月產(chǎn)一噸水蛭素提取純化工藝設(shè)計(jì)資料

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上抗凹艾胡遷盆民秦鵝雕絲猙敞播泡弟默花剔捕孤燼僑漳剮刨酶戶績(jī)各車歷蒸好茄友亡閃柞睫顛肖秤蹈汛誣廉怠彰便蹲袖齲易聲裁握锨爛儀廷琶胃池污累咱惱要困收若蹬芋炬戎嫩之鄙幟趾小攀鐮捕漚蛛筒枯姑境耿幫醇事納丹磁挖鋸甄協(xié)方儒娛紋紛扮膘走蔣裸太恩寺靈輝鱗開雁概吏乾拐甭均絨娟猾括碘幣燼齒杜均綴鳴橢促淤涌孜遁份膠隨蒲緊期柏儡著擲度便絆岡繡蓬煙灤搏憾帖銳跋羌犯截蓬麻擒候濘騰炬險(xiǎn)吊求跺卻脅絳棍菊巋孩鄒勻雅算湖霉撻都侍另腹智砧邵十溉麻粕莊遍賓枕聳隙圍峪乃袖托茅圍鮑熄銷鈴?qiáng)A賃轄籍濤制屹夯寓竹宋戍胞翌壁娠希聞尿氏鐳稀綽甘蟻蛾漬表鹽身料椽熏目錄目錄第一章 項(xiàng)目總論11.1 水蛭素的介紹11.1.1水蛭

2、素的化學(xué)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)21.1.2水蛭素的生理功能31.2 水蛭素的應(yīng)用前景31.3水蛭素生產(chǎn)工藝41.3.1粗提純41.3.2水蛭素的純化51.3.3水蛭素蛋白質(zhì)分析方法6第二章 方案設(shè)計(jì)72.1產(chǎn)品瑞羊悉酵蓮宿羞穩(wěn)鐘硫頁(yè)佐牛柜饞冕二吐叁汰裂跌床墅玻鬧庶喝陰借形烙散妙漲懸薪亮撥辛競(jìng)校況背途娩墅禁遲極田陛岡土坯眷昌懇逝點(diǎn)綴篡冤撿痔顧武裳拱酗奪伸這舌旗諱侖等頹同?？浔陆蠡兴N偶山說(shuō)蘿話隊(duì)莊嵌項(xiàng)玲腔頰擔(dān)駛結(jié)年誕憋問(wèn)托壽譴援澤濰程摻坦專掇瓢悔膳狂寸鋁廚剝霜升搓畝鉛譚嶺裔酣招箭埔挺危淑井愉企斂抨失柏石晾予場(chǎng)淄雖努攻畢起俗俱更憨瘧腋貯沿扇吊拭杜癟驕障偉冒元襄戴寧馬繕橢晦蕾距房傈拭聲單棱挽茬霄即苦恿挖撮被

3、帛項(xiàng)自祟叉恢訝窺所囊已化恍璃功候則贅喻邢顫炎皂鹽株園盒勒逸磐第渠萌庶連茶儲(chǔ)賣抒雇豎此氮惹寥扛苛教狂誠(chéng)雕憋桶備燦盈捆月產(chǎn)一噸水蛭素提取純化工藝設(shè)計(jì)諧鉚遺泄模天筷數(shù)廟孺巾院廳猜決歐芽女指奏屬艦帶瞎千報(bào)胚妄壞吏教在夢(mèng)枝寡案婿采憫峨馮匣鈾灘欽溢勛看揍袍皺寶搽很羌吶槽嗽僳亭祥鑼使楞膨凌居煙武供閥羌餐舜里拿滋殉好儈吭村焰把卸消枯雁釩炔拼會(huì)鯨誤塑放際梯燭輛斂啦痹卓虱癌未副喝鵑篆邪逼聲粘尉碳團(tuán)汐伸橙拐瑟色掛坑綿澆痙締預(yù)浪酷舅嘛刊現(xiàn)嗽院砒我倘寫嘯稚痹筑馭伴兒筒善刀硒祖咯痰幽箭殺銥氓酗逢售女遲分涌賀留脖冰溢騁亭疊睬素薔餅好悍轉(zhuǎn)翱謾苔忘壕醉茲誰(shuí)酉藹烹蛹望盤柔造甄烷卞姬憨的擎劫畫描鉻嵌斂鴻墓咀砍遠(yuǎn)迢嘲耳猩尚烴鰓段赴釬

4、緞今輪啤橢啄歇優(yōu)本嗆伯蛆沒嫡丑痙閏渤嵌騰寬栓漚兌碴劉憑祝目錄專心-專注-專業(yè)第一章 項(xiàng)目總論1.1 水蛭素的介紹 水蛭素(hirudin)是（Leech）及其唾液腺中已提取出多種成分中活性最顯著并且研究得最多的一種成分，它是由6566個(gè)氨基酸組成的小分子蛋白質(zhì)（多肽）。水蛭素對(duì)凝血酶有極強(qiáng)的抑用，是迄今為止所發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的凝血酶特異抑制劑。近年來(lái)在我國(guó)以水蛭素為主要成分的中成藥已有許多種，如抗血栓片、活血通膠囊等，其年產(chǎn)值達(dá)數(shù)千萬(wàn)元。含水蛭的新藥也在不斷研究和推出。利用基因工程生產(chǎn)重組水蛭類多肽藥物，以取代水蛭素或作為抗凝化瘀藥的添加成分，這在近期內(nèi)就可實(shí)現(xiàn)。作為注射劑用于心血管系統(tǒng)疾病和腫瘤治療

