分子生物學(xué)常用檢測(cè)技術(shù)

1、編輯ppt1分子生物學(xué)常用檢測(cè)技術(shù)分子生物學(xué)常用檢測(cè)技術(shù)及臨床應(yīng)用及臨床應(yīng)用編輯ppt2編輯ppt3DNADNA四種核苷酸（四種核苷酸（A-T-C-G)A-T-C-G)組成組成的多聚骨架的多聚骨架所有組成所有組成DNADNA的核苷酸的核苷酸dATP,dTTP, dCTP,dGTPdATP,dTTP, dCTP,dGTP都由三種成分組成：都由三種成分組成：1 1）一個(gè)）一個(gè)2 2- -脫氧核糖（戊糖）脫氧核糖（戊糖）2 2）一個(gè)含氮堿基）一個(gè)含氮堿基 嘌呤：嘌呤：AG AG 嘧啶：嘧啶：T/CT/C3 3）三個(gè)磷酸基團(tuán)）三個(gè)磷酸基團(tuán)各單個(gè)核苷酸由各單個(gè)核苷酸由5 5和和3 3- -碳形碳形成的磷

2、酸二酯鍵連接在成的磷酸二酯鍵連接在一起一起編輯ppt4變性、復(fù)性、退火和淬火編輯ppt5基因編輯ppt6分子生物學(xué)常用技術(shù) PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)） 核酸分子雜交 基因芯片技術(shù)(biochip) DNA 測(cè)序（DNA sequencing ） DNA重組技術(shù)(DNA recombination) 編輯ppt7 一、聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction ，PCR）體外基因擴(kuò)增技術(shù)體外基因擴(kuò)增技術(shù) 特異性強(qiáng)靈敏度高操作簡(jiǎn)單、省時(shí)對(duì)待檢原始材料質(zhì)量要求低高效率的基因擴(kuò)增技術(shù)編輯ppt8（一）PCR原理原理雙鏈DNA 變性 退火 鏈延伸 （膜板） （雙鏈分成單鏈） （膜板與

3、引物雜交） （DNA合成）不斷重復(fù)編輯ppt9（二）（二）PCR反應(yīng)的設(shè)計(jì)及影響因素反應(yīng)的設(shè)計(jì)及影響因素編輯ppt10PCR的種類(lèi)熒光定量PCR通用引物PCR多重PCR巢式PCRRT-PCR原位PCR免疫PCR編輯ppt11TaqManTaqMan探針reverse primerRQforward primer33553551. PolymerisationprobeRQ33553552. Strand displacementQ33553553. CleavageR3553554. Polymerisation completedQRR = ReporterQ = Quencher3熒光定量

4、PCR編輯ppt12定量定量PCRPCR的數(shù)學(xué)原理的數(shù)學(xué)原理PCR 理理 論論 方方 程程N(yùn) = N0 x (1+E)nN：擴(kuò)增數(shù)量擴(kuò)增數(shù)量N0：起始模板數(shù)量起始模板數(shù)量E：擴(kuò)增效率擴(kuò)增效率N：循環(huán)數(shù)循環(huán)數(shù) 循環(huán)數(shù)循環(huán)數(shù)線(xiàn)性增長(zhǎng)期Linear平臺(tái)期Plateauy = N0 (1+e)n指數(shù)增長(zhǎng)期指數(shù)增長(zhǎng)期GeometricGeometric編輯ppt13定量定量PCRPCR的數(shù)學(xué)原理的數(shù)學(xué)原理Rn (熒光強(qiáng)度)循環(huán)數(shù)Cycle Number指數(shù)增長(zhǎng)期平臺(tái)期CT = - k logN0 + bCt（Cyclethreshold）值：是指每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定域值（threshold）時(shí)

