高產(chǎn)谷氨酸產(chǎn)生菌的工藝研究

1、高產(chǎn)谷氨酸產(chǎn)生菌的工藝研究Study on technology of high yielding glutamic acid producing strains 13生工楊雅嫻前言 工業(yè)發(fā)酵研究和開發(fā)的主要目標(biāo)之一是建立一種能實現(xiàn)高產(chǎn)、低成本的可行過程，生產(chǎn)條件優(yōu)化是改進(jìn)現(xiàn)有菌種產(chǎn)量的重要方法。本文對發(fā)酵法生產(chǎn)谷氨酸的試驗流程進(jìn)行優(yōu)化，探討發(fā)酵生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵影響因素，發(fā)現(xiàn)谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)中，溶解氧水平是發(fā)酵生產(chǎn)的限制瓶頸，也是得到高產(chǎn)谷氨酸的關(guān)鍵因素之一。因為低溶氧更有利于產(chǎn)乳酸，乳酸產(chǎn)量增加將直接導(dǎo)致谷氨酸產(chǎn)量減少。試驗以糖質(zhì)原料為出發(fā)，結(jié)合谷氨酸產(chǎn)量跟蹤，確定了菌株由“生長型”轉(zhuǎn)化為“生

2、產(chǎn)型”的時間，從而確定了“分瓶”培養(yǎng)的方法。發(fā)酵前期注重菌體的生長培養(yǎng)，發(fā)酵后期減少液體量以增大溶解氧來進(jìn)一步提高谷氨酸產(chǎn)量。通過這種培養(yǎng)，得到一套較為完整的谷氨酸搖瓶發(fā)酵的方案。同時，對發(fā)酵過程中培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，得到較好的谷氨酸產(chǎn)量。 Industrial fermentation research and development one of the main objectives is to establish which can realize high yield, low cost feasible process, optimization of production

3、conditions is important for improved strains of existing production methods. This article to optimize the testing process of the glutamic acid production by fermentation, explores the key influencing factors of fermentation found in glutamate fermentation, the level of dissolved oxygen is the limit

4、of production bottlenecks, is also one of the key factors of high yielding glutamic acid. Due to low dissolved oxygen is more conducive to production, will lead directly to an increase in production of glutamic acid production of lactic acid. Experiments with sugar raw material based on the combinat

5、ion of glutamic acid production tracking, strains were determined by "growing" into "production" time, so as to determine the "bottle" method of training. Fermentation early focus on bacterial growth, late fermentation to further reduce the amount of liquid to increase

6、dissolved oxygen increasing glutamic acid production. Through this training, get a more complete fermentation of glutamic acid solution. Same time, to optimize fermentation culture medium and culture conditions, get a better production of glutamic acid.一、谷氨酸棒桿菌的誘變選育1.1 試驗方法 1.1.1 菌種純化 谷氨酸棒桿菌 W3 平板（完

7、全培養(yǎng)基）劃線分離。32 ，培養(yǎng) 2430 h，挑取單菌落，繼續(xù)純化培養(yǎng)，如此反復(fù)三次，保證菌落純后保藏。 1.1.2菌種保藏 用斜面保藏培養(yǎng)基，4 保藏。 2.3.3 斜面活化 W3 菌株(分離純化后)接入斜面培養(yǎng)基，32 培養(yǎng) 24 h。 1.1.3 種子液搖床培養(yǎng)條件 32 ，200 r/min。 2.3.5 種子培養(yǎng) 取活化菌種兩環(huán)接入裝有 30 m L/250 m L 種子培養(yǎng)液的三角瓶中，搖床培養(yǎng) 16 h。1.1.4.1紫外誘變處理 （1）菌種活化（2）菌體前培養(yǎng)：取活化菌種接入種子培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)至對數(shù)期，然后以5 %的接種量轉(zhuǎn)接至相同的種子培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)期，下?lián)u床，置于 4