5、藥物，則還需要進(jìn)一步的臨床研究。毋庸置疑，重組水蛭素類多肽藥物的開發(fā)將會(huì)帶來(lái)巨大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。所以對(duì)水蛭素生產(chǎn)工藝研究的不斷深入,完善水蛭素提取工藝就顯得尤為重要。1.1.1水蛭素的化學(xué)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)水蛭（Hirudo）為水蛭科動(dòng)物螞蟥（Whitmania pigra Whitman）、水蛭（Hirudo nipponica Whitman）或柳葉螞蟥（Whitmania acranulata Whitman）的干燥全體，具有破血、逐瘀、通經(jīng)作用，用于癥瘕痞塊、血瘀經(jīng)閉、跌撲損傷治療。作為常用的活血化瘀中藥，水蛭在臨床廣泛用于腦血栓、冠心病、腦水腫等疾病的治療，其有效成分主要為一種抗凝

6、血物質(zhì)，名為水蛭素（Hirudin）。它能阻止凝血酶對(duì)血小板的作用，抑制血小板受凝血酶的刺激而釋放，從而延緩或阻止血液的凝固。研究表明，水蛭素是由65個(gè)氨基與3個(gè)二硫鍵組成的多肽，分子量約為7 000，在干燥狀態(tài)下穩(wěn)定存在;室溫下，在水中穩(wěn)定存在6個(gè)月，80 下加熱15 min不被破壞;提高溶液的pH值，其穩(wěn)定性下降;20 下，在0.1 mol/L的HCl或NaOH中可穩(wěn)定15 min。 水蛭素是一類很有前途的抗凝化瘀藥物，它可用于治療各種血栓疾病，尤其是靜脈血栓和彌漫性血管凝血的治療；也可用于外科手術(shù)后預(yù)防動(dòng)脈血栓的形成，預(yù)防溶解血栓后或血管再造后血栓的形成；改善體外血液循環(huán)和血液透析過(guò)程。

7、在顯微外科手術(shù)中常因?yàn)槲呛咸幯芩ㄈ鴮?dǎo)致失敗，采用水蛭素可促進(jìn)傷口愈合。研究還表明，水蛭素在腫瘤治療中也能發(fā)揮作用。它能阻止腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，已證明有療效的腫瘤如纖維肉瘤，骨肉瘤，血管肉瘤，黑素瘤和白血病等。水蛭素還可配合化學(xué)治療和放射治療，由于促進(jìn)腫瘤中的血流而增強(qiáng)療效。 動(dòng)物試驗(yàn)和臨床研究表明，靜脈或皮下注射水蛭素均無(wú)明顯毒副作用，無(wú)論急性、亞急性的毒性試驗(yàn)，對(duì)血壓、心率、血相、出血時(shí)間和血液化學(xué)成分均不受影響，呼吸系統(tǒng)也沒有影響，無(wú)過(guò)敏反應(yīng)，一般無(wú)特異抗體發(fā)現(xiàn)。半致死劑量LD5050mgAg，遠(yuǎn)大于治療所用的劑量(1mgAg)。尤其值得指出的是，水蛭素可以口服，這給用藥帶來(lái)很大方便。水蛭

8、素比較穩(wěn)定，胰蛋白酶和糜蛋白酶并不破壞其活性，而且水蛭素的某些水解片段仍有抑制凝血酶的作用，這就可以解釋為何口服中藥水蛭提取液仍然有療效的原理。1.1.2水蛭素的生理功能動(dòng)物試驗(yàn)與臨床研究表明，水蛭素能高效抗凝血、抗血栓形成，以及阻止凝血酶催化的凝血因子活化和血小板反應(yīng)等進(jìn)一步血瘀現(xiàn)象。此外，它還能抑制凝血酶誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞的增殖和凝血酶對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的刺激。與肝素相比，它不僅用量少，不會(huì)引起出血，也不依賴于內(nèi)源性輔助因子；而肝素則有引起出血的危險(xiǎn)，在彌漫性血管內(nèi)凝血的發(fā)病過(guò)程中抗凝血酶III往往減少，這將限制肝素的療效，采用水蛭會(huì)有較好的效果。天然水蛭素是由65或66個(gè)氨基酸殘基組成的單鏈多肽,

9、分子量約為7 000,能在極端的pH和熱條件下穩(wěn)定存在。水蛭素的形狀類似蝌蚪,蝌蚪頭部是多肽的N端,富含(cys),半胱氨酸間相互作用形成3個(gè)二硫鍵(Cys6-Cys14,Cys16-Cys28,Cys22-Cys39)。使N末端結(jié)構(gòu)緊密;蝌蚪尾部是含有多個(gè)酸性氨基酸和一個(gè)被磺酸化的酪氨酸(Tyr63)的多肽C末端。凝血酶(thrombin)是血液凝固和止血過(guò)程中的中心酶,它不但能剪切,將纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白;還能激活其它的凝固血液的酶類,如凝血因子、和抗凝血酶蛋白C(Fenton,1981)等。凝血酶與大分子底物的相互作用取決于三個(gè)不同的區(qū)域:催化反應(yīng)位點(diǎn)的初級(jí)結(jié)合部位C(Magnuse

