高級微生物學(xué)湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)4

1、3/14/2022整理ppt13/14/2022整理ppt2一、食品中微生物的培養(yǎng)與觀測一、食品中微生物的培養(yǎng)與觀測二、二、理、化、免疫學(xué)鑒測法理、化、免疫學(xué)鑒測法3/14/2022整理ppt3食食 品品 中中 微微 生生 物物的的 培培 養(yǎng)養(yǎng) 與與 觀觀 測測3/14/2022整理ppt4 現(xiàn)代微生物學(xué)的知識和技術(shù)使人們能夠全面地檢測未知的微生物類群，同時發(fā)現(xiàn)這些微生物的功能性狀及基因多樣性。3/14/2022整理ppt5 檢測食品中微生物總數(shù)的方法通常有檢測食品中微生物總數(shù)的方法通常有4 種種： 活性細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)平板計數(shù)法（SPC）； 活性和非活性細(xì)胞的顯微直接計數(shù)法（DMC法） ； 各種細(xì)

2、胞的統(tǒng)計學(xué)檢測法即最近似數(shù)測定法 （MPN）； 染色還原技術(shù)估算具有還原能力的各種細(xì)胞 的總數(shù)。3/14/2022整理ppt6 一、一、活性細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)平板計數(shù)法（活性細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)平板計數(shù)法（SPC） 1.1 1.1 傳統(tǒng)計數(shù)法傳統(tǒng)計數(shù)法： 標(biāo)準(zhǔn)平板計數(shù)法(standard plate count. SPC) 是檢測食品中單位質(zhì)量或單位體積樣品在培養(yǎng)基上形成的菌落數(shù)，稱為菌落形成單位數(shù)(colony forming units,)。是食品工業(yè)中檢測食品中菌數(shù)(含食品中的菌落總數(shù)、霉菌、酵母菌數(shù)或致病菌數(shù))的最常用的方法。 3/14/2022整理ppt7在計數(shù)時應(yīng)考慮以下因素：（1）采用的取樣方法；

3、（2）微生物在樣品中的分 布情況；（3）食品中生物群的特 性；（4）食品原料的特性；（5) 食品的預(yù)檢過程；（6）所用培養(yǎng)基的營養(yǎng)情 況；（7）培養(yǎng)溫度和時間；（8）培養(yǎng)基的pH，Aw和 氧化還原電勢（Eh）（9）稀釋劑的類型；（10）食品樣品中的相對 數(shù)量；（11）其他竟?fàn)幮曰蜣卓?微生物的存在。3/14/2022整理ppt8 SPCSPC法法大多采用傾注平板(混菌)的方法，也有的采用涂布平板法。都可稱稀釋平板計數(shù)法。 涂布平板法的優(yōu)點在于可檢測到熱敏性菌體，而在傾注平板法中這些菌在熔融的瓊脂培養(yǎng)基中則不能生長。如果要鑒定某種單菌落時，則以涂布平板法較好；檢測嚴(yán)格好氧菌也以涂布法為好；涂布法

4、的主要缺點是涂布物問題和菌落重疊混雜的問題。3/14/2022整理ppt9平皿菌落平皿菌落(傾注法)計數(shù)計數(shù)：3/14/2022整理ppt10 涂布和傾注法3/14/2022整理ppt111.2 1.2 旋轉(zhuǎn)平板法旋轉(zhuǎn)平板法： 用一種特制的散布器從平板中心移至外圍，將樣品涂布在阿基米德旋轉(zhuǎn)平板上，所附備的特殊注射器不斷增加散布樣品的體積數(shù)量，使得在一個平板上的濃度范圍達(dá)到10000:1。在適當(dāng)溫度下培養(yǎng)，平板中心的菌落濃度較高，邊緣的濃度較低。 通過一種特殊的格狀計數(shù)器對旋轉(zhuǎn)平板的菌落計數(shù)。3/14/2022整理ppt12 優(yōu)點優(yōu)點在于：所用的瓊脂少，所需的培養(yǎng)皿、稀釋液空白、吸管要少，每小時

5、可檢測的樣品為標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)法的3-4倍，每小時可涂布50-60個平板，且操作中不需調(diào)試。 其缺點是，食品樣品中的顆粒可能會使注射器的針頭堵塞。此法更適合牛乳等液體食品。在此法中也可應(yīng)用激光計數(shù)器。由于設(shè)備較貴，使用機(jī)會少。可詳見細(xì)菌學(xué)分析手冊3/14/2022整理ppt13 過濾膜的孔徑通常為0.45 m ，故水和溶質(zhì)能通過而細(xì)菌不能通過膜。將一定體積的樣品經(jīng)膜過濾后收集菌體，再將膜放在瓊脂平板或充滿選擇性培養(yǎng)基的吸收墊上進(jìn)行培養(yǎng)。對長出的菌落進(jìn)行計數(shù)，或進(jìn)行DMC計數(shù)。在計數(shù)時，膜經(jīng)過適當(dāng)染色、沖洗和處理，能用顯微鏡觀察計數(shù)。但一張膜只能過濾少量的樣品勻液。1.3 膜過濾法膜過濾法3/14/20