5、所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。編輯ppt14PCR的臨床應(yīng)用的臨床應(yīng)用l 對(duì)病原微生物核酸進(jìn)行快速檢測(cè)l 彌補(bǔ)免疫檢測(cè)的缺陷l 縮短診斷的窗口期（如HBV,HIV）l 用于藥物療效監(jiān)測(cè)和評(píng)估l 用于腫瘤基因表達(dá)方面的研究l 用于遺傳病的診斷編輯ppt15樣本采集要求編輯ppt16編輯ppt17二、核酸分子雜交根據(jù)根據(jù)核酸變性和復(fù)性核酸變性和復(fù)性的原理的原理，不同來(lái)源的，不同來(lái)源的變性單鏈核酸分子在變性單鏈核酸分子在合適的條件下，通過(guò)合適的條件下，通過(guò)堿基互補(bǔ)堿基互補(bǔ)形成雙鏈雜形成雙鏈雜交體的過(guò)程稱(chēng)為交體的過(guò)程稱(chēng)為核酸核酸分子雜交分子雜交（molecular hybridization）。）。編輯ppt18

6、1、遺傳病的診斷 2、病原體的鑒定 3、癌基因突變的檢測(cè) 4、組織配型 5、親子鑒定核酸分子雜交的臨床應(yīng)用編輯ppt19三、基因芯片技術(shù) 基質(zhì)材料分，有尼龍膜、玻璃片、塑料、硅膠晶片、微型磁珠等。編輯ppt20用點(diǎn)樣法固定在玻璃板上的DNA探針陣列原位合成法在玻璃等硬質(zhì)表面上直接合成的寡核苷酸探針陣列編輯ppt21基因芯片技術(shù)的應(yīng)用1、藥物篩選和新藥開(kāi)發(fā)2、疾病診斷3、環(huán)境保護(hù)4、司法5、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)編輯ppt22四、測(cè)序技術(shù)CTTGATCTTCAGGTAGGCCTGAATCCT（一）一代測(cè)序技術(shù)編輯ppt23（二）二代測(cè)序技術(shù) Illumina公司的Solexa和Hiseq應(yīng)該說(shuō)是目前全球使用量

7、最大的第二代測(cè)序機(jī)器，這兩個(gè)系列的技術(shù)核心原理是相同的。 Illumina/Solexa Genome Analyzer測(cè)序的基本原理是邊合成邊測(cè)序。 在Sanger等測(cè)序方法的基礎(chǔ)上，通過(guò)技術(shù)創(chuàng)新，用不同顏色的熒光標(biāo)記四種不同的dNTP，當(dāng)DNA聚合酶合成互補(bǔ)鏈時(shí)，每添加一種dNTP就會(huì)釋放出不同的熒光，根據(jù)捕捉的熒光信號(hào)并經(jīng)過(guò)特定的計(jì)算機(jī)軟件處理，從而獲得待測(cè)DNA的序列信息。編輯ppt24編輯ppt25技術(shù)特點(diǎn)比較 第一代測(cè)序技術(shù)的主要特點(diǎn)是測(cè)序讀長(zhǎng)可達(dá)1000bp，準(zhǔn)確性高達(dá)99.999%，但其測(cè)序成本高，通量低等方面的缺點(diǎn)，嚴(yán)重影響了其真正大規(guī)模的應(yīng)用。 第二代測(cè)序技術(shù)大大降低了測(cè)序成本的同時(shí)，還大幅提高了測(cè)序速度，并且保持了高準(zhǔn)確性，但在序列讀長(zhǎng)方面比起第一代測(cè)序技術(shù)則要短很多。編輯ppt26五、基因重組技術(shù) 基因重組是指一個(gè)基因的DNA序列是由兩個(gè)或兩個(gè)以上的親本DNA組合起來(lái)的。 基因重組是遺傳的基本現(xiàn)象，病毒、原核生物和真核生物都存在基因重組現(xiàn)象。編輯ppt27 轉(zhuǎn)基因植物 （抗蟲(chóng)、抗凍、抗病、高產(chǎn)） 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 基因工程藥物和疫苗 基因治療基因重組技術(shù)的應(yīng)用編輯ppt28小結(jié) 疾病的診斷 感染性疾病診斷 腫瘤性疾病診斷 遺傳性疾病診斷 組織配