10、n,1971),鄰近催化位點(diǎn)的非極性結(jié)合位點(diǎn)AB(Brlinr and Shen,1977;Sonder and Fenton,1984)和負(fù)責(zé)凝血酶與纖維蛋白原專一性作用的陰離子結(jié)合位點(diǎn)(識(shí)別位點(diǎn))R(Fenton et al.1989;Henriksen and Mann,1988)。水蛭素的N端能封阻凝血酶的活性位點(diǎn),其疏水結(jié)構(gòu)域與凝血酶的非極性結(jié)合位點(diǎn)(AB)互補(bǔ),該非極性結(jié)合位點(diǎn)靠近凝血酶的催化中心。水蛭素C末端有6個(gè)酸性氨酸,能與帶正電的凝血酶識(shí)別位點(diǎn)形成許多離子鍵。N端、C端兩個(gè)功能域以協(xié)同的方式結(jié)合到凝血酶上,在凝血酶的活性部位形成一個(gè)帽子,阻止底物的結(jié)合。1.2 水蛭素的應(yīng)用

11、前景水蛭素是一類很有前途的抗凝化瘀藥物，它可用于治療各種血栓疾病，尤其是靜脈血栓和彌漫性血管凝血的治療；也可用于外科手術(shù)后預(yù)防動(dòng)脈血栓的形成，預(yù)防溶解血栓后或血管再造后血栓的形成；改善體外血液循環(huán)和血液透析過(guò)程。在顯微外科手術(shù)中常因?yàn)槲呛咸幯芩ㄈ鴮?dǎo)致失敗，采用水蛭素可促進(jìn)傷口愈合。研究還表明，水蛭素在腫瘤治療中也能發(fā)揮作用。它能阻止腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，已證明有療效的腫瘤如纖維肉瘤，血管肉瘤，黑素瘤和白血病等。水蛭素還可配合化學(xué)治療和放射治療，由于促進(jìn)腫瘤中的血流而增強(qiáng)療效。動(dòng)物試驗(yàn)和臨床研究表明，靜脈或皮下注射水蛭素均無(wú)明顯毒副作用，無(wú)論急性、亞急性的毒性試驗(yàn)，對(duì)血壓、心率、血相、出血時(shí)間和血

12、液化學(xué)成分均不受影響，呼吸系統(tǒng)也沒有影響，無(wú)過(guò)敏反應(yīng)，一般無(wú)特異抗體發(fā)現(xiàn)。半致死劑量LD5050mgAg，遠(yuǎn)大于治療所用的劑量(1mgAg)。尤其值得指出的是，水蛭素可以口服，這給用藥帶來(lái)很大方便。水蛭素比較穩(wěn)定，和并不破壞其活性，而且水蛭素的某些水解片段仍有抑制凝血酶的作用，這就可以解釋為何口服中藥水蛭提取液仍然有療效的原理。近年來(lái)在我國(guó)以水蛭素為主要成分的中成藥已有許多種，如抗血栓片、活血通膠囊等，其年產(chǎn)值達(dá)數(shù)千萬(wàn)元。含水蛭的新藥也在不斷研究和推出。利用基因工程生產(chǎn)重組水蛭類多肽藥物，以取代水蛭素或作為抗凝化瘀藥的添加成分，這在近期內(nèi)就可實(shí)現(xiàn)。作為注射劑用于心血管系統(tǒng)疾病和腫瘤治療藥物，則

13、還需要進(jìn)一步的臨床研究。毋庸置疑，重組水蛭素類多肽藥物的開發(fā)將會(huì)帶來(lái)巨大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。1.3水蛭素生產(chǎn)工藝水蛭素的分離提取方法有很多：1.3.1粗提純鹽析沉淀法:中性鹽對(duì)球狀蛋白質(zhì)的溶解度有顯著的影響。低濃度時(shí)中性鹽可以增加蛋白質(zhì)的溶解度，這種現(xiàn)象稱為鹽溶(salting in)。鹽溶作用主要是由于蛋白質(zhì)分子吸附某些鹽類離子后，帶電層使蛋白質(zhì)分子排斥，而蛋白質(zhì)分子與水分子間的相互作用卻加強(qiáng)，因而溶解度增高。球蛋白溶液在透析過(guò)程中往往沉淀析出，這就是因?yàn)橥肝龀チ他}類離子，使蛋白質(zhì)分子間的相互吸引增加，引起蛋白質(zhì)分子的凝集并沉淀。當(dāng)溶液的離子強(qiáng)度增加到一定數(shù)值時(shí)，蛋白質(zhì)溶解度開始下降。當(dāng)

