生物化學(xué)研究技術(shù)SDSPAGE鑒定菠蘿蛋白酶的純實(shí)用教案

1、一、實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)(shyn)目的目的1、學(xué)習(xí)和掌握電泳（SDS-PAGE）的基本原理及電泳技術(shù)。2、熟練配制SDS-PAGE相關(guān)(xinggun)各種試劑。第1頁/共23頁第一頁，共23頁。二、實(shí)驗(yàn)二、實(shí)驗(yàn)(shyn)原理原理 電泳電泳: :帶電粒子在電場中向與其自身帶相反電荷的電極移動(dòng)，這種現(xiàn)象帶電粒子在電場中向與其自身帶相反電荷的電極移動(dòng)，這種現(xiàn)象(xinxing)(xinxing)稱稱為電泳。為電泳。第2頁/共23頁第二頁，共23頁。影響影響(yngxing)電泳的主要因素電泳的主要因素 （1）顆粒性質(zhì)：一般說來，顆粒帶凈電荷量越大，或其直徑越小，或其形狀越接近球形，在電場中的泳動(dòng)速度就

2、快。反之，則越慢。（2）電場強(qiáng)度：電場強(qiáng)度越高，帶電顆粒的泳動(dòng)速度越快。反之，則越慢。（3）pH值（4）離子強(qiáng)度：溶液(rngy)的離子強(qiáng)度一般在0.020.2mol/kg之間電泳較合適。（5）溶液(rngy)粘度（6）電滲（7）焦耳熱（8）篩孔第3頁/共23頁第三頁，共23頁。 聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳(din yn)(din yn)是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持物的一種電泳是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持物的一種電泳(din (din yn)yn)。 這種凝膠是由丙烯酰胺單體這種凝膠是由丙烯酰胺單體( (簡稱簡稱 Acr) Acr)和交聯(lián)劑和交聯(lián)劑 N N，N-N-甲叉雙丙烯酰胺甲叉雙丙

3、烯酰胺( (簡稱簡稱Bis)Bis)，在催化劑的作用下聚合而成的。在催化劑的作用下聚合而成的。第4頁/共23頁第四頁，共23頁。 聚丙烯酰胺凝膠聚合的體系有兩種，即化學(xué)聚合和光聚合。聚丙烯酰胺凝膠聚合的體系有兩種，即化學(xué)聚合和光聚合。 化學(xué)聚合的引發(fā)劑是過硫酸銨化學(xué)聚合的引發(fā)劑是過硫酸銨(NH4)2S2O3(NH4)2S2O3(簡稱簡稱Ap)Ap)，催化劑是，催化劑是N N，N N，NN，N-N-四甲四甲基乙二胺基乙二胺(TEMED)(TEMED)。在催化劑。在催化劑TEMEDTEMED的作用下，由過硫酸銨的作用下，由過硫酸銨(Ap)(Ap)形成形成(xngchng)(xngchng)氧的自氧

4、的自由基，后者又使單體形成由基，后者又使單體形成(xngchng)(xngchng)自由基，從而引起聚合作用。自由基，從而引起聚合作用。第5頁/共23頁第五頁，共23頁。 聚丙烯酰胺凝膠的質(zhì)量主要由凝膠濃度和交聯(lián)度決聚丙烯酰胺凝膠的質(zhì)量主要由凝膠濃度和交聯(lián)度決定。定。 每每100mL凝膠溶液凝膠溶液(rngy)中含有的單體中含有的單體(Acr)和交和交聯(lián)劑聯(lián)劑(Bis)總克數(shù)稱為凝膠濃度，用總克數(shù)稱為凝膠濃度，用T表示。表示。 凝膠溶液凝膠溶液(rngy)中，交聯(lián)劑中，交聯(lián)劑(Bis)占單體占單體(Acr)和交和交聯(lián)劑聯(lián)劑(Bis)總量的百分?jǐn)?shù)稱為交聯(lián)度，用總量的百分?jǐn)?shù)稱為交聯(lián)度，用C表示。表

5、示。第6頁/共23頁第六頁，共23頁。 不連續(xù)的聚丙烯酰胺凝膠電泳，帶電顆粒在電場中的泳動(dòng)有電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)還不連續(xù)的聚丙烯酰胺凝膠電泳，帶電顆粒在電場中的泳動(dòng)有電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)還具有具有(jyu)(jyu)濃縮效應(yīng)。濃縮效應(yīng)。 (l) (l) 濃縮效應(yīng)濃縮效應(yīng) (2)(2)電荷效應(yīng)電荷效應(yīng) (3)(3)分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng)第7頁/共23頁第七頁，共23頁。Gel5%10%15%294566972002945669720029456697200第8頁/共23頁第八頁，共23頁。實(shí)驗(yàn)試劑實(shí)驗(yàn)試劑(shj)(shj)配制配制 (1) 30%凝膠貯液：取凝膠貯液：取30g丙烯酰胺（丙烯酰胺（