6、22整理ppt14 1.3.1 1.3.1 直接熒光膜技術(shù)（直接熒光膜技術(shù)（DEFTDEFT）： 是熒光染色與熒光顯微技術(shù)的結(jié)合，是一種快速的食品微生物檢測技術(shù)。如用 5m尼龍膜過濾食品樣液，濾出液用2ml氚X100和 0.5ml 胰島素（用于溶解畜肉體的細(xì)胞、防膜被堵塞）處理，經(jīng)一段時間培養(yǎng)后，處理的濾出液用0.6m 孔的核聚碳酸酯膜過濾，然后濾膜用吖啶橙染色，對染色后的菌體進(jìn)行熒光顯微技術(shù)計數(shù)，將顯微計數(shù)器每一區(qū)域的平均數(shù)量相加得到每克細(xì)胞數(shù)，2530min 內(nèi)可得到結(jié)果。 可用于肉類和乳制品的計數(shù):用于乳制品計數(shù)時，其結(jié)果與SPC法和培養(yǎng)直接計數(shù)法的結(jié)果相似，此法在10min中內(nèi)可檢測出

7、乳制品中的活性G和全部G十菌，2min 可計算經(jīng)熱處理的乳制品中的微生物（數(shù)量少至5700cfu/ml）。3/14/2022整理ppt15 1.3.23.2 DEFTDEFT微菌落計數(shù)微菌落計數(shù)： 可用于細(xì)胞的直接顯微檢測，且用于活性細(xì)胞的檢測。食品勻液經(jīng)DEFT膜過濾，將膜放在培養(yǎng)基表面恒溫培養(yǎng)至微菌落長出。G-培養(yǎng)3h，G十培養(yǎng)6h，在8h內(nèi)可檢測到大腸桿菌、假單胞菌和葡萄球菌，且其數(shù)量少至103cfu/g，長出的微菌落必須用顯微鏡觀察。3/14/2022整理ppt16 1.3.33.3 防水網(wǎng)格過濾膜過濾技術(shù)防水網(wǎng)格過濾膜過濾技術(shù)： 是Sharpe和Michaud所發(fā)明，可用于各種食品中

8、的微生物檢測計數(shù)。所用膜為特殊的含有1600個臘質(zhì)網(wǎng)格的防水膜，每一格中限制微生物的生長和菌落大小。每個膜可通過MPN自動計數(shù)，此法可檢測的最小細(xì)胞數(shù)為10cfu/g，在24h 內(nèi)可得結(jié)果，可用于所有cfu的檢測?？捎脕頇z測大腸菌群、沙門氏菌、酵母菌、霉菌數(shù)。3/14/2022整理ppt171.3.4 干燥薄膜計數(shù)法干燥薄膜計數(shù)法 該方法是3M公司創(chuàng)立發(fā)展的，并設(shè)計了Perrifilm膜，將兩片塑料膜粘在一起，在一邊膜上涂布培養(yǎng)基成分和溶于冷水的凝膠劑，可以使用非選擇性培養(yǎng)基，并進(jìn)行好氧培養(yǎng)計數(shù)（APCs），若使用選擇性培養(yǎng)基則可檢測特殊菌群（如檢測大腸桿菌），此法是一種標(biāo)準(zhǔn)微生物計數(shù)法。 3

9、/14/2022整理ppt18 使用時，在兩片薄膜中間滴加一滴樣品稀釋液，通過擠壓將菌液分布在營養(yǎng)區(qū)，恒溫培養(yǎng)后，非選擇性培養(yǎng)薄膜的生長菌落呈紅色，因為在營養(yǎng)階段有四唑染料存在。檢測大腸桿菌的干燥培養(yǎng)基是采用葡糖苷酸酶作為基質(zhì)，使大腸桿菌菌落周圍呈藍(lán)色暈圈與其他菌落相區(qū)別開來，其結(jié)果與MPN法相似。3/14/2022整理ppt19 由Sharpe和Ki1ahy 所發(fā)明。 食品的勻液樣品與試管中巳熔融瓊脂（45OC）混合均勻并稀釋。每個樣品用3個瓊脂管，第一支試管中加入1mL樣品，混勻后，取1支滅菌的毛細(xì)吸管（最好1滴0.033mL）,吸取0.1mL 液體加入一無菌皿的底部，重復(fù)5次，并使5滴液

10、體成行排列。再用同一吸管在第1支試管中吸取1mL加入第2支試管中混勻，同前操作5滴液體排列在第二行；然后重復(fù)操作第三管，平皿中形成第三排5滴。將含有瓊脂滴的培養(yǎng)皿恒溫培養(yǎng)24h，然后在顯微鏡下觀察微菌落。用此法可檢測純培養(yǎng)物、蔬菜和肉制品中微生物，結(jié)果悄高于 SPC 法；但快速，24h 的結(jié)果同于SPC 法 48h 的結(jié)果，且此法不需空白稀釋液，每個樣品僅使用一個培養(yǎng)皿。 1.4 瓊脂滴計數(shù)法瓊脂滴計數(shù)法3/14/2022整理ppt20 1.5 顯微鏡菌落計數(shù)法顯微鏡菌落計數(shù)法 是對生長在載玻片上瓊脂培養(yǎng)基中的菌落進(jìn)行計數(shù)。 將2ml 熔融瓊脂培養(yǎng)基與2ml 熱牛奶混合，取0.1ml 涂布在4