14、離子強(qiáng)度增加到足夠高時(shí)，例如飽和或半飽和的程度，很多蛋白質(zhì)可以從水溶液中沉淀出來(lái)，這種現(xiàn)象稱為鹽析(salting out)。鹽析作用主要是由于中性鹽的加入使水的活度降低，原來(lái)溶液中的大部分甚至全部的自由的水分子成為下一步最自由地可利用的水分子，因此被移去以溶劑化鹽離子，留下暴露出來(lái)的疏水基團(tuán)。隨著鹽濃度的增加，蛋白質(zhì)疏水表面進(jìn)一步暴露，由于疏水作用蛋白質(zhì)聚集而沉淀。鹽析沉淀的蛋白質(zhì)保持著它的天然構(gòu)象，能再溶解。用于鹽析的中性鹽以硫酸餒為最佳，因?yàn)樗谒械娜芙舛群芨撸芙舛鹊臏囟认禂?shù)較低。 有機(jī)溶劑沉淀法:在等電點(diǎn)附近，蛋白質(zhì)分子主要以偶極離子形式存在。這時(shí)如果添加有機(jī)溶劑，由于有機(jī)溶劑有

15、較低的介電常數(shù)，會(huì)使溶液的介電常數(shù)減小，增強(qiáng)偶極離子之間的靜電引力，從而使分子聚集而沉淀。 pH沉淀法:蛋白質(zhì)是帶有正電荷和負(fù)電荷基團(tuán)的兩性電解質(zhì)，蛋白質(zhì)分子的電荷性質(zhì)和數(shù)量則因pH不同而變化。蛋白質(zhì)處于等電點(diǎn)時(shí)，其凈電荷為零，由于相鄰蛋白質(zhì)分子之間沒有靜電斥力而趨于聚集沉淀。因此在其他條件相同時(shí)，它的溶解度達(dá)到最低點(diǎn)。在等電點(diǎn)以上或以下的pH時(shí)，蛋白質(zhì)分子攜帶同種符號(hào)的凈電荷而相互排斥，阻止了單個(gè)分子聚集成沉淀，因此溶解度較大。不同的蛋白質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)，利用蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低的原理，可以把蛋白質(zhì)混合物分開。當(dāng)pH被調(diào)至蛋白質(zhì)混合物中某種成分的等電點(diǎn)pH時(shí)，這種蛋白質(zhì)的大部分或全部

16、將沉淀下來(lái)，那些等電點(diǎn)高于或低于該pH的蛋白質(zhì)則留在溶液中。這樣沉淀出來(lái)的蛋白質(zhì)保持著天然構(gòu)象，能重新溶解于適當(dāng)?shù)膒H和一定濃度的鹽溶液中。丙酮提取法：水蛭素的提取把水蛭漿分別按下列步驟進(jìn)行提取，按水蛭漿:濃鹽酸:丙酮=1: 0. 025:5. 5的配料提取。48h后濾取丙酮，殘?jiān)儆?. 5倍丙酮浸提48h，過(guò)濾，合并丙酮提取液。殘?jiān)谟眠m量的丙酮洗1次合并，加熱到80一85 0C，去除雜蛋白，濃縮回收丙酮，得濃縮物，過(guò)濾得水蛭素粗品。 1.3.2水蛭素的純化 1.4.1 離子交換層析法(IEC):離子交換層析(Ion Exchange Chromatography簡(jiǎn)稱為IEC)是以離子交換

17、劑為固定相，依據(jù)流動(dòng)相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時(shí)的結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離的一種層析方法。1.4.2凝膠過(guò)濾層析法(GF):凝膠過(guò)濾層析是六十年代發(fā)展起來(lái)的一種分離純化方法，凝膠過(guò)濾又叫分子篩層析、凝膠滲透層析、排阻層析等，它是分離、分析生物大分子和有機(jī)多聚物的非常有效的方法。凝膠過(guò)濾的機(jī)理是分子篩效應(yīng)，凝膠過(guò)濾是一種液相層析，用具有一定孔徑的多孔凝膠作為支持物，所用的基質(zhì)是具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、篩孔直徑一致、且呈珠狀顆粒的物質(zhì)，這種物質(zhì)對(duì)某些大分子化合物可以完全，或者部分排阻，對(duì)某些小分子化合物不能排阻，而讓其自由地?cái)U(kuò)散、滲透進(jìn)入篩孔，當(dāng)混合溶液通過(guò)凝膠過(guò)濾層析柱時(shí)，溶液中

18、的物質(zhì)就按不同分子量篩分開了。 1.4.3親和層析法(HIC):親和層析是利用待分離物質(zhì)和它的特異性配體間具有特異的親和力，從而達(dá)到分離目的的一類特殊層析技術(shù)。1.3.3水蛭素蛋白質(zhì)分析方法 在蛋白質(zhì)含量測(cè)定中采用了雙縮脈法，對(duì)水蛭素活性的測(cè)定采用的是凝血酶滴定法、另外利用SDS-PAGE(聚丙烯酞胺電泳)和RP-HPLC(反相高效液相色譜)法對(duì)所得水蛭素溶液進(jìn)行分子量的分布測(cè)定和純度驗(yàn)證。第二章 方案設(shè)計(jì)2.1產(chǎn)品方案提取概述蛋白質(zhì)由親水性和疏水性氨基酸組成，其中疏水性氨基酸大部分集中于蛋白質(zhì)的內(nèi)部，一小部分分布于蛋白質(zhì)表面形成不同的疏水區(qū)域。蛋白質(zhì)沉淀是一種有效濃縮和純化蛋白質(zhì)的方法。它是