6、Acr）、）、0.8g甲叉雙丙甲叉雙丙烯酰胺烯酰胺(Bis), （先用約（先用約50ml蒸餾水溶解，如溶解不了蒸餾水溶解，如溶解不了,可可加熱加熱3050溶解溶解,再用量筒定容至再用量筒定容至100ml，然后過濾，然后過濾，后置于棕色瓶后置于棕色瓶,4下保存?zhèn)溆茫?。下保存?zhèn)溆茫?2) 聚丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，操作聚丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，操作(cozu)時(shí)要戴手套時(shí)要戴手套(3) (2) 10%過硫酸銨過硫酸銨(AP)溶液：取溶液：取2g過硫酸銨溶解后，用過硫酸銨溶解后，用20ml dH2O溶解，現(xiàn)配現(xiàn)用。溶解，現(xiàn)配現(xiàn)用。(4) (3) 1 mol/L HCl 500ml：取濃：取濃HCl 4

7、2 ml，加蒸餾水至，加蒸餾水至500 ml(在通風(fēng)櫥中操作在通風(fēng)櫥中操作(cozu)。(5) (4) 分離膠緩沖溶液（分離膠緩沖溶液（1.5mol/L Tris-HCl緩沖液，緩沖液，pH8.8）:取取18.15g Tris溶解后，加溶解后，加1mol/L HCl溶液約溶液約48ml，調(diào)，調(diào)pH至至8.8, 定容至定容至100ml。第9頁/共23頁第九頁，共23頁。(5) 濃縮膠緩沖液濃縮膠緩沖液(0.5mol/L Tris-HCl緩沖液緩沖液,pH6.8): 取取6g Tris溶解后，加溶解后，加1mol/L HCl溶液溶液(rngy)40ml，調(diào)調(diào)pH至至6.8，定容至，定容至100ml

8、 。(6) 10%SDS(十二烷基硫酸鈉十二烷基硫酸鈉)溶液溶液(rngy): 取取5g SDS加水定容至加水定容至50ml。（加熱溶解）。（加熱溶解）(7) 2電極緩沖液電極緩沖液(0.1%SDS0.05mol/L Tris0.384mol/L甘氨酸緩沖液，甘氨酸緩沖液，pH8.3):取取6gTris，28.8g甘氨酸和甘氨酸和1g SDS加水溶解后，定容至加水溶解后，定容至000ml（配好的溶液（配好的溶液(rngy)pH8.3）(12個(gè)組可配個(gè)組可配2升升,使用使用時(shí)再稀釋時(shí)再稀釋2倍倍)。 第10頁/共23頁第十頁，共23頁。(8) 樣品溶解液：取樣品溶解液：取SDS g，-巰基乙醇巰

9、基乙醇 ml，甘，甘油油10ml，溴酚藍(lán)，溴酚藍(lán)0.1g，0.5mol/L pH6.8 TrisHCl緩沖液緩沖液 (濃縮膠緩沖液濃縮膠緩沖液)10ml，加蒸餾水，加蒸餾水25ml，(最最后后(zuhu)的總體積為的總體積為50 ml),裝于棕色瓶。裝于棕色瓶。(9)染色液（染色液（0.1%考馬斯亮藍(lán)考馬斯亮藍(lán)-45%甲醇甲醇-10%冰乙酸冰乙酸溶液）：溶液）：1g考馬斯亮藍(lán)考馬斯亮藍(lán)R250，加入，加入450 ml 甲醇、甲醇、100ml冰乙酸，用水定容至冰乙酸，用水定容至1000 ml。(12個(gè)組可配個(gè)組可配2000 ml)(10)脫色液脫色液高甲醇高甲醇1000ml：甲醇：甲醇 454m

10、l，冰醋酸，冰醋酸75ml，dH2O 471 ml低甲醇低甲醇1000ml ：甲醇：甲醇 50ml，冰醋酸，冰醋酸75ml，dH2O 875 ml第11頁/共23頁第十一頁，共23頁。七實(shí)驗(yàn)步驟七實(shí)驗(yàn)步驟1.1.清洗并吹干玻璃板。清洗并吹干玻璃板。2.2.在塑料膠條的兩面涂少量凡士林（注意不能涂多，在塑料膠條的兩面涂少量凡士林（注意不能涂多，以防弄臟玻璃板）。以防弄臟玻璃板）。3.3.把玻璃板放入電泳槽中。把玻璃板放入電泳槽中。4.4.用小燒杯加用小燒杯加6ml6ml蒸餾水，蒸餾水，2ml 30%2ml 30%凝膠儲(chǔ)液，凝膠儲(chǔ)液，20 ul 20 ul TEMEDTEMED，100ul 101

11、00ul 10過硫酸銨，混勻，迅速過硫酸銨，混勻，迅速(xn s)(xn s)倒入封口槽處倒入封口槽處( (一定要快！一定要快！) )，靜置約，靜置約10min10min直到凝固。直到凝固。聚丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，操作時(shí)要戴手套聚丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，操作時(shí)要戴手套5.5.加加dH2OdH2O于兩層玻璃之間，檢查玻璃底是否漏水；如于兩層玻璃之間，檢查玻璃底是否漏水；如果漏水，要重裝。果漏水，要重裝。第12頁/共23頁第十二頁，共23頁。6.按下表用小燒杯(shobi)配12%分離膠，混勻，灌膠，高度離梳子約11.5cm，然后覆蓋一層水，凝膠時(shí)間為1530min，膠與水分層，傾倒去水。12%分離