8、6 低溫靜置 2 h，低溫誘導(dǎo)菌體同步生長后，取出放至室溫，以 20 %的接種量轉(zhuǎn)接至新鮮的種子培養(yǎng)基，培養(yǎng) 23 h，使細(xì)胞處于同步生長狀態(tài)備用。 （3）紫外誘變處理：取同步生長的種子液，以0.85 %的生理鹽水稀釋至10-7，取5 m L稀釋液加到直徑9 cm培養(yǎng)皿中，于磁力攪拌器上攪拌并放置于15 W紫外燈下30 cm處，開啟皿蓋攪拌照射不同時間。此過程在紅光下操作，以免光復(fù)活作用影響誘變效果。誘變結(jié)束后用移液槍吸取0.2 m L涂布于篩選培養(yǎng)基。 1.1.4.2 亞硝酸鈉誘變處理50 取0.2 mol/L的亞硝酸鈉溶液1 ml加入大試管中，加入1 ml同步生長狀態(tài)下的種子液，立即加入1

9、 m Lp H 6.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液，充分混合后，置27 水浴，誘變不同時間，以選擇致死率達(dá)80 %的作用時間。加0.07 mol/L p H 8.6 的Na2HPO4溶液2 ml，終止反應(yīng)。 2.3.8 篩選方法 2.3.8.1 營養(yǎng)缺陷型的平板篩選 取誘變菌液0.2 m L涂布到基本培養(yǎng)基與添加了適量Glu的基本培養(yǎng)基中，32 培養(yǎng)2 d，對照平板，選擇基本培養(yǎng)基中不生長而添加Glu培養(yǎng)基中生長的菌落分離純化，保藏。1.2谷氨酸營養(yǎng)缺陷型回復(fù)突變株及天冬氨酸滲漏性突變株平板篩選 （1）谷氨酸營養(yǎng)缺陷型回復(fù)突變株平板篩選 取適當(dāng)?shù)恼T變菌液0.2 m L涂布到基本培養(yǎng)基中，32 培養(yǎng)2

10、d，選取生長的菌落，分離純化，保藏。 （2）天冬氨酸滲漏性突變株的平板篩選 取適當(dāng)?shù)恼T變菌液0.2 m L涂布于基本培養(yǎng)基與添加少量Asp的基本培養(yǎng)基中，32 培養(yǎng)2 d，選取在基本培養(yǎng)基中生長的菌落較小，而在添加了天冬氨酸的基本培養(yǎng)基中生長較大的菌落，分離純化，保藏。 2.3.8.3 谷氨酰胺抗性突變株的平板篩選 適當(dāng)?shù)恼T變菌液0.2 m L涂布到含不同量的Gln的基本培養(yǎng)基中，選擇菌體不能生長時的谷氨酰胺添加量，加入到基本培養(yǎng)基中，制成篩選平板，將誘變菌液涂布篩選平板后32 培養(yǎng)2 d，選取生長的菌落，分離純化，保藏。 1.2.1 初篩 取目的菌液的種子液（對數(shù)期），稀釋至10-7，涂布完

11、全培養(yǎng)基，32 培養(yǎng)3d，然后牙簽法點種于兩個相同的完全培養(yǎng)基平板，用打孔器在平行平板的其中一個的相同的菌落上方打孔，取出瓊脂柱，置于96孔板之中，滴加0.1 %甲基紅溶液1滴，顏色由紅至黃，表明菌株產(chǎn)酸由高到低。選取產(chǎn)酸相對較高的菌株，用另一平行平板保藏，以備復(fù)篩。 1.2.2 復(fù)篩 將初篩得到的菌株以24孔板進(jìn)行種子培養(yǎng)以及發(fā)酵培養(yǎng)后，滴加中性紅檢測產(chǎn)酸水平(平行三個實驗)，選取相對較紅的菌液對應(yīng)的菌株保藏，以備復(fù)篩II。 1.2.3 復(fù)篩 將復(fù)篩I得到的菌株搖瓶發(fā)酵，篩選高產(chǎn)菌株（平行三組實驗）。1.2.4 分析方法 2.3.9.1 p H 的測定 取少量發(fā)酵液于精密p H試紙確定p H