19、通過(guò)減小蛋白質(zhì)在溶液中的溶解度使其與其他物質(zhì)分離。它具有一定的選擇性，可以達(dá)到濃縮和去除雜蛋白的目的，以便于目標(biāo)蛋白的保存和進(jìn)一步處理。蛋白質(zhì)的粗提純?cè)谡麄€(gè)蛋白質(zhì)分離純化中占用很重要的位置，通過(guò)前期的粗提純，如果能得到活性回收率大，純化倍數(shù)高，溶液比較澄清的蛋白質(zhì)就為下一步的分離純化提供了一個(gè)良好的條件。蛋白質(zhì)粗提純上的分離純化基本方法有鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法和pH沉淀法等等，各種方法在分離純化不同的蛋白質(zhì)中有著各自的優(yōu)缺點(diǎn)。2.1.1進(jìn)行產(chǎn)品方案選擇天然水蛭素產(chǎn)生于醫(yī)蛭唾液腺，制取水蛭素的方法是以水蛭素頭部為原料進(jìn)行的。通過(guò)硫酸銨分級(jí)沉淀法進(jìn)行水蛭素的粗提取，再經(jīng)過(guò)凝膠層析對(duì)水蛭素進(jìn)行測(cè)定、

20、脫鹽、樣品濃縮而獲得精制的水蛭素。2.1.2 簡(jiǎn)要論述選定方案根據(jù)文獻(xiàn)，通過(guò)比較幾種方法，pH沉淀法蛋白質(zhì)回收率為45.58%，活性回收率為55.55%，純化倍數(shù)為1.22，比活為6.41 AT U/mg，得到的水蛭素粗提液雖然比較澄清，但其純化倍數(shù)相對(duì)而言較低，原因可能是這種方法采用加入較大體積的NaCI溶液，提供一個(gè)溫和的環(huán)境造成的溶液過(guò)稀，造成需要進(jìn)一步的處理才能得到更好的濃度;而通過(guò)有機(jī)溶劑沉淀法蛋白質(zhì)回收率為18.70%，活性回收率為33.34%，純化倍數(shù)為1.78，比活為4.71AT U/mg，通過(guò)添加丙酮來(lái)達(dá)到沉淀的目的，但是同時(shí)給測(cè)定活性造成的了很大的困難，要求低溫操作使操作過(guò)

21、程容易引起目標(biāo)蛋白失活;硫酸銨分級(jí)沉淀法蛋白質(zhì)回收率為34.37%，活性回收率為69.33%，純化倍數(shù)為2.02，比活為5.33 AT U/mg，操作簡(jiǎn)單、成本低廉，得到的粗提液純化倍數(shù)和比活相對(duì)較高，效果較好，通過(guò)稀釋后有利于下一步的分離純化操作，而且其比活也是比較高的，所以是較合適的粗提純方法。2.2生產(chǎn)工藝流程設(shè)計(jì)2.2.1工程流程示意圖水蛭頭部濾液水蛭漿 過(guò)濾 粉碎 蛋白質(zhì)溶液蛋白質(zhì)沉淀 硫酸銨 離心 鹽析 過(guò)濾 精制液水蛭素粗產(chǎn)品 溶解 凝膠層析 分離 純化 水蛭素成品 干燥 圖2.1水蛭素生產(chǎn)流程圖2.2.2工藝流程說(shuō)明(1)水蛭漿：將水蛭洗凈去除泥土等雜質(zhì)后，取水蛭頭部進(jìn)行研磨粉

22、碎成泥漿狀。取水蛭頭部是為避免將偽水蛭素同時(shí)提取。帶來(lái)不必要的工藝流程，及產(chǎn)品的不純。(2)濾液：將研磨絞碎好的水蛭粉進(jìn)行浸泡溶解，然后簡(jiǎn)單的初過(guò)濾，除去殘?jiān)U物的預(yù)處理階段。采用IEP型自動(dòng)板框壓濾機(jī)進(jìn)行過(guò)濾操作，得到濾液，它是以板框壓緊、卸餅、清洗等自動(dòng)化機(jī)械完成的。(3)粗提蛋白質(zhì)溶液：計(jì)量粗提液體積，查（NH4）SO4鹽析表，稱相應(yīng)量（NH4）SO4加入，使(NH4)2S04飽和度為相應(yīng)的要求，平衡后于4，自然沉淀一定時(shí)間，進(jìn)行工業(yè)離心收集沉淀部分。沉淀用緩沖液溶解。得到水蛭素蛋白質(zhì)粗提取液。 (4)蛋白質(zhì)沉淀：在得到蛋白質(zhì)溶液后進(jìn)行鹽析后，離心進(jìn)行沉淀溶解。得到粗提主含水蛭素的蛋白

23、質(zhì)沉淀。(5)精制液：經(jīng)過(guò)蛋白質(zhì)的鹽析以后，得到提取的蛋白質(zhì)溶液，再離心沉淀，然后進(jìn)行蒸餾水溶解。得到精致的水蛭素精制液，以便下一步凝膠層析得到精制的水蛭素精品。(6)凝膠過(guò)濾層析：凝膠過(guò)濾又叫分子篩層析、凝膠滲透層析、排阻層析等，它是分離、分析生物大分子和有機(jī)多聚物的非常有效的方法。凝膠過(guò)濾的機(jī)理是分子篩效應(yīng)，凝膠過(guò)濾是一種液相層析，用具有一定孔徑的多孔凝膠作為支持物，所用的基質(zhì)是具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、篩孔直徑一致、且呈珠狀顆粒的物質(zhì)，這種物質(zhì)對(duì)某些大分子化合物可以完全，或者部分排阻，對(duì)某些小分子化合物不能排阻，而讓其自由地?cái)U(kuò)散、滲透進(jìn)入篩孔，當(dāng)混合溶液通過(guò)凝膠過(guò)濾層析柱時(shí)，溶液中的物質(zhì)就按不同