11、cm2的載玻片上，置36士1培養(yǎng) 48h，再經(jīng)硫胺素藍(lán)染色后，在顯微鏡下觀察計數(shù)菌落。3/14/2022整理ppt211.6 稀釋搖管法：稀釋搖管法：它是稀釋倒平板法的一種變通形式 先將一系列盛有無菌瓊脂培養(yǎng)基的試管加熱使瓊脂熔化后冷卻并保持在50左右，將待分離的材料用這些試管進(jìn)行梯度稀釋，試管迅速搖動均勻，冷凝后，在瓊脂柱表面傾倒一層滅菌液體石蠟和固體石蠟的混合物，將培養(yǎng)基和空氣隔開。培養(yǎng)后，菌落形成在瓊脂柱的中間。進(jìn)行單菌落的挑取和移植時，需先用一支滅菌針將液體石蠟石蠟蓋取出，再用一支毛細(xì)管插入瓊脂和管壁之間，吹入無菌無氧氣體，將瓊脂柱吸出，置放在培養(yǎng)皿中，用無菌刀將瓊脂柱切成薄片進(jìn)行觀察

12、和菌落移植。3/14/2022整理ppt22 表面傾倒一層滅菌液體石蠟和固體石蠟的混合物用稀釋搖管法在瓊脂柱中形成的菌落照片（從右至左稀釋度不斷提高,分離厭氧菌用)瓊脂柱瓊脂柱單菌落單菌落稀釋搖管法稀釋搖管法3/14/2022整理ppt232.1 涂片染色法涂片染色法 顯微直接計數(shù)法（DMC）中最簡單的方法,將0.001mL樣品涂布在1cm2的載玻片上，然后固定，用適當(dāng)染料染色，然后油鏡觀察、計數(shù)。 1cm23/14/2022整理ppt24l優(yōu)點是，快捷、簡便，能對細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行分析，還可使用熒光技術(shù)增強(qiáng)其效果。l 缺點是，易造成操作人的疲勞，活性細(xì)胞和非活性細(xì)胞均被計數(shù)，食品顆粒與微生物不易區(qū)

13、分，微生物的細(xì)胞不易分散均勻。3/14/2022整理ppt252.2 2.2 一種改進(jìn)的載玻片法：一種改進(jìn)的載玻片法： 該法使用了四唑鹽， 即 2（p碘苯基3p硝基苯基）5苯基氯化唑（INT）。 操作時，將被檢樣品稀釋液放入經(jīng)過濾消毒的 INT 中在370C條件下水浴10min，然后經(jīng) 0.45m的膜過濾；濾膜在500C 干燥 10min，用棉子油覆蓋再觀察。 此法適用于細(xì)菌和酵母菌的純培養(yǎng)物。 酵母活性細(xì)胞經(jīng)吖啶橙（0.01%）染色后，用熒光顯微鏡觀察可看到桔紅色熒光，稱為吖啶橙直接計數(shù)法（AODC）。3/14/2022整理ppt26 2.3 血球計數(shù)板法血球計數(shù)板法3/14/2022整理p

14、pt27霍華德霉菌計數(shù)法霍華德霉菌計數(shù)法 這是1911年B.J.Howard在檢測番茄食品時使用的一種載玻片法。需使用一種特殊的載玻片以觀察霉菌的菌絲體，不適用于被粉碎的番茄食品。DEFT方法（直接熒光技術(shù)）也可用于蒸汽消毒和未經(jīng)蒸汽消毒的番茄食品的檢測，它可代替霍華德霉菌計數(shù)法。3/14/2022整理ppt28 此方法于1915年由McCrady發(fā)明，實質(zhì)為統(tǒng)計學(xué)方法，結(jié)果高于SPC，其可置信度為95%。 該法是采取一個樣品用3個稀釋液梯度，每個梯度的樣品稀釋液移至3（5）管裝有培養(yǎng)基（液體，即乳糖膽鹽發(fā)酵液）的試管中（共9或15管），經(jīng)培養(yǎng)和一些輔助措施證實后，查標(biāo)準(zhǔn)MPN表就可得到原樣品

