王亞文——白假絲酵母菌臨床分離株的病性及耐藥結(jié)果分析

1、1 1王亞文王亞文 20082008級級 臨床五年制臨床五年制 2 2 一、立項依據(jù)與設(shè)計思路一、立項依據(jù)與設(shè)計思路 二、技術(shù)路線與方案二、技術(shù)路線與方案 三、可行性與創(chuàng)新性三、可行性與創(chuàng)新性3研究對象研究對象白假絲酵母菌白假絲酵母菌菌群失調(diào)菌群失調(diào)機體免疫力降低機體免疫力降低異位定植異位定植白假絲酵白假絲酵母菌感染母菌感染4臨床難題臨床難題 診斷難，作為正常寄生菌，診斷難，作為正常寄生菌，致病性的檢測具有重要意致病性的檢測具有重要意義，現(xiàn)有的檢測方法耗時義，現(xiàn)有的檢測方法耗時耗力。耗力。治療難，耐藥菌住的產(chǎn)生。治療難，耐藥菌住的產(chǎn)生。 5研究進(jìn)展研究進(jìn)展 1粘附因子粘附因子2酸性蛋白酸性蛋白

2、酶酶Candida Candida A Albicanslbicans aciacid d P Proteinaseroteinase 3形態(tài)及表形態(tài)及表型轉(zhuǎn)換型轉(zhuǎn)換6實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康尿炞C白假絲酵母菌的酸性蛋白酶活力作為驗證白假絲酵母菌的酸性蛋白酶活力作為致病性的評價指標(biāo)的可行性。致病性的評價指標(biāo)的可行性。了解本地區(qū)藥物敏感情況，希望指導(dǎo)臨了解本地區(qū)藥物敏感情況，希望指導(dǎo)臨 床用藥。床用藥。 7 7 二、二、 技術(shù)路線與方案技術(shù)路線與方案8實驗設(shè)計思路實驗設(shè)計思路收集、分離、鑒定收集、分離、鑒定致病性研究致病性研究藥敏試驗藥敏試驗1.收集標(biāo)本2.菌落培養(yǎng)3.涂片鏡檢4.顯色培養(yǎng)1.1.蛋白酶活

3、力實驗蛋白酶活力實驗2.2.粘附性實驗粘附性實驗藥物敏感試驗9病原菌分離、培養(yǎng)、鑒定病原菌分離、培養(yǎng)、鑒定白假絲酵母菌收集臨床標(biāo)本120例轉(zhuǎn)種至顯色培養(yǎng)基35培養(yǎng) 48h，依菌落顏色鑒定鏡下可見G+性圓或橢圓形酵母菌，有時可見芽管分離菌落，格蘭染色，高倍鏡檢觀察菌落形態(tài)，有酵母樣念珠菌生長為培養(yǎng)陽性。標(biāo)本接于沙保弱培養(yǎng)基35培養(yǎng)24 72hA A、B B分為分為 假絲酵母菌菌落假絲酵母菌菌落C C、D D分為高倍鏡下假絲酵母菌及其厚膜孢子分為高倍鏡下假絲酵母菌及其厚膜孢子 初步形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果初步形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果B11 菌落呈翠綠色為白假絲酵母菌，粉紅色為克柔氏假絲酵母菌菌落呈翠綠色為白假絲酵母菌

4、，粉紅色為克柔氏假絲酵母菌 ，灰藍(lán)色為熱帶，灰藍(lán)色為熱帶 念珠菌念珠菌 。 80 80株假絲酵母菌中分離出白假絲酵母菌株假絲酵母菌中分離出白假絲酵母菌5959株，構(gòu)成比最高為株，構(gòu)成比最高為73.373.3圖圖5 念珠菌顯色培養(yǎng)結(jié)果念珠菌顯色培養(yǎng)結(jié)果12產(chǎn)酶培養(yǎng)基37下培養(yǎng)24h恢復(fù)產(chǎn)酶活力菌苔出現(xiàn)一個透明圈，測量菌落及其周圍透明環(huán)直徑。37下培養(yǎng)48h菌懸液 10l點種于YGM-牛奶培養(yǎng)基酸性蛋白酶活力實驗酸性蛋白酶活力實驗1313白假絲酵母菌產(chǎn)酶率為白假絲酵母菌產(chǎn)酶率為100%,100%,其中高活力株其中高活力株68%68%，中活力株，中活力株20%,20%,低活力株低活力株占占12%12

5、%R=R=透明環(huán)直徑透明環(huán)直徑/ /菌落直徑菌落直徑R3R3為高活力，為高活力，2R32R3為中活力，為中活力，R2R2為低活力為低活力圖圖6 6 酸性蛋白酶實驗結(jié)果酸性蛋白酶實驗結(jié)果14 小鼠尾靜脈注射0.2ml菌懸液，對照組注射等量生理鹽水小鼠死后做病理切片組織研磨液培養(yǎng)。密切觀察小鼠生存情況，記錄小鼠生存時間菌株經(jīng)YEPD肉湯活化配制為1.8108/ml菌懸液健康小鼠隨機分4組 空白對照組、高中低活力組動物實驗步驟動物實驗步驟15動物實驗結(jié)果動物實驗結(jié)果圖7 鼠腎研磨液培養(yǎng)菌落小鼠腎臟組織研磨液涂片小鼠腎臟組織研磨液涂片白假絲酵母菌涂片白假絲酵母菌涂片圖8 鼠腎研磨液顯色培養(yǎng)圖9 小鼠腎

6、、肺、脾病理鏡下形態(tài)1616死亡率平均生存時間（天）高活力組100%1中活力組75%3低活力組25%8空白對照組0白假絲酵母菌的蛋白酶活力與其致病性呈正相關(guān)白假絲酵母菌的蛋白酶活力與其致病性呈正相關(guān)(p0.01)(p0.01)表表1 1 四組小鼠的死亡率與平均生存時間四組小鼠的死亡率與平均生存時間1717藥敏試驗藥敏試驗制霉菌素制霉菌素兩性霉素兩性霉素B B氟康唑氟康唑酮康唑酮康唑伊曲康唑伊曲康唑18藥敏試驗結(jié)果藥敏試驗結(jié)果 1 1圖10 同一菌株對5種抗真菌藥物的不同反應(yīng)判讀標(biāo)準(zhǔn)：判讀標(biāo)準(zhǔn)：抑菌環(huán)直徑抑菌環(huán)直徑19mm 19mm 為敏感為敏感14mm 14mm 為耐藥為耐藥 1919藥敏試驗結(jié)果藥敏試驗結(jié)果 2 220三、可行性與創(chuàng)新性三、可行性與創(chuàng)新性21可行性與創(chuàng)新性可行性與創(chuàng)新性 實驗結(jié)果提示在一定范圍內(nèi)酸性蛋白酶實驗結(jié)果提示在一定范圍內(nèi)酸性蛋白酶可以作為評價白假絲酵母菌致病性的指標(biāo)?？梢宰鳛樵u價白假絲酵母菌致病性的指標(biāo)。牛奶平板法檢測酸性蛋白酶活力具有簡單，牛奶平板法檢測酸性蛋白酶活力具有簡單，省時，經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點，適于在基層醫(yī)院推廣省時，經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點，適于在基層醫(yī)院推廣使用。