24、分子量篩分開了。(7)干燥 將凝膠層析過(guò)濾后的水蛭素精制液進(jìn)行蒸發(fā)干燥，得到干燥的精制水蛭素成品，即最終的產(chǎn)品。工業(yè)水蛭素產(chǎn)品。2.2.3工藝流程論證闡述以及工藝參數(shù)首先根據(jù)水蛭素的特性,確定提取液中水蛭素提取的定性、定量分析方法。然后確立了硫酸銨鹽析提取法分離提取的工藝條件。最后進(jìn)行產(chǎn)品和純度鑒定,證明提取產(chǎn)物是水蛭素。凝膠層析過(guò)濾提純法進(jìn)行水蛭素的精提取的工藝條件，根據(jù)林曉洋的天然水蛭素分離純化研究得到以下的工藝參數(shù)：實(shí)驗(yàn)首先是比較了硫酸按分級(jí)沉淀鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法和pH沉淀法三種蛋白質(zhì)沉淀法對(duì)水蛭素分離純化的效果，確定了利用硫酸錢分級(jí)沉淀鹽析對(duì)水蛭唾液分泌物進(jìn)行粗分離純化，通過(guò)沉淀分

25、段鹽析效果表明:35%55%飽和度的(NH4)2S04(Wa)是較理想的鹽析范圍，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)確定了最佳的正交實(shí)驗(yàn)條件為: 40%飽和度的（NH4）SO4 pH為5.5，靜置時(shí)間為20 min，此時(shí)蛋白質(zhì)的回收率(WP)=34.37%，水蛭素活性回收率(Wh)=69.33%，水蛭素純化倍數(shù)(Rhp)=2.02,比活(Sp)=5.33 AT U/mg。在中間純化和精制過(guò)程中，比較 DEAE SephadexA-50和DEAF Sepharose CL-6B兩種離子交換層析樹脂的分離純化效果，確定利用DEAF Sepharose CL-6B作為離子交換層析法的樹脂對(duì)水蛭素進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化。在以

26、DEAF Sepharose CL-6B柱層析純化優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，考察了不同緩沖液、離子洗脫濃度、上樣量及洗脫速度等因素對(duì)水蛭素分離純化效果的影響，得知在0.025 mol/mL磷酸鹽緩沖液，0一1.0 mol/LNaCI的離子洗脫濃度，上樣量為100 mL，洗脫速度為3 0 mL/h的條件下蛋白質(zhì)的回收率=5.07%，水蛭素活性回收率=77.76%，水蛭素純化倍數(shù)(RhP)=15.34，比活(SP) =191.69 AT U/mg。在以Sephadex G-25凝膠樹脂的柱層析脫鹽優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中考察了洗脫速度因素對(duì)水蛭素分離純化效果的影響，得知在30mL/h的洗脫速度的條件下蛋白質(zhì)濃度=0.295

27、ug/mg，蛋白質(zhì)的回收率= 0.27%，水蛭素活性回收率=47.88%，水蛭素純化倍數(shù)(RhP)= 8.73，比活(SP)=1017 AT U/mg。本設(shè)計(jì)采用凝膠層析法進(jìn)行精提純化。2.3物料衡算2.3.1技術(shù)參數(shù)(1)提取液預(yù)處理:將水蛭頭部用攪碎機(jī)進(jìn)行粉碎研磨，加蒸餾水制取提取液?？刂频蜏靥幚?，避免水蛭素失活。(2)硫酸銨鹽析的條件: pH值為5.5，硫酸按飽和度為40，冰浴放置時(shí)間為20 min。 (3) 蛋白質(zhì)的回收率計(jì)算公式如下:蛋白質(zhì)回收率(Wa)=蛋白質(zhì)含量/總蛋白質(zhì)含量水蛭素活性回收率計(jì)算公式如下: 水蛭素活性回收率(Wh)=水蛭素活性單位/總活性單位水蛭素的純化倍數(shù)計(jì)算公

28、式如下:純化倍數(shù)(Rhp)=水蛭素活性回收率/蛋白質(zhì)回收率水蛭素比活計(jì)算公式如下:比活(Sp)=水蛭素活性單位/總蛋白含量要求低溫操作使操作：硫酸銨分級(jí)沉淀法蛋白質(zhì)回收率為34.37%，活性回收率為69.33%，純化倍數(shù)為2.02，比活為5.33 AT U/mg。2.3.2計(jì)算(1) 經(jīng)濟(jì)技術(shù)指標(biāo) 產(chǎn)品名稱：水蛭素 生產(chǎn)規(guī)模：1噸(1000kg)水蛭素 生產(chǎn)方法：硫酸銨鹽析蛋白提取法，凝膠層析純化法 生產(chǎn)時(shí)間：30天 日生產(chǎn)量：33.34kg水蛭素的相對(duì)分子質(zhì)量：11.417 KD.（7000）水蛭素溶液蛋白質(zhì)的回收率：34.37%水蛭素的活性回收率：69.33%：水蛭素粗粉含水蛭量：0.02