12、膠5%濃縮膠 30%凝膠貯液4000l810 l上層膠緩沖液pH6.81250 l下層膠緩沖液pH8.82500lTEMED（四甲基乙二胺)30 l20 l10%SDS100l50ldH2O3270l2820lAP（過硫酸氨）100l50 l第13頁/共23頁第十三頁，共23頁。7.凝好膠，垂直拔掉梳子（不要左右搖梳子）。8.上槽加入電泳緩沖液（電極(dinj)緩沖液稀釋2倍），液面需沒過低玻璃板；下槽電泳緩沖液沒過玻璃板封膠處1cm。9.用1.5ml ep管取100l粗酶樣品與100l樣品溶解液混合均勻，與蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)一起置于沸水浴5min）。第14頁/共23頁第十四頁，共23頁。10.

13、微量注射器按下表2點(diǎn)樣，隔孔點(diǎn)樣，注意不要交叉污染（每點(diǎn)一個(gè)樣都要清洗(qngx)微量注射器）。表2 點(diǎn)樣方式孔1234567891011加樣粗酶標(biāo)準(zhǔn)蛋白過柱1過柱2過柱3體積L304030353535 *微量注射器不可過低,以防刺破膠體；也不可過高, 樣品(yngpn)下沉?xí)r易發(fā)生擴(kuò)散，溢出加樣孔第15頁/共23頁第十五頁，共23頁。11.上槽接負(fù)極，下槽接正極。12.恒電流電泳：濃縮膠，1012 mA，待溴酚藍(lán)遷移到濃縮膠與分離膠的界面(jimin)調(diào)整電流至20mA。13.待溴酚藍(lán)遷移到距分離膠底部0.51cm處，結(jié)束電泳。14.染色（2030min），回收染色液。15.脫色：高甲醇60

14、80ml，25min；高甲醇4060ml 20min；低甲醇80100ml完全脫凈剝膠時(shí)要小心剝膠時(shí)要小心, ,保持膠完好無損保持膠完好無損, ,染色染色(rns)(rns)要充分要充分第16頁/共23頁第十六頁，共23頁。16.拍照并畫電泳圖譜，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)蛋白、待測樣品的相對遷移率（蛋白相對遷移率蛋白遷移距離/指示劑遷移距離）。17.用低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)所作的標(biāo)準(zhǔn)曲線(qxin)，求待測樣品亞基的相對分子量。18.以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)電泳的相對遷移率為橫坐標(biāo)(X)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)為縱坐標(biāo)(Y)，繪標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(qxin)，再根據(jù)樣品相對遷移率在曲線(qxin)上求出其蛋白質(zhì)的分子量。第

15、17頁/共23頁第十七頁，共23頁。蛋白名稱 遷移距離 相對遷移率（Y） 蛋白分子量(D) 蛋白分子量對數(shù)(X) 兔磷酸化酶B 牛血清白蛋白 牛碳酸酐酶 牛蛋白酶抑制劑 雞蛋清溶菌酶 過柱的菠蘿蛋白酶 指示劑 -第18頁/共23頁第十八頁，共23頁。低分子量標(biāo)準(zhǔn)低分子量標(biāo)準(zhǔn)(biozhn)(biozhn)蛋白質(zhì)的組分：蛋白質(zhì)的組分：1) 1) 兔磷酸化酶兔磷酸化酶B B 分子量分子量 97,400 97,4002) 2) 牛血清白蛋白牛血清白蛋白 分子量分子量66,20066,2003) 3) 兔肌動(dòng)蛋白兔肌動(dòng)蛋白 分子量分子量43,00043,0004) 4) 牛碳酸酐酶牛碳酸酐酶 分子量分

16、子量31,00031,0005) 5) 牛蛋白酶抑制劑牛蛋白酶抑制劑 分子量分子量20,10020,1006) 6) 雞蛋清溶菌酶雞蛋清溶菌酶 分子量分子量14,40014,400第19頁/共23頁第十九頁，共23頁。八實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)八實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)1.緩沖液的緩沖液的pH值、濃度要準(zhǔn)確配置；值、濃度要準(zhǔn)確配置；2.AP新鮮新鮮(xn xin)配置。配置。3.SDS在低溫下析出，使用前水浴加在低溫下析出，使用前水浴加熱使之溶解。熱使之溶解。第20頁/共23頁第二十頁，共23頁。九實(shí)驗(yàn)九實(shí)驗(yàn)(shyn)(shyn)結(jié)果分析結(jié)果分析 1. 各實(shí)驗(yàn)組分析討論實(shí)驗(yàn)結(jié)果，再由老師進(jìn)行歸納總結(jié)。2. 做好電泳圖譜的繪制及數(shù)