12、。1.2.5 菌體生長曲線測定 取活化菌種兩環(huán)接入裝有30 m L/250 m L三角瓶中（加15粒玻璃珠，下同。），搖床培養(yǎng)16 h后，以2 %接種量轉(zhuǎn)接到另一相同的完全液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2 h取樣一次，用蒸餾水稀釋100倍后，用752分光光度計于波長620 nm條件下測量吸光度(A620)。以時間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制菌體生長曲線，平行三次試驗。 2.3.9.3 谷氨酸含量及殘?zhí)呛康臏y定 用SBA-40C多功能谷氨酸-葡萄糖分析儀測定樣品的谷氨酸以及殘?zhí)恰悠方?jīng)稀釋后由定量進(jìn)樣針吸取25 L，并快速注入反應(yīng)池，讀取相應(yīng)的數(shù)值，記錄。二、搖瓶分批發(fā)酵產(chǎn)谷氨酸的發(fā)酵條件優(yōu)化2

13、.1材料與方法 2.1.1 實驗菌株 誘變得谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）W3-4-12（Glnr ，Asp 滲漏性）。2.1.2 實驗儀器與試劑2.1.3 實驗用培養(yǎng)基（g/L） 優(yōu)化得種子培養(yǎng)基 葡萄糖 25，玉米漿 26， K2HPO4 1.2，Mg SO4 0.6，尿素 6.0，p H 7.2。 優(yōu)化得發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖 130，尿素 8，KCl 0.7，Na2HPO4 0.9，Mg SO4 0.5，Mn SO4 0.5，F(xiàn)e SO4 0.3，玉米漿 4，糖蜜 4，p H 7.2。2.1.4 分析方法 同上2.1.5 實驗結(jié)果與分析2.2 種子培養(yǎng)

14、條件的優(yōu)化 種子液一般培養(yǎng)至對數(shù)生長期，因為對數(shù)生長期的菌體生長旺盛，可以于克服菌體接入發(fā)酵培養(yǎng)基對環(huán)境的不適應(yīng)性。種子培養(yǎng)條件的優(yōu)化，是發(fā)酵優(yōu)化的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)。接下來，實驗通過對種子培養(yǎng)基成分配比、種子液 p H、種子培養(yǎng)基裝液量、種齡、接種量五個基本要素進(jìn)行試驗，確定最優(yōu)方案。2.2.1尿素對種子液的影響 種子液的培養(yǎng)為 10 h，期間不人為干預(yù)種子液 p H，所以作為緩釋作用的尿素對種子液的培養(yǎng)十分關(guān)鍵。試驗對種子液添加不同量的尿素，然后通過發(fā)酵產(chǎn)酸測定最佳尿素添加量。平行三次實驗，記錄平均值。并測定菌濃 OD620。結(jié)果如圖3.2，當(dāng)尿素添加量為 0.6 %時，谷氨酸產(chǎn)量較高，為 81 g

15、/L。 2.2.2 裝液量對種子液的影響 試驗以 250 m L 錐形瓶進(jìn)行種子培養(yǎng)，發(fā)酵產(chǎn)酸，平行三組試驗。由圖 3.3 可知，種子液的菌濃隨搖瓶裝液量的降低而下降，20 m L 與 40 m L 的菌濃曲線變化幅度最大。因為谷氨酸發(fā)酵為耗氧發(fā)酵，種子液的裝液量對菌體生長影響明顯。當(dāng)裝液量為 20 m L 時雖然菌體獲得更多的氧濃度，但是當(dāng)需氧濃度超過菌體生長最佳量時，菌體濃度的增加量與 25 m L 裝液量相比不升反降。并且高溶氧也不利于后期產(chǎn)酸。而當(dāng)菌液為 40 m L 時，溶解氧濃度明顯下降，菌濃也有明顯的下降，為各試驗值的最低，同時，產(chǎn)酸量也為最低。雖然種子培養(yǎng)液是富集菌種的步驟，但