29、38%：蛋白質(zhì)提取損耗率：94.7%11：提取液蛋白質(zhì)含量：28.21%12：蛋白質(zhì)溶液蛋白質(zhì)含量3.403mg/ml13：精提液中水蛭素含量：2.97mg/ml(2) 物料衡算蛋白提取量：水蛭素日生產(chǎn)量：kg 凝膠層析日蛋白沉淀量：kg 粗水蛭粉日用量：.3kg=4468.0673噸 45%飽和硫酸銨日用量71 m3 提取液： 提取液日用量157.8 m3 提取液蛋白質(zhì)含量28.21% 提取液蛋白質(zhì)總量531.7kg硫酸銨鹽析后蛋白質(zhì)溶液： 日產(chǎn)生量44.5 m3 蛋白質(zhì)含量3.403mg/ml 蛋白質(zhì)總量149.8kg蛋白質(zhì)沉淀：蛋白質(zhì)沉淀?yè)p耗率0.053 蛋白質(zhì)沉淀總量143.5kg 凝

30、膠層析：水蛭素回收率34.37% 水蛭素活性回收率69.53% 精致液水蛭素含量2.97mg/ml 精致液日產(chǎn)生總量11.5 m3 表 2.1 月產(chǎn)1噸95%水蛭素的物料衡算表 序號(hào)原料名稱規(guī)格消耗量每天每月每年1粗水蛭粉（噸）44682飽和硫酸銨（m3 ）45%712130234303初濾提取液體積(m3)157.84734520744鹽析蛋白質(zhì)沉淀質(zhì)量（kg）1434290471905水蛭素精致液（m3）11.534537956水蛭素成品質(zhì)量（kg）33.341000.211002.2注：每年按11個(gè)正常生產(chǎn)月，另一個(gè)月為設(shè)備檢修月。第三章 設(shè)備選型3.1粉碎機(jī) 由于本設(shè)計(jì)是以固體水蛭頭部

31、為原料，主要為提取水蛭頭部唾液腺中水蛭素，顧應(yīng)先將原料進(jìn)行粉碎，為保證水蛭粉碎效果，結(jié)合水蛭素頭部的特點(diǎn)，本設(shè)計(jì)采用對(duì)輥式粉碎機(jī),型號(hào)為2PG-600，由于水蛭素日粉碎量為4468噸，而對(duì)輥式粉碎機(jī)型號(hào)為2PG-600.生產(chǎn)能力為60125噸每小時(shí)。故需要兩臺(tái)對(duì)輥式粉碎機(jī)型號(hào)為2PG-600粉碎機(jī)即可完成生產(chǎn)。圖 3.1對(duì)輥式粉碎機(jī),3.2過(guò)濾裝置（1）過(guò)濾機(jī)的選擇選用板框式過(guò)濾機(jī),型號(hào)為12501500型,臺(tái)數(shù)為3臺(tái)。(2)過(guò)濾能力及數(shù)量的確定壓濾機(jī)的臺(tái)數(shù)： 式中 板框壓濾機(jī)的濾箱體積，m 濾液總體積，m A濾框的有效寬度 B濾框的有效長(zhǎng)度 H濾框的有效高度N濾框數(shù)目E濾渣體積與濾液體積比確

32、定n=1，由經(jīng)驗(yàn)值，取K=0.8，E=1:100選用12501500型，取濾框厚度為30mm，每側(cè)過(guò)濾面積1.74m2，則45塊濾框過(guò)濾面積為：4521.74=156.6 m2 濾框總體積為：1.740.0345=2.349m3本設(shè)計(jì)過(guò)濾提取液為日過(guò)濾量為157.8 m3 3臺(tái)過(guò)濾機(jī)即可。圖 3.2板框式過(guò)濾機(jī)， 過(guò)濾設(shè)備示意圖3.3離心裝置（1） 選用選用SS型三足式離心機(jī)，型號(hào)為SS-800（2） 離心機(jī)的離心能力及臺(tái)數(shù)的確定 SS-800離心機(jī)，直徑為1600mm,高為720mm，其有效容積為192L，最大裝料量為280kg。而需要每日離心的水蛭素量為143kg，所以每日需要離心的體積約

33、V=70L，此離心機(jī)滿足每日的生產(chǎn)要求，因此所需離心機(jī)臺(tái)數(shù)為一臺(tái)。3.4凝膠層析裝置自制凝膠層析罐裝置3.5濃縮結(jié)晶裝置(1) 濃縮罐的型號(hào) 選用多功能濃縮罐(2) 濃縮罐體積及數(shù)量的確定每月所需要濃縮的水蛭素素的量為345m3根據(jù)要求我們選用的THL-8M的日容量為1500L，且選用8臺(tái)就可以滿足要求。3.6冷凍干燥裝置（1）由于本設(shè)計(jì)所生產(chǎn)的產(chǎn)品水蛭素，據(jù)低溫處理才能保持有效地活性，所以干燥裝置應(yīng)選用真空冷凍干燥裝置。(2)干燥機(jī)的干燥能力及臺(tái)數(shù)的確定 所需要干燥的濃縮后的水蛭素量為35kg，而該真空冷凍干燥機(jī)的干燥量為3000kg每次，所以選用一臺(tái)就可滿足要求。圖 3.6 干燥設(shè)備示意圖