15、中微生物數(shù)量，這又稱為“三步九管法”。3/14/2022整理ppt29 在估算樣品中活性微生物數(shù)量的過程中使用兩種染料亞甲基藍(lán)和刃天青。染色還原實驗中，冷樣品的上清液中添加任一種染料的標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加亞甲基藍(lán)從藍(lán)色還原為白色；添加刃天青從暗藍(lán)色還原為粉紅色或白色。染色還原的時間與樣品中微生物的濃度成反比。 刃天青還原檢測法在檢測熟肉制品時的效果優(yōu)于生肉，因生肉制品中存在一些還原物質(zhì)而影響刃天青的還原性能；在牛肉腐敗菌的快速檢測中，便用刃天青還原無色，進(jìn)行氣味檢測，SPC檢測等相結(jié)合效果極好。 3/14/2022整理ppt30 乳品工業(yè)中早就應(yīng)用了染色還原技術(shù)來檢測原料乳中的微生物質(zhì)量；優(yōu)點是簡便

16、、快捷和經(jīng)濟(jì)，且只有活細(xì)胞對染料有還原能力；缺點是，所有的微生物對染料的還原能力都不相同，故此法不適用于含有還原酶的食品，除非經(jīng)過特殊的處理（如熒光標(biāo)記）。3/14/2022整理ppt31如圖所示為一塊中間開口為1cm2的進(jìn)行棉拭涂抹取菌的金屬板（多為不銹鋼材質(zhì)）。 食品加工業(yè)中常用的食品表面微生物檢測技術(shù)有： 5. 1 棉拭和棉拭水方法：棉拭和棉拭水方法： 棉拭方法應(yīng)用最廣泛、最古老的方法，至今在醫(yī)院和旅館也常用此法。W.A.Manheimer 和 T.Ybanez 進(jìn)一步研制出棉拭水技術(shù)，此法需使用棉花或藻蛋白酸鈣。五、表層微生物的檢測五、表層微生物的檢測3/14/2022整理ppt32

17、檢測時，將滅菌后的模板置于檢測樣品的表面，暴露出的表面用滅過菌的潮濕的清洗物（棉花或藻蛋白酸鈣）徹底擦拭，然后將清洗物放入裝有稀釋液的試管或三角瓶內(nèi)（必要時在稀釋液中添加中和劑）。在稀釋液中的微生物通過適當(dāng)方法（如SPC法）進(jìn)行計數(shù)。 3/14/2022整理ppt33 當(dāng)使用棉花做清潔物時，微生物必須從纖維中分離出來，即應(yīng)充分振蕩，或用超聲儀的能量除去棉花中微生物； 當(dāng)使用藻蛋白酸鈣做清潔物時，用六甲基磷酸鈉將藻蛋白酸鈣進(jìn)行容解，使微生物懸浮于稀釋液中，此處理法的效果優(yōu)于前者。 棉拭水法用于食品和工具、設(shè)備表面微生物計數(shù)時，簡單、快捷、經(jīng)濟(jì)。3/14/2022整理ppt34 5.2 2 平板接

18、觸培養(yǎng)法：平板接觸培養(yǎng)法： 在平皿中傾注15.5-16.5ml的培養(yǎng)基，形成瓊脂平板，當(dāng)平板翻轉(zhuǎn)時，待檢食品表面與瓊脂平面接觸。此法由Gunderson于1945年提出，在1964年得到Hall 和Hartnett 改進(jìn)。當(dāng)檢測經(jīng)清洗劑清洗后的表面時，培養(yǎng)基中需添加中和劑（卵磷脂、吐溫80等）。與檢測表面接觸后，蓋上皿蓋，經(jīng)培養(yǎng)后，進(jìn)行菌落計數(shù)。 此法僅適用于微生物較分散的表面，而不適合污染嚴(yán)重的表面。3/14/2022整理ppt35 5.3 3 注射瓊脂與注射瓊脂與“瓊脂腸瓊脂腸”方法：方法： W.Litsky于1955年提出，此后進(jìn)一步改造完善。此法是將100ml 的注射器除去針頭，在其園

19、柱形空管中裝滿瓊脂，通過擠壓活塞將瓊脂涂布在檢測物表面，再將瓊脂層切下，放入培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，菌落計數(shù)。 由 Ten Cate 提出的“瓊脂腸”方法與之相似，但使用的是塑料管而不是經(jīng)改造的注射器，可用于檢測鮮肉表面和工具表面。 這兩種檢測方法所得結(jié)果常低于那些能將菌團(tuán)打散的方法。3/14/2022整理ppt365.4 其他表面分析方法：其他表面分析方法： 直接表面分析方法： 將熔融瓊脂傾注于檢測物表面，凝固后，將瓊脂層放入培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，計數(shù)菌落。 適用于表面活性微生物的檢測，如用于不銹鋼表面對生孢梭菌的內(nèi)生芽孢的檢測。黏性薄膜方法： Thomas發(fā)明，由Mossel等人成功應(yīng)用，是將黏性薄膜（如一