16、不是菌濃越大越好，綜合菌體濃度與后期發(fā)酵產(chǎn)酸結(jié)果來看，選擇在 250 m L 錐形瓶中盛裝 25 m L 種子培養(yǎng)基時發(fā)酵產(chǎn)酸較好，此時的菌體 OD 值 0.805，谷氨酸產(chǎn)量為 83 g/L。2.2.3種齡對發(fā)酵培養(yǎng)的影響 由前述可知，種齡選擇為 816 h 為宜，進(jìn)一步試驗（平行三組）結(jié)果如圖 3.4（a）：可知種齡為 12 h 時有產(chǎn)酸最高點，為 83 g/L，所以最佳種齡為 1014 h。為進(jìn)一步確定種齡時間，選擇種齡培養(yǎng)梯度 10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5 h 進(jìn)行同條件下試驗，結(jié)果如圖 3.4（b），可知種子液培養(yǎng) 11 h 時，發(fā)酵產(chǎn)酸最多，為 84 g

17、/L。2.3發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化 2.3.1 不同碳源對谷氨酸發(fā)酵的影響碳源是菌體生長骨架以及能量代謝的來源，不同的碳源對菌體生長均有不同的影響。幾乎所有的谷氨酸生產(chǎn)菌株都不能直接利用淀粉，因為大多數(shù)菌株內(nèi)不含有淀粉酶。在相同條件下，分別添加相同濃度的葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、麥芽糖、果糖、醋酸作為碳源進(jìn)行發(fā)酵試驗，添加量為 14 g/L，結(jié)果所示，蔗糖與葡萄糖作為碳源對谷氨酸發(fā)酵影響最大，產(chǎn)酸最高。因為蔗糖與葡萄糖成本最高，很多工廠一般都用淀粉糖水解液作為碳源發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸。本試驗選擇葡萄糖作為碳源。 2.3.2 不同氮源對谷氨酸發(fā)酵的影響 氮源是構(gòu)成菌體成分的主要物質(zhì)，不同的氮源對菌體生長狀

18、態(tài)影響不同，糖蜜與玉米漿含有菌體生長所必需的眾多營養(yǎng)因子，尿素作為氮源，還可以調(diào)節(jié)菌體生長過程中的 p H 值，所以試驗在原培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，分別添加相同濃度的蛋白胨、酵母膏、酵母浸提物、硫酸銨作為外加氮源與原培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵試驗，外加氮源添加量為 10 g/L。 2.3.3不同無機鹽離子對谷氨酸發(fā)酵的影響 無機鹽和微量元素是谷氨酸發(fā)酵中菌體生命活動不可或缺的物質(zhì)，谷氨酸生產(chǎn)菌株對其的需求量不高，但無機鹽離子過多或過少都會影響發(fā)酵產(chǎn)酸。其中磷酸鹽含量對產(chǎn)酸影響比較大，鉀鹽次之，Mn2+、Fe2+、Mg2+影響較小。試驗對幾種鹽離子進(jìn)行比較，選擇磷酸鹽與鉀鹽試驗，試驗共分為三組，如下： A：0.06

