細(xì)胞融合與單克隆抗體PPT學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1細(xì)胞融合與單克隆抗體細(xì)胞融合與單克隆抗體第2頁/共43頁第3頁/共43頁v 70 70年代年代,(,(華裔加籍華裔加籍) )高國楠高國楠 PEGPEG促植物原生促植物原生 質(zhì)體的融合質(zhì)體的融合v 80 80年代，電融合年代，電融合第4頁/共43頁現(xiàn)代植物細(xì)胞融合的開始 1978年（德）梅歇爾斯“potomo”第5頁/共43頁“Pomoto ”第6頁/共43頁第7頁/共43頁動(dòng)物細(xì)胞融合 動(dòng)物細(xì)胞融合是研究細(xì)胞遺傳信息轉(zhuǎn)移，基因在染色體上的定位以及創(chuàng)造新細(xì)胞株的有效途徑。第8頁/共43頁腫瘤細(xì)胞與樹突狀腫瘤細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞的融合細(xì)胞的融合第9頁/共43頁人纖維肉瘤細(xì)胞與小鼠畸胎瘤細(xì)胞融合

2、1978年年(瑞士瑞士)埃勒門埃勒門斯斯 (美國美國)柯路斯柯路斯第10頁/共43頁第11頁/共43頁物理法物理法:電場刺激電場刺激 激光激光 顯微操作顯微操作 化學(xué)法化學(xué)法:聚乙二醇聚乙二醇(PEG)結(jié)合高結(jié)合高pH、 高鈣離子法高鈣離子法生物法生物法:仙臺(tái)病毒仙臺(tái)病毒第12頁/共43頁來來 源源前處理前處理融合方法融合方法主要應(yīng)用主要應(yīng)用動(dòng)物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞不需不需仙臺(tái)病毒、仙臺(tái)病毒、PEGPEG、電融合電融合生產(chǎn)單克隆生產(chǎn)單克隆抗體抗體植物細(xì)胞植物細(xì)胞脫壁脫壁PEGPEG、電融合、電融合創(chuàng)造植物新創(chuàng)造植物新品種品種微生物細(xì)胞微生物細(xì)胞脫壁脫壁PEGPEG高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)新高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)新菌種菌種第13頁/

3、共43頁也稱日本血凝病毒也稱日本血凝病毒HVJHVJ，屬粘病毒副流感，屬粘病毒副流感類群，是類群，是RNARNA病毒，多型顆粒狀，易在小病毒，多型顆粒狀，易在小鼠中蔓延。鼠中蔓延。 第14頁/共43頁仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)第15頁/共43頁仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)第16頁/共43頁仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)第17頁/共43頁P(yáng)EG聚乙二醇聚乙二醇(polyethylene glycol) 商品名：卡波蠟(carbowax)多聚化合物，分子式H(OCH2CH2)nOH實(shí)驗(yàn)室用實(shí)驗(yàn)室用PEG平均分子量在平均分子量在20020,000一般：一般：1,000固體固體常用分子量：常用分子量：400060

4、00PEG誘誘導(dǎo)導(dǎo)第18頁/共43頁？脫水作用能使細(xì)胞凝聚，并使膜結(jié)構(gòu)發(fā)生脫水作用能使細(xì)胞凝聚，并使膜結(jié)構(gòu)發(fā)生 變化變化？改變膜表面電荷或膜電位，而導(dǎo)致膜上蛋改變膜表面電荷或膜電位，而導(dǎo)致膜上蛋 白質(zhì)顆粒聚集及膜脂分子隨之發(fā)生重排之白質(zhì)顆粒聚集及膜脂分子隨之發(fā)生重排之 故。故。 ？PEG誘誘導(dǎo)導(dǎo)第19頁/共43頁P(yáng)EG誘誘導(dǎo)導(dǎo)第20頁/共43頁P(yáng)EG誘誘導(dǎo)導(dǎo)懸浮法：將細(xì)胞懸于懸浮法：將細(xì)胞懸于40405050的的PEG4000PEG4000進(jìn)行進(jìn)行 溶，處理溶，處理1 12 2分鐘為宜。分鐘為宜。離心法離心法：先將細(xì)胞混合物懸于先將細(xì)胞混合物懸于30304040的的 PEG4000PEG400