20、種稱為黏性帶的薄膜）貼在檢測物表面，再將接觸面緊貼于瓊脂平板，揭除薄膜后，培養(yǎng)，計數(shù)菌落。 在檢測木質(zhì)表面時其效果比棉拭方法差，用于鮮肉表面微生物計數(shù)時效果較好。 帶有培養(yǎng)基的塑料條可用于瓶子表面的微生物檢測。 3/14/2022整理ppt37 超聲儀：超聲儀： 超聲儀被用于表面污染微生物的檢測，但測試的表面積必須足夠的小而且可以移動，以保證測試面可裝入容器中且浸沒在液體內(nèi)。當(dāng)容器放入超聲儀中，能量使微生物分散到液體內(nèi)。以便采用相應(yīng)的其他方法進(jìn)行測數(shù)。撒布槍：撒布槍： 由 Clark 設(shè)計，是將沖洗液撒布在檢測表面，然后將液體接種平板上，使用該設(shè)備時需提供空氣壓力。在除去鮮肉表面的微生物時，此

21、法比棉拭方法更有效。 (2008.3.17.止)3/14/2022整理ppt38理、化、免疫理、化、免疫 學(xué)學(xué) 鑒鑒 測測 法法3/14/2022整理ppt39一、物理方法：一、物理方法： 1.1 1.1 阻抗及相關(guān)方法阻抗及相關(guān)方法： 早在1899年G.N.Stewart就提出了微生物的電阻抗的測量方法，但到0世紀(jì)70年代才得到應(yīng)用。 阻抗阻抗是電路中對交流電流的一種阻礙作用。當(dāng)微生物在培養(yǎng)基上生長時，它們代謝導(dǎo)電率低的物質(zhì)后可產(chǎn)生導(dǎo)電率高的物質(zhì)，因而使培養(yǎng)基的阻抗降低。 當(dāng)測量肉湯培養(yǎng)基的阻抗時，阻抗曲線與菌種和菌株有關(guān)，可以通過添加特殊生長抑制因子鑒定微生物。一些應(yīng)用的實例如下: 3/1

22、4/2022整理ppt40(1) 對蔬菜微生物計數(shù)的結(jié)果與平板計數(shù)結(jié)果一致，阻抗的測量需5，此法適用于奶油糕點、肉食等。(2) 用7的阻抗檢測時間(IDT)或更少，可得到巴氏消毒的牛奶中的微生物的數(shù)量，其結(jié)果與APC法相同。(3) 在啤酒釀造中，麥芽汁中酵母的生長使阻抗不斷升高，而細(xì)菌生長過程使阻抗逐漸降低。3/14/2022整理ppt41(4)、在生牛肉的檢測中，48個樣品IDT與 1g 細(xì)菌數(shù)量相反，回歸率為0.97，肉食品的 IDT 為 9。在另一研究中通過阻抗技術(shù)檢測鮮肉表面的微生物數(shù)量，當(dāng)細(xì)胞濃度為107cfu/ml或更高時，檢測可在2內(nèi)淮確地完成。(5)、在檢測冷凍濃縮桔子汁時，用

23、阻抗技術(shù)來區(qū)分微生物質(zhì)量合格的產(chǎn)品(104cfu/l)。依據(jù)細(xì)菌的斷流時間為10.2，酵母的斷流時間為15.8，468個樣品中有96被正確劃分。 3/14/2022整理ppt42(6)、在檢測牛肉中的大腸菌時，使用了特殊的培養(yǎng)基，用阻抗技術(shù)分析了70個樣品，79的結(jié)果與法結(jié)果相同，且在24內(nèi)可檢測到少于10021000cfu/的細(xì)胞數(shù)。 有一種新設(shè)備，不是運(yùn)用阻抗技術(shù)，但其結(jié)果與阻抗技術(shù)相似，該設(shè)備檢測微生物產(chǎn)生的光譜變化，并將其記錄下來作為光學(xué)單位與時間相對起來。3/14/2022整理ppt43 1.2 2 流動型血球細(xì)胞計數(shù)法流動型血球細(xì)胞計數(shù)法： 是用于懸浮液中細(xì)胞計數(shù)和各細(xì)胞特性檢測的

24、技術(shù)。其實質(zhì)是使懸浮細(xì)胞一個一個的經(jīng)流動槽到檢測器。射流裝置限定了經(jīng)過檢測器的細(xì)胞的流速和軌道，可檢測的細(xì)胞特性有熒光性、吸光性和光散射性。 通過使用流動分類器，可根椐各種細(xì)胞的特性將其分類，可以測量細(xì)胞的1-3種或更多球形特性。流動型血球計數(shù)器和細(xì)胞分類器，利用一種或更多種激發(fā)源如氬、氪、氦-氖離子激光以及熒光染料可以在1s內(nèi)檢測和鑒定幾千個細(xì)胞。當(dāng)使用一種染料時，它的激發(fā)光譜必須與激發(fā)源的光波長相匹配。3/14/2022整理ppt44 在檢測中兩種染料可聯(lián)合使用，例如在總蛋白和DNA含量的測定中，使用兩種染料。 兩種染料必須在同一波長下激發(fā)，散發(fā)不同的波長，使得每一染料的散射光可分別測量。