19、%KCl+0.09 %Na2HPO455； B：0.1 %KH2PO4； C：A+B。2.3.4 發(fā)酵培養(yǎng)基的單因素優(yōu)化試驗 （1）葡萄糖濃度對谷氨酸發(fā)酵的影響 初始葡萄糖濃度的不同，影響發(fā)酵產(chǎn)酸水平。不同葡萄糖濃度下的谷氨酸產(chǎn)量在葡萄糖濃度為 11 %13 %之間有谷氨酸產(chǎn)量的最高值。（2）尿素濃度對谷氨酸發(fā)酵的影響 尿素可以作為谷氨酸發(fā)酵的氮源，同時可以控制發(fā)酵初期的 p H 值。發(fā)酵初期，菌體生長范圍較廣，在 p H 6.5p H 8.0 條件下均能正常生長。當(dāng) p H 值控制在7.5 左右時，菌體生長最為旺盛。尿素添加量的測定以及發(fā)酵 8h 后的發(fā)酵液 p H 值的測定結(jié)果如圖 3.9

20、，p H 值隨尿素的添加量的增加呈明顯提高趨勢。p H 值過低，菌體易衰老，不利于菌體繁殖，產(chǎn)酸量最低；p H 過高時，菌體易自溶，同樣影響產(chǎn)酸水平。發(fā)酵培養(yǎng)基中尿素添加量為 0.7 %0.9 %時，發(fā)酵產(chǎn)酸有最大值 91 g/L，此區(qū)間的 p H 值為 6.58.0。 （3）KCl 的含量對谷氨酸發(fā)酵的影響 KCl對谷氨酸發(fā)酵的影響如圖3.10，伴隨鉀離子濃度的增高，菌體的OD凈增值與谷氨酸產(chǎn)量都上升，在最高峰值后下降。鉀離子濃度為0.08 %左右時，谷氨酸產(chǎn)量最高。K+雖然不參與細(xì)胞物質(zhì)的組成，但它是許多酶的激活劑，能夠促進(jìn)糖代謝。適當(dāng)?shù)拟涬x子濃度可以保證菌體的繁殖濃度，也使得酶促反應(yīng)的酶

21、活較高，得到高水平的谷氨酸產(chǎn)量。（4）Na2HPO4的濃度對谷氨酸發(fā)酵的影響 以不同濃度的 Na2HPO4加入培養(yǎng)基發(fā)酵，結(jié)果如圖 3.10，隨 PO43+濃度的增高，凈增 OD 值與谷氨酸含量都在逐步提高后達(dá)最大值，隨后，當(dāng) PO43+繼續(xù)增大時，谷氨酸含量下降。由圖 3.10 與圖 3.11 可以看出無機鹽離子對谷氨酸產(chǎn)量的影響相對較小，主要是因為生產(chǎn)原料糖蜜與玉米漿中已經(jīng)含有一定的無機鹽離子，所以培養(yǎng)基中添加的無機鹽離子含量較少，添加幅度的增加或減少對發(fā)酵產(chǎn)酸有影響，但不是最主要的影響因素。（5）金屬離子的含量對谷氨酸發(fā)酵的影響 金屬離子 Mg2+和 Fe2+對谷氨酸發(fā)酵的影響更小一些，

22、我們以他們的組合為單位，探討這兩種離子添加比例對發(fā)酵產(chǎn)酸的影響。試驗添加的金屬離子量分別為： A：Mg SO4 0 %，F(xiàn)e SO4 0.03 %。 B：Mg SO4 0.05 %，F(xiàn)e SO4 0.03 %。 C：Mg SO4 0.05 %，F(xiàn)e SO4 0.03 %。 發(fā)酵結(jié)果如圖 3.12 所示，金屬離子對谷氨酸的影響是比較小的，從發(fā)酵結(jié)果中可以看出，當(dāng) Mg SO4的濃度為 0 %時，發(fā)酵產(chǎn)酸相對較低，比 Fe SO4濃度為 0 %時產(chǎn)量低，所以，Mg SO4的濃度對發(fā)酵結(jié)果的影響較 Fe SO4的濃度對發(fā)酵結(jié)果的影響大一些。最終 C 組的安排較為合理。2.3.5正交試驗確定關(guān)鍵因素添

