在的生物紙漿漂白劑16。傳統(tǒng)的氯氣漂白工藝可產(chǎn)生有毒化合物造成環(huán)境污染， 而用漆酶對紙漿進(jìn)行漂白可克服這些缺點(diǎn)。此外，漆酶還可用于造紙工業(yè)的紙漿生產(chǎn)。傳統(tǒng)的紙漿是用燒堿或硫酸鹽高溫煮蒸原料，除去木質(zhì)素制成的，這不僅使得部分纖維素和半纖維素降解，影響紙漿得率， 而且嚴(yán)重污染環(huán)境。采用漆酶選擇性降解木質(zhì)素生產(chǎn)紙漿，可節(jié)約設(shè)備和能耗，縮

19、短紙漿生產(chǎn)周期，降低生產(chǎn)成本，給造紙工業(yè)帶來良好的經(jīng)濟(jì)和社會效益。近年來，研究發(fā)現(xiàn)白腐菌對紙漿漂白廢水具有明顯的脫色和消除毒性的作用，其原因在于白腐菌可進(jìn)一步降解此類廢水中的氯化木素降解產(chǎn)物，而氯化木素和氧化物則是含氯漂白廢水毒性和顏色的主要來源。4.2 飼料工業(yè) 利用白腐菌處理飼料可提高動物對飼料的消化率；通過構(gòu)建基因工程菌提高纖維素酶的產(chǎn)量和質(zhì)量已成為推動纖維素酶廣泛應(yīng)用于飼料業(yè)生產(chǎn)的重要手段。4.3 污水治理 近年來，農(nóng)藥和洗滌劑的過度使用，尤其是含氯芳香類化合物的使用，對環(huán)境造成了嚴(yán)重的污染；利用漆酶可降解氯酚類有機(jī)化合物17。彩絨革蓋菌產(chǎn)生的木素過氧化物酶、漆酶和多酚氧化酶具有較強(qiáng)的

20、分解能力。尤其是漆酶對單氯酚進(jìn)行24h處理后，鄰位和對位氯酚的去除率分別達(dá)98.6% 和100%18。另外，利用白腐菌對煤進(jìn)行解聚及增溶， 避免了直接使用煤所引起的大氣污染，同時白腐菌對煤和石油還具有脫硫作用。白腐菌具有非特異性的降解性能，可有效降解廢水生化處理過程中很難被降解的多氯聯(lián)苯、多環(huán)芳烴、DDT、染料、炸藥和其他化合物(氯化物、疊氮化合物)等。有人用固定化菌絲技術(shù)處理紙漿漂白廢水，經(jīng)過3 4 d 的處理后，COD 和BOD降低60%以上，氯代有機(jī)物減少45%19。目前，人們已開始利用白腐菌對污染物堆積地及受農(nóng)藥污染的土壤進(jìn)行生物修復(fù)。針對受石油烴污染的土壤，白腐真菌已顯示出較強(qiáng)的降解

21、能力，在1年內(nèi)，土壤中的總石油烴降解率高達(dá)80%。此外，還可利用酶清除室內(nèi)甲醛氣體。4.4 紡織洗滌細(xì)菌所產(chǎn)生的纖維素酶一般為中性至偏堿性，水解作用較弱， 長期以來研究較少，沒有得到足夠的重視。近10幾年來，隨著中性纖維素酶和堿性纖維素酶在棉織品水洗整理工藝及洗滌劑工業(yè)中的成功應(yīng)用，細(xì)菌纖維素酶制劑已顯示出良好的使用性能和巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。白腐菌產(chǎn)生的漆酶具有底物專一性，黃孢原毛平革菌對染料廢水具有較好的脫色效果。通過基因工程改良的黑曲霉經(jīng)深層發(fā)酵制得漆酶后，對牛仔布靛藍(lán)染料的脫色效果明顯。在考古研究領(lǐng)域，生物酶被應(yīng)用于清除2600年前的方孔紗中的腐爛物和泥土20。4.5 食品工業(yè)漆酶主要用于飲

22、料澄清與色澤控制，該酶可氧化多酚類物質(zhì)生成多酚氧化物，進(jìn)而發(fā)生再聚合，形成可以被濾膜截留的大顆粒，達(dá)到凈化飲料的目的21。由于這一催化反應(yīng)專一性強(qiáng)、污染少，澄清的果汁色淺且穩(wěn)定，可以解決果汁加工中的二次混濁問題。在啤酒生產(chǎn)中， 可用漆酶進(jìn)行沉淀和脫除絮凝，使酒類得到澄清。利用漆酶中銅離子的催化特性，可除去色拉、蛋黃醬等食品中溶解的氧，消除食品中的亞麻酸和溶解氧反應(yīng)生成的揮發(fā)性異味組分，達(dá)到改良食品感官參數(shù)的目的。此外，漆酶還可用來測定食品中抗壞血酸的總含量。研究發(fā)現(xiàn)鄰苯二胺可被漆酶氧化成2,3-二氨基吩嗪，而L-抗壞血酸對2,3-二氨基吩嗪的生成具有抑制作用22，漆酶的酶活性與抗壞血酸含量呈反

23、比。該方法已應(yīng)用于白酒、啤酒、奶粉等食品檢測中。4.6 堆肥 將白腐菌應(yīng)用于堆肥，可加快木質(zhì)纖維轉(zhuǎn)化為腐殖質(zhì)肥料的分解速度。白腐菌降解技術(shù)在城市垃圾堆肥中的應(yīng)用，需從尋找適合的菌種和白腐真菌的最佳降解條件著手，開發(fā)出新的混合菌劑加速堆肥腐熟，同時利用白腐菌產(chǎn)生的多種酶降解城市垃圾中的有毒物質(zhì)，研發(fā)控制污染的綠色環(huán)保技術(shù)。5 未來研究方向隨著真菌和細(xì)菌酶技術(shù)的不斷發(fā)展， 酶的應(yīng)用領(lǐng)域?qū)⒉粩鄶U(kuò)大， 需求量將不斷增加。然而不同工業(yè)需要的酶種類不同，這些酶來自哪些真菌和細(xì)菌，它們存在于哪些基物上，如何分離、鑒定和純化，以及它們在固、液環(huán)境下的生長條件如何，都將是今后的研究方向。參考文獻(xiàn)1 鄧強(qiáng).香蕉稈

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