25、當(dāng)流動型血球細(xì)胞計數(shù)法與熒光標(biāo)記的抗體相聯(lián)合時，40in內(nèi)可以測到牛奶和雞蛋中的鼠傷寒沙門氏菌，靈敏度可達(dá)103cfu/ml。當(dāng)經(jīng)過6的非選擇性富集，牛奶中的檢測限度為10cfu/ml，雞蛋中為1cfu/l。3/14/2022整理ppt45 2.1 1 熱穩(wěn)定性核酸酶測定：熱穩(wěn)定性核酸酶測定： 通過檢測食品中的熱穩(wěn)定性核酸酶(DNAse)的含量可以精確計算出金黃色葡萄球菌的數(shù)量。因金黃色葡萄球菌的凝固酶與熱穩(wěn)定性核酸酶的產(chǎn)生有密切關(guān)系，特別是腸毒素產(chǎn)生菌株。3/14/2022整理ppt462.2 2.2 三磷酸腺苷（三磷酸腺苷（ATPATP）的測定）的測定： ATP是所有生命體的主要能源，它在

26、細(xì)胞死亡2h后消失，每個細(xì)胞中的ATP含量恒定，大約為1018-1017 mol/細(xì)胞，相應(yīng)的每105cfu含有104mol/L的ATP。 3/14/2022整理ppt47 在原核生物中，處于對數(shù)生長期的細(xì)胞的ATP含量為26nmol/mg細(xì)胞干重，在瘤胃細(xì)菌中，平均細(xì)胞質(zhì)含量為0.31g/細(xì)胞，在瘤胃的原生細(xì)胞中含量偏高，細(xì)胞中ATP的測量和提取方法，可用于各種微生物菌群。 一種簡單的ATP襝測法是利用熒火蟲的熒光素?zé)晒馑孛赶到y(tǒng)完成的。當(dāng)ATP存在時，熒光素酶發(fā)光，可用液體發(fā)光分光計和照度計測量。熒火蟲熒光色素酶的含量與ATP添加量成正比。 在醫(yī)學(xué)上實驗室進(jìn)行尿檢時，ATP法被作為襝測微生物

27、的一種快速方法。 食品中被用作肉制品的微生物檢測。3/14/2022整理ppt482.3 2.3 輻射測量法：輻射測量法： 以14C標(biāo)記培地中的可代謝物質(zhì)為基礎(chǔ)，微生物在利用這些物質(zhì)時有14CO釋放，再利 用放射能計數(shù)器檢測。 當(dāng)檢測利用葡萄糖的微生物時，通常使用14C-葡萄糖； 當(dāng)檢測不利用葡萄糖的微生物時， 則使用14C-甲酸鹽或1C-谷氨酸鹽。3/14/2022整理ppt49在處理過程中使用50mL有蓋的血清藥瓶，內(nèi)裝12-36L含巳標(biāo)記的可代謝物的培養(yǎng)基。藥瓶中可作好氧條件也可充入氣體而形成厭氧條件，然后接種樣品。藥瓶中的預(yù)留空間可用于檢測14CO的存在。檢測14CO2所須時間與食品中

28、微生物的含量成反比。3/14/2022整理ppt502.4 2.4 熒光和發(fā)光法：熒光和發(fā)光法： 在食品微生物的培養(yǎng)基中使用的發(fā)光和熒光物質(zhì)有 1)、4-methylumbelliferyl-D-葡苷酸（MUG）； 2)、4-methylumbelliferyl-D-半乳糖苷（MUGal）； 3)、4-bromo-4-氯-3-indolyl-D-葡糖苷酸（X- GLUC)； 4)、o-nituophenyl-D galactopyranoside （OMPG） 5)、5-bromo-4-氯-3-indolyl-D-gluvuronide （BCIG）； 6)、L-alanine-p-nitro

29、anilide（LAPN）3/14/2022整理ppt51 前 3 種物質(zhì)可產(chǎn)生熒光基質(zhì)，后種為發(fā)光基質(zhì)。均可在平板培養(yǎng)基、MPN肉湯和膜過濾方法中使用。MUG應(yīng)用最廣泛，它被-D-葡糖苷酸酶水解釋放出有熒光的-甲基-umbelliferyl部分在長波長紫外光下可檢測。大腸桿菌是GUD的主要生產(chǎn)菌。MUG廣泛用于檢測大腸桿菌的培地中。某些沙門氏菌和棒狀菌也是GUD的生產(chǎn)菌。 在檢測大腸桿菌的平板培養(yǎng)基中，添加X-GLUC物質(zhì)500l/L，培養(yǎng)24h內(nèi)大腸桿菌產(chǎn)藍(lán)色，但無熒光。 ONPG被用于檢測水中是否存在大腸桿菌時，如有則試管中培養(yǎng)液成黃色。 3/14/2022整理ppt52 BCIG 可使