23、加量 由以上試驗可知，在谷氨酸發(fā)酵過程中，碳源中的葡萄糖含量、氮源中的尿素含量、無機鹽 KCl 和 Na2HPO4對谷氨酸發(fā)酵的影響較大，通過單因素優(yōu)化，得到了四種元素的最佳區(qū)間分別為：14 %16 %、0.7 %0.9 %、0.07 %0.09 %、0.09 %0.11 %。在四個水平上進(jìn)行 L9 (34)正交試驗，發(fā)酵結(jié)束以谷氨酸產(chǎn)量（g/L）為試驗指標(biāo)進(jìn)行試驗。2.3.5.1 玉米漿糖蜜配比對谷氨酸發(fā)酵的影響 玉米漿與糖蜜是谷氨酸發(fā)酵中的重要原料，但是由于其來源不是很固定，所以玉米漿與糖蜜的差別也很大。味精生產(chǎn)工業(yè)中，常用糖蜜來調(diào)節(jié)菌量，因為糖蜜含有豐富的維生素 B1、B2，葉酸，生物素

24、等生長因子；一般認(rèn)為玉米漿與產(chǎn)酸的關(guān)系較為密切，因為玉米漿中的鉀、鎂等離子較為豐富。試驗為了確定玉米漿與糖蜜的配比，設(shè)計了 AG 組的配比方案，如表 3.4 中所示，配制發(fā)酵培養(yǎng)基。 發(fā)酵產(chǎn)酸結(jié)果如圖 3.14 所示，當(dāng)玉米漿糖蜜比為 1：1，都為 0.4 %時谷氨酸產(chǎn)量最大。同時可知，糖蜜過高，不利于產(chǎn)酸。C、F 組添加糖蜜過高，菌體會保持較長時間的連續(xù)生長，導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)酸較少或者只長菌不產(chǎn)酸，對谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)不利。2.3.5.2谷氨酸發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化 （1）接種量對發(fā)酵培養(yǎng)的影響 接種量對發(fā)酵產(chǎn)酸的影響在于：接種量過小，延滯期長，菌體生長緩慢，菌濃較低，發(fā)酵周期延長，產(chǎn)酸水平低；接種量過大

25、往往菌體生長過快，同時培養(yǎng)基黏度大，影響溶氧，衰老細(xì)胞增加，最終影響產(chǎn)物合成。所以接種量的選擇對發(fā)酵結(jié)果至關(guān)重要。 由種子液的接種量分別為 10、15、20 %的發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)果如圖 3.15（a）可知接種量為 5 %10 %時有谷氨酸產(chǎn)量峰值，當(dāng)接種量大于 10 %時，谷氨酸產(chǎn)量是降低的，當(dāng)接種量增大至 15%時谷氨酸產(chǎn)量下降速度較快，只有 61 g/L。進(jìn)一步試驗選取種子液的接種量分別為 5、6、7、8、9、10 %進(jìn)行發(fā)酵測試，發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)果如圖 3.14（b），當(dāng)接種量為 7 %時，發(fā)酵產(chǎn)酸最高，為 98 g/L。 （2）裝液量對谷氨酸發(fā)酵的影響 對 250 m L 錐形瓶的裝液量進(jìn)行探討，

26、以 10、20、30、40、50/250 m L 裝液發(fā)酵的產(chǎn)酸量分別為：103、100、99、95、75 g/L，從而得知溶解氧嚴(yán)重制約著谷氨酸產(chǎn)量，低溶解氧時：發(fā)酵積累大量的乳酸，使發(fā)酵液的 p H 值下降，不利于谷氨酸的生產(chǎn)，同時，葡萄糖轉(zhuǎn)化成了乳酸，降低了產(chǎn)物的提出率57。緊接著監(jiān)測了250 m L 錐形瓶發(fā)酵時的極限裝液量，記錄結(jié)果如圖 3.16（a），可知 250 m L 錐形瓶的裝液量極限是 8 m L，增加玻璃珠的個數(shù)有助于提高產(chǎn)酸量，可換用 500 m L錐形瓶并改用三層紗布包扎繼續(xù)試驗。250 m L 錐形瓶與 500 m L 錐形瓶發(fā)酵結(jié)果如圖 3.16（b），500 m

