淋巴細(xì)胞分離實驗知識講解

1、淋巴細(xì)胞分離實驗原原 理理n外周血各種血細(xì)胞的密度不盡相同，外周血各種血細(xì)胞的密度不盡相同，利用淋巴細(xì)胞分層液利用淋巴細(xì)胞分層液（Ficoll）作作密度梯度離心密度梯度離心，使一定比重的細(xì)胞，使一定比重的細(xì)胞群按相應(yīng)密度梯度分布，從而將各群按相應(yīng)密度梯度分布，從而將各種血細(xì)胞加以分離。種血細(xì)胞加以分離。 原原 理理外周血外周血紅細(xì)胞紅細(xì)胞粒細(xì)胞粒細(xì)胞單個核細(xì)胞單個核細(xì)胞血小板血小板淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞單核細(xì)胞單核細(xì)胞1.0931.0301.0351.0751.090Ficoll：1.0770.001 (PBMC)1.0921500rpm, 20 , 30minPBMC紅細(xì)胞紅細(xì)胞粒細(xì)胞粒細(xì)胞Fic

2、oll稀釋外周血Ficoll稀釋的血漿、稀釋的血漿、血小板血小板實驗步驟實驗步驟n1.采血，稀釋采血，稀釋 （外周血：稀釋液外周血：稀釋液=1：2）n2.在離心管中加入在離心管中加入Ficoll，沿傾斜的，沿傾斜的管壁緩緩加入稀釋的外周血管壁緩緩加入稀釋的外周血 （Ficoll：稀釋血：稀釋血=1：2）實驗步驟實驗步驟n3.20，1500r/min，離心離心30minn4.沿管壁周緣沿管壁周緣輕輕吸取輕輕吸取PBMC層移入層移入另一試管中另一試管中實驗步驟實驗步驟n5.加足量稀釋液加足量稀釋液充分洗滌充分洗滌，1800 r/min離心離心10min ，棄上清，棄上清n6.重復(fù)洗滌一次，重復(fù)洗滌

3、一次，1400r/min離心離心10min，棄上清棄上清n7.適量的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞適量的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞 ，計數(shù)，計數(shù)試劑和儀器試劑和儀器n淋巴細(xì)胞分層液（淋巴細(xì)胞分層液（Ficoll，低溫避光保，低溫避光保存），存），Hanks液，液，RPMI1640，PBS，小，小牛血清，華氏管，牛血清，華氏管，50ml離心管，離心管，2ml（5ml）吸管，水平離心機）吸管，水平離心機注意事項注意事項n1.每毫升外周血液大約可獲每毫升外周血液大約可獲1 110106 6單個核細(xì)胞單個核細(xì)胞 n2.Ficoll應(yīng)適量，外周血應(yīng)充分稀釋應(yīng)適量，外周血應(yīng)充分稀釋 n2.溫度直接影響到溫度直接影響到Ficoll的比

4、重和分離效果的比重和分離效果 n3.在在Ficoll上加入稀釋外周血時，應(yīng)緩慢加，上加入稀釋外周血時，應(yīng)緩慢加，以免沖散界面以免沖散界面 n4. 吸取單個核細(xì)胞層時，應(yīng)避免吸出過多的上吸取單個核細(xì)胞層時，應(yīng)避免吸出過多的上清液或分層液而導(dǎo)致血小板污染清液或分層液而導(dǎo)致血小板污染細(xì)胞計數(shù)細(xì)胞計數(shù)n試劑和儀器試劑和儀器n實驗步驟實驗步驟n注意事項注意事項試劑和儀器試劑和儀器n血球計數(shù)板，蓋玻片，血球計數(shù)板，蓋玻片，Hanks液，液，RPMI1640，2ml（5ml）吸管，華氏）吸管，華氏管，移液尖，微量移液器，顯微鏡管，移液尖，微量移液器，顯微鏡 實驗步驟實驗步驟n1、準(zhǔn)備計數(shù)板、準(zhǔn)備計數(shù)板：n2

5、、制備細(xì)胞懸液、制備細(xì)胞懸液：收集細(xì)胞，制成單個細(xì)胞：收集細(xì)胞，制成單個細(xì)胞懸液懸液n3、加樣、加樣：用吸管輕輕吹打細(xì)胞懸液，取少許：用吸管輕輕吹打細(xì)胞懸液，取少許細(xì)胞懸液，在計數(shù)板上蓋玻片的一側(cè)加微量細(xì)細(xì)胞懸液，在計數(shù)板上蓋玻片的一側(cè)加微量細(xì)胞懸液，胞懸液，n4、計數(shù)、計數(shù)：在顯微鏡下，用：在顯微鏡下，用10物鏡觀察計數(shù)物鏡觀察計數(shù)板四角大方格中的細(xì)胞數(shù)板四角大方格中的細(xì)胞數(shù) 實驗步驟n5、計算計算：將結(jié)果代入下式，得出細(xì)胞密度 細(xì)胞數(shù)細(xì)胞數(shù)/毫升原液毫升原液 =（4大格細(xì)胞數(shù)之和大格細(xì)胞數(shù)之和/4）104注意事項n1.取樣計數(shù)前，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液取樣計數(shù)前，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液 n2.加樣量不要溢出蓋玻片，也不要過少或帶加樣量不要溢出蓋玻片，也不要過少或帶氣泡氣泡n3.細(xì)胞壓中線時，數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右細(xì)胞壓中線時，數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右 n4.本法要求細(xì)胞密度不低于本法要求細(xì)胞密度不低于104細(xì)胞細(xì)胞/mln5.鏡下計數(shù)時，細(xì)胞數(shù)過少或過多，說明稀鏡下計數(shù)時，細(xì)胞數(shù)過少或過多，說明稀釋不當(dāng)，需重新制備細(xì)胞懸液、計數(shù)釋不當(dāng)，需重新制備細(xì)胞懸液、計數(shù)實驗要求實驗要求n華氏管中加入血樣后，用記號筆作好標(biāo)記n實驗完畢后，請清洗試管、吸管和計數(shù)板試驗報告要求n試驗內(nèi)容