30、大腸桿菌菌落成藍(lán)色（用100l/L十二烷基tryptose瓊脂培養(yǎng)基，在350C下培養(yǎng)2h，然后在44.50C培養(yǎng)2224h），而其他微生物不顯藍(lán)色。 LAPN 用于G一的檢測時,是氨肽酶作用于此物質(zhì)。酶切 L-丙氨酸-硝基苯胺 形成 p-硝基苯胺，此黃色物質(zhì)可通過分光光度計在390 nm 檢測。3/14/2022整理ppt53 3.1 3.1 血清學(xué)方法：血清學(xué)方法： 被廣泛應(yīng)用于G-的檢測，如大腸菌和沙門氏菌。在G中，血清學(xué)方法對李斯特氏菌屬的檢測極重要。血清學(xué)方法的實質(zhì)是用特殊抗體鑒定同源抗原。 如沙門氏菌（始于940年），用于分類鑒定時，其主要抗原種類有3類：體細(xì)胞（菌體或O）抗原（暴

31、 露于細(xì)胞表面的O多糖側(cè)鏈，目前巳知的有2324種，其熱穩(wěn)定性很好）；抗原（莢膜部分，熱穩(wěn)定性較差）；抗原（在鞭毛的不同位點上，熱穩(wěn)定性較差）。李斯特氏菌有15種O抗原，5種H抗原。3/14/2022整理ppt543.2 3.2 噬菌體類型：噬菌體類型： 是以噬菌體和它的寄主細(xì)菌之間的特殊關(guān)系為基礎(chǔ)的，人們可以用巳知的噬菌體鑒定其特定的寄主細(xì)胞。所有的食品病原體都可用噬菌體方法鑒定。 大多數(shù)噬菌體的溶菌光譜很廣，這表明這些微生物的受點較普遍。由于沒有溶菌型和血清型同時存在的可能性，O型抗原的決定物質(zhì)和噬菌體受點結(jié)構(gòu)并不相同。 大多數(shù)噬菌體的溶菌光譜很廣，這表明這些微生物的受點較普遍。由于沒有溶

32、菌型和血清型同時存在的可能性，O型抗原的決定物質(zhì)和噬菌體受點結(jié)構(gòu)并不相同。3/14/2022整理ppt553.3 3.3 基因（基因（DNADNA）探針技術(shù)：）探針技術(shù)： 用某微生物的某段DNA序列檢測同源DNA或RNA序列。實驗中DNA必須與研究菌株發(fā)生雜交，探針含有編碼特殊產(chǎn)物的基因序列。探針DNA必須通過某種方法進(jìn)行標(biāo)記以觀察雜交是否發(fā)生。常用放射性同位素作為標(biāo)記物，如32P、H、125I、14C，其中常用32P。 常用的指示物有堿式磷酸酯酶、過氧化酶、熒光素、半抗原、生物素、毛地黃毒苷。當(dāng)使用生物素時，要用抗生物蛋白酶、抗生素、發(fā)光素來檢測。 探針技術(shù)的典型應(yīng)用是用限制性核酸酶來制備未

33、知DNA的片段。經(jīng)過電泳分離得到DNA片段，然后轉(zhuǎn)移至纖維素硝酸鹽過濾膜，與標(biāo)記探針雜交。經(jīng)過小心沖洗除去末反應(yīng)的探針，通過自動射線攝影術(shù)分析放射性標(biāo)記物。3/14/2022整理ppt56 菌落雜交中用DNA探針技術(shù)，是將目的微生物富集于薄膜上，然后將膜放在瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，使微生物菌落直接在薄膜上形成。原平板的復(fù)制品形成復(fù)制平板，在復(fù)制平板薄膜上生長的菌落被直接溶解，釋放出核酸，將DNA轉(zhuǎn)為單鏈。一些DNA被轉(zhuǎn)移至硝酸鹽纖維素濾膜，同標(biāo)記DNA或RNA探針雜交。傳統(tǒng)的DNA菌落雜交技術(shù)得到了改進(jìn)，每一個濾膜可供48個微生物使用，總共可使用60個濾膜。3/14/2022整理ppt57 3.4

34、DNA 3.4 DNA 擴(kuò)增法（擴(kuò)增法（PCR PCR 多聚酶鏈反應(yīng)）：多聚酶鏈反應(yīng)）： 由 Kleppe 等人在1971年首先提出，它在食品微生物鑒定中廣泛應(yīng)用。目前應(yīng)用最多的是由Perkim Elmer-Cetus Corp 的科學(xué)家改進(jìn)的技術(shù)。 L.B.Mullis 因此而在1993年得到了諾貝爾化學(xué)獎。 PCR（polymerase chain reaction，多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）是以DNA的一條鏈為模板，在多聚酶的催化下，通過堿基配對使寡核苷酸引物向3 方向延長合成模板的互補(bǔ)鏈。3/14/2022整理ppt58 PCR 包括3個反應(yīng)過程：雙鏈DNA變性（90950C）成為單鏈DNA、引