27、 L 錐形瓶裝液極限量為 10 m L，15 m L 與 20 m L 裝液量時，谷氨酸產(chǎn)量最高為 107 g/L。從對比圖中可以看出，500 m L 錐形瓶發(fā)酵產(chǎn)酸比 250m L 錐形瓶的產(chǎn)量要高，而且對產(chǎn)量的影響很大，所以后續(xù)試驗選用 500 m L 錐形瓶盛裝 15 m L 發(fā)酵液進(jìn)行發(fā)酵。（3）尿素添加量對谷氨酸發(fā)酵的影響 對相同條件下發(fā)酵的三瓶發(fā)酵液產(chǎn)酸量平行試驗觀察，選擇產(chǎn)量最高的一瓶發(fā)酵液的尿素添加量與 p H 的變化進(jìn)行分析，尋找尿素添加量的控制階段。由圖3.17 可知，當(dāng) p H 均為 7.7 或 7.8 時，尿素的添加量明顯不同。18 h 后，要根據(jù)菌體生長適當(dāng)提高尿素添

28、加量，2026 h 內(nèi)是 p H 下降最快的時段（這一特征僅對于該菌種而言），28 h 開始，又要適當(dāng)?shù)慕档湍蛩氐奶砑恿?。所以整個 p H 控制階段，要分三段（1018 h、1826 h、2634 h）控制，添加量要根據(jù)對試驗的熟悉程度適量添加。（4）p H 控制對谷氨酸發(fā)酵的影響 如緒論的討論，p H 值的控制影響谷氨酸脫氫酶的活力，當(dāng) p H 值維持在 7.2左右時，谷氨酸發(fā)酵有最高產(chǎn)酸水平。試驗分別以出發(fā)菌種進(jìn)行發(fā)酵，對 p H 控制做如下處理（前 8h 發(fā)酵不控制 p H 值）： A：812 h 控制 p H 7.5 左右，1228 h 控制 p H 7.2 左右，2836 h 控制

29、p H 7.0左右。 B：836 h 控制 p H 7.2 左右。 C：812 h 控制 p H 7.0 左右，1228 h 控制 p H 7.2 左右，2836 h 控制 p H 7.5左右。 D：812 h 控制 p H 7.5 左右，1228 h 控制 p H 7.2 左右，2836 h 控制 p H 7.5左右。 E：812 h 控制 p H 7.0 左右，1228 h 控制 p H 7.2 左右，2836 h 控制 p H 7.0左右。 每種控制狀態(tài)平行 3 組試驗，記錄平均值，結(jié)果如圖 3.18（a）所示，A 組試驗谷氨酸產(chǎn)量最高，E、B 組次之，且這三組都是后期 p H 控制在

30、7.0 左右，以 6.8為宜。其 p H 分布圖如圖 3.18（b）所示。通過試驗數(shù)據(jù)可知，前期 p H 控制在 7.5左右，谷氨酸產(chǎn)量最高。產(chǎn)物形成期，p H 宜控制在 7.2 左右。 （5）溫度對谷氨酸發(fā)酵的影響 培養(yǎng)溫度影響谷氨酸脫氫酶的活性，試驗設(shè)計為：在原發(fā)酵工藝階段中溫度的基礎(chǔ)上正負(fù)改變兩度進(jìn)行試驗，處理如下： A：012 h，30、31、32、33、34 ，200 r/min；1224 h，35 ，220 r/min；2436 h，36 ，240 r/min。 B：012 h，33 ，200 r/min；1224 h，33、34、35、36、37 ，220 r/min；2436