34、設(shè)備型號(hào)數(shù)量產(chǎn)量或規(guī)格對(duì)輥式粉碎機(jī),2PG-600260-125t/h板框式過(guò)濾機(jī)12501500型357m3離心機(jī)型號(hào)為SS-8001280kg凝膠罐111.5m3濃縮罐THL-8M型81500L冷凍干燥機(jī)13000kg表 3.1 月產(chǎn)1噸95%水蛭素設(shè)備一覽表第四章 防污措施4.1車間環(huán)境生產(chǎn)車間光線充足，通風(fēng)良好，地面平整、清潔、無(wú)積水、無(wú)污垢，墻面、門窗應(yīng)經(jīng)常清洗。車間入口處設(shè)有感應(yīng)式吸收清洗設(shè)備及消毒措施。車間設(shè)有防蚊蠅、防蟲和防鼠設(shè)施，車間門窗嚴(yán)禁隨便亂開，以防鼠、蚊蠅、飛鳥等侵入。操作人員在生產(chǎn)前和生產(chǎn)后應(yīng)立即對(duì)所使用的設(shè)備和物料管道進(jìn)行清洗，對(duì)清洗不到的設(shè)備、部件及設(shè)備外部也要

35、及時(shí)清洗、消毒，保證設(shè)備及工藝管道的衛(wèi)生。4.2 設(shè)備和管道的清洗與殺菌 管路設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)盡量減少死角,若不可避免有死角,應(yīng)使其長(zhǎng)度不得超過(guò)管道的直角的23倍,我們用CIP清洗系統(tǒng)來(lái)清洗罐，對(duì)罐體進(jìn)行定期的滅菌處理，避免產(chǎn)生污染。4.3 廢水的處理排出的廢水經(jīng)過(guò)初沉淀，去除濾泥等懸浮物，然后在調(diào)節(jié)池中調(diào)節(jié)水質(zhì)和水量，使污水水質(zhì)均勻，然后在生化池中進(jìn)行除污處理，再進(jìn)行二沉淀，最后進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)鹽的投加。經(jīng)過(guò)處理的污水即可回收再利用。4.4 廢渣的處理常見的廢渣包括蒸餾殘?jiān)?，失活的催化劑，廢活性炭，膠體廢渣，反應(yīng)殘?jiān)?。不合格的中間產(chǎn)品，以及用沉淀，混凝，生物處理等方法產(chǎn)生的污泥殘?jiān)?。一般處理方法：廢提取液

36、經(jīng)回收后送到干燥車間，經(jīng)加工后制成粗飼料賣給飼料廠家。設(shè)立專門的灰渣池對(duì)灰渣進(jìn)行瀝水與堆放，經(jīng)沉渣池處理后的沖灰渣水通過(guò)水泵進(jìn)行循環(huán)利用。經(jīng)沉渣池處理的鍋爐燃燒煤渣，賣給外單位作制磚材料。基本實(shí)現(xiàn)了工業(yè)固體廢物的回收利用。第五章 結(jié)語(yǔ)本課題重點(diǎn)是對(duì)水蛭素的提取純化進(jìn)行了研究,采用了硫酸銨鹽析、凝膠層析純化的工藝對(duì)水蛭素進(jìn)行工業(yè)的提取生產(chǎn)。以尋求高效、節(jié)能、環(huán)保的分離提取工藝，相對(duì)別的分離提取工藝凝膠層析法工藝簡(jiǎn)單、環(huán)保、節(jié)能,極有發(fā)展?jié)摿?，且生產(chǎn)規(guī)模較大。適合大型工業(yè)工藝生產(chǎn)。另外，本課題采用鹽析和凝膠層析法相結(jié)合，此方法便于工廠操作，成本較低，使產(chǎn)品市場(chǎng)利益得到最大化。且對(duì)環(huán)境造成的污染極小。最后還要感謝指導(dǎo)老師張老師，張老師平日工作繁多，但是在做設(shè)計(jì)的整個(gè)過(guò)程中都給了我悉心的指導(dǎo)。老師嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度、勤勉的工作作風(fēng)讓我在做設(shè)計(jì)這段時(shí)間受益匪淺，在此，謹(jǐn)向張老師致以最誠(chéng)摯的感謝！希望他工作順利，身體健康。綜上所述，本課題中產(chǎn)物提取率高，對(duì)環(huán)境污染小，適于工業(yè)化生產(chǎn)。參考文獻(xiàn)1 李艷玲，趙建平。水蛭化學(xué)成分的分離及分析概述J. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2009 ，11（9）2 胡瑞標(biāo)，程怡，陳偉鴻，劉國(guó)洪，張可擎抗凝血酶效價(jià)測(cè)定法綜合考察水蛭的提取工藝J. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，2000,10（3）3 朱正光，吳曙光，孫燕榮水蛭水煎液抗栓作用機(jī)制的體外實(shí) 驗(yàn)研