35、物復(fù)性（37600C）同單鏈 DNA互補(bǔ)序列結(jié)合、DNA 聚合酶催化（70750C）使引物延伸。如此經(jīng)過2530次循環(huán)，產(chǎn)生大量待擴(kuò)增的特異性 DNA 片段，足夠用于進(jìn)一步實驗和分析。 此技術(shù)中應(yīng)用了熱穩(wěn)定性多聚酶和5，-及3，寡核苷酸引物，經(jīng)一套擴(kuò)增技術(shù)循環(huán)將一個單分子擴(kuò)增降到107分子。然后將擴(kuò)增經(jīng)瓊脂糖凝膠電脈或與放射標(biāo)記或非標(biāo)記探針進(jìn)行southern雜交。3/14/2022整理ppt593.5 3.5 多位點酶電泳方法（多位點酶電泳方法（MEEMEE）：）： 通過檢測一套水溶性胞內(nèi)酶的電泳遷移率關(guān)系來估測各微生物菌株在菌種范圍內(nèi)的遺傳關(guān)系。菌種的等位基因和遺傳變化引起電泳遷移率的變化

36、。由于同一菌種的不同菌株的一些酶具有不同的電泳遷移率，MEE可用于流行病學(xué)中菌株的鑒定。3.6 3.6 限制酶分析法：限制酶分析法： 將研究菌體的染色體 DNA 用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶降解，酶使雙鏈 DNA 在特定核苷酸位點斷開。使用最廣泛的限制性內(nèi)切酶為EOORI（從大腸桿菌中得到），它可以識別 DNA 中的GAATTC堿基序列，并使GA斷開； 另一種內(nèi)切核酸酶是Ehal（從流感嗜血菌中得降到），可識別GYPyPuAC（Py表示任意嘧啶，Pu表示任意嘌呤），Hhal的作用位點為PyPu，它在流行病單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的研究中有重要作用。3/14/2022整理ppt603.7 3.7 隨機(jī)擴(kuò)增

37、多態(tài)隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNADNA技術(shù)（技術(shù)（RAPDRAPD）：）： 這是運(yùn)用 PCR 技術(shù)得到隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài) DNA，然后經(jīng)電泳作用得到相應(yīng)的圖譜。將細(xì)胞富集懸浮于水中，溶解得到DNA。將10單位的引物和 DNA、Tag多聚酶混合，在不斷變化的溫度中重復(fù)PCR循環(huán)40多次，然后將產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳。 用溴化乙錠染色，形成的帶形圖譜經(jīng)攝影分析。純化的 DNA 不需要RAPD分析也不需要事先得知序列數(shù)據(jù)。RAPD中熱循環(huán)30次時間1.0h，從菌落生長開始降到得降到分析結(jié)果大約需要3h。 大量的研究者將 RAPD 用于單核細(xì)胞增生李斯特氏菌菌株的指紋圖譜分析。3/14/2022整理ppt61 3.8

38、 8 脈沖場凝膠電泳（脈沖場凝膠電泳（PFGEPFGE）：）： 需用一種或多種限制性酶將染色體DNA 降解，通過逆向電泳將限制性片段分離，并使片段在瓊脂糖凝膠上溶解。傳統(tǒng)的凝膠電泳中，電泳方向為一個方向，PFGE 與此相反。 PFGE的脈沖時間從1100s不斷變化，這要由電泳分子的大小決定。交流電場使電泳分子改變電泳方向，電泳圖譜是脈沖型的。此方法巳用于食品中一些病原體的指紋鑒定。 1994年用此法鑒定出太平洋西北部暴發(fā)的出血性腸炎中的大腸桿菌暴發(fā)性和偶發(fā)性菌株O157:H7為不同菌體。3/14/2022整理ppt623.9 3.9 限制長度多態(tài)片段技術(shù)（限制長度多態(tài)片段技術(shù)（RFLPRFLP

39、）：）： DNA限制長度多態(tài)片段是用限制性內(nèi)切核酸酶溶解DNA時產(chǎn)生的不同長度的DNA片段。細(xì)胞內(nèi)的DNA被限制性內(nèi)切核酸酶降解，然后經(jīng)過電泳分離，與一個DNA探針發(fā)生Southern雜交與MEE方法相結(jié)合，此法可檢測鮮牛乳和非乳制品中的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌菌株。3/14/2022整理ppt633.10 核酸方法：核酸方法： 從細(xì)胞中提取DNA，用內(nèi)切核酸酶如EcoRI降解，然后通過瓊脂糖凝膠電泳將片段分離。分離得到的片段轉(zhuǎn)移降到尼龍膜和適當(dāng)?shù)臉?biāo)記cDNA探針雜交，探針來自逆轉(zhuǎn)錄酶作用的rRNA，然后記錄化學(xué)發(fā)光圖譜。 現(xiàn)已用的自動核酸型分析系統(tǒng)可同時處理8個樣品。3/14/2022整理ppt64 4.1 1 熒光抗體法（熒光抗體法（FAFA）：）： 創(chuàng)立于1942年。將抗體與熒光物質(zhì)相結(jié)合而帶有熒光，當(dāng)抗體與抗原發(fā)生反應(yīng)時，抗體抗原體系發(fā)出熒光，通過熒光顯微鏡可以觀察。熒光標(biāo)記物常為若丹、熒光異氰酸鹽、熒光異硫代氰酸鹽。 FA技術(shù)可用兩種方