31、h，36 ，240 r/min。 C：012 h，33 ，200 r/min；1224 h，35 ,220 r/min；2436 h，34、35、36、37、38 ，240 r/min。 試驗結(jié)果如圖 3.19 所示，C 組溫度對產(chǎn)酸量影響較大，也就是發(fā)酵過程后期要提高發(fā)酵溫度，利于谷氨酸的積累。最終確定發(fā)酵溫度為：012 h，33 ，200 r/min；1224 h，35 ，220 r/min；2436 h，38 ，240 r/min。（6）分瓶發(fā)酵提高溶氧水平對谷氨酸發(fā)酵的影響 由裝液量的探討可知，溶解氧水平是制約谷氨酸發(fā)酵的主要因素之一。無論是 250 m L 錐形瓶還是 500 m L

32、 錐形瓶進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵，谷氨酸產(chǎn)量都是隨發(fā)酵液的盛裝量的減少而上升，而且趨勢十分明顯。但是隨著培養(yǎng)基的減少，營養(yǎng)成分也相對減少，接入的菌體生長到一定程度會影響其繁殖，當(dāng)營養(yǎng)程度降低到一定水平，有些菌體呈現(xiàn)不增長狀態(tài)，甚至?xí)蚓w衰老、自溶而使發(fā)酵提前結(jié)束。所以雖然采用 500 m L 錐形瓶盛裝 15m L 液體的方案可以提高谷氨酸的產(chǎn)量，但是效果也較為有限。試驗根據(jù)菌體繁殖期與產(chǎn)物生成期的不同設(shè)計了“分瓶發(fā)酵”的試驗方法。因為谷氨酸發(fā)酵是典型的菌體繁殖與產(chǎn)物生成部分相關(guān)的模型，這種模型產(chǎn)物的生成與菌體生長部分相關(guān)，表現(xiàn)為長菌期谷氨酸產(chǎn)量極低，甚至為零，而生產(chǎn)期主要以積累谷氨酸為主。試驗通過測

33、定谷氨酸產(chǎn)量的變化，確定菌體由“生長型”向“生產(chǎn)型”轉(zhuǎn)變的時間點，進(jìn)行分瓶發(fā)酵。 以 30 m L/500 m L 錐形瓶進(jìn)行發(fā)酵試驗，并以 15 m L/500 m L 作為對照試驗，取樣測定谷氨酸產(chǎn)量做產(chǎn)量圖與生長曲線圖，根據(jù)圖 3.20 顯示的結(jié)果，選取發(fā)酵培養(yǎng) 15 h 的菌體即為“生長型”向“生產(chǎn)型”轉(zhuǎn)變的時間點，分裝發(fā)酵液至 15 m L/500 m L 錐形瓶進(jìn)行搖床發(fā)酵，并作對照試驗。結(jié)果如圖 3.20 所示，以 30 m L/500 m L進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵，10 h 后開始產(chǎn)酸，實驗選擇發(fā)酵 15 h 后分裝至 15 m L/500 m L 錐形瓶中繼續(xù)發(fā)酵，并繼續(xù)記錄谷氨酸產(chǎn)量?？梢钥闯?16 h 后，谷氨酸產(chǎn)量增加緩慢，產(chǎn)酸率甚至有所降低，但進(jìn)入 20 h 后，谷氨酸產(chǎn)量又進(jìn)一步加大，2228 h 時產(chǎn)酸率不斷提高，雖然 28 h 后產(chǎn)酸率有所下降，但是谷氨酸產(chǎn)量仍然穩(wěn)定增加，直至 38 h 時產(chǎn)量達(dá)到最大 113 g/L，38 h 后谷氨酸產(chǎn)量有所下降，原因有可能是部分谷氨酸被分解。產(chǎn)幅最大的是 2430 h。 三、實驗結(jié)果與分析以