5、0，再離心進(jìn)行融合，則可適，再離心進(jìn)行融合，則可適 當(dāng)延長融合時(shí)間，以當(dāng)延長融合時(shí)間，以5 58 8分鐘為宜。分鐘為宜。 第21頁/共43頁l 輔以輔以515的的DMSO或在融合前用或在融合前用 PHA處理一下，效果更好。處理一下，效果更好。PEG誘誘導(dǎo)導(dǎo)第22頁/共43頁P(yáng)EG誘誘導(dǎo)導(dǎo)PEG融合法缺點(diǎn) 對(duì)細(xì)胞有毒性第23頁/共43頁P(yáng)EG誘誘導(dǎo)導(dǎo)第24頁/共43頁電融合誘電融合誘導(dǎo)導(dǎo)機(jī)制機(jī)制在直流電脈沖的誘導(dǎo)下, 原生質(zhì)體質(zhì)膜表面的電荷和氧化還原電位變化, 使原生質(zhì)體粘合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂,進(jìn)而質(zhì)膜開始連接,直到閉合成完整的細(xì)胞融合體第25頁/共43頁電融合誘電融合誘導(dǎo)導(dǎo)第26頁/共43頁u

6、融合效率高，可達(dá)融合效率高，可達(dá)5080u產(chǎn)生雜交細(xì)胞的頻率高，是產(chǎn)生雜交細(xì)胞的頻率高，是PEG法的法的100倍。倍。 u操作簡便、穩(wěn)定，但需設(shè)備。操作簡便、穩(wěn)定，但需設(shè)備。u對(duì)細(xì)胞無毒害作用。對(duì)細(xì)胞無毒害作用。u可在顯微鏡下觀察操作?？稍陲@微鏡下觀察操作。電融合誘電融合誘導(dǎo)導(dǎo)第27頁/共43頁視野內(nèi)全部細(xì)胞的細(xì)胞核總視野內(nèi)全部細(xì)胞的細(xì)胞核總數(shù)數(shù) 100融合率融合率=第28頁/共43頁成株成株第29頁/共43頁組織的獲得組織的消化組織的消化誘導(dǎo)細(xì)胞融合形成雜種細(xì)胞 篩選，培養(yǎng)第30頁/共43頁第31頁/共43頁比較項(xiàng)目比較項(xiàng)目植物體細(xì)胞雜交植物體細(xì)胞雜交動(dòng)物細(xì)胞融合動(dòng)物細(xì)胞融合細(xì)胞融合的原理細(xì)

7、胞融合的原理細(xì)胞膜的流動(dòng)性、細(xì)胞膜的流動(dòng)性、植物細(xì)胞全能性植物細(xì)胞全能性細(xì)胞膜的流動(dòng)性細(xì)胞膜的流動(dòng)性細(xì)胞融合的方法細(xì)胞融合的方法去處細(xì)胞壁后誘去處細(xì)胞壁后誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合導(dǎo)原生質(zhì)體融合使細(xì)胞分散后誘使細(xì)胞分散后誘導(dǎo)細(xì)胞融合導(dǎo)細(xì)胞融合誘導(dǎo)方法誘導(dǎo)方法物理（顯微操作、物理（顯微操作、電融合）電融合）化學(xué)（聚乙二醇）化學(xué)（聚乙二醇）物理、化學(xué)方法物理、化學(xué)方法（同左）（同左）滅活的病毒滅活的病毒用途用途獲得雜種植株獲得雜種植株制備單克隆抗體制備單克隆抗體第32頁/共43頁 (1) 親本細(xì)胞表面性質(zhì)，表面覆蓋絨毛而不規(guī)則 者較易融合；表面光滑者較難融合。(2) 細(xì)胞種類不同，融合效果不同，如腹水癌及

8、株化細(xì)胞較易融合，而淋巴細(xì)胞或血球細(xì)胞 幾乎不融合。 (3) 細(xì)胞融合時(shí)需要適宜溫度和運(yùn)動(dòng)狀態(tài)。如仙 臺(tái)病毒誘導(dǎo)歐利希氏腹水癌細(xì)胞融合時(shí)，于 37 振搖時(shí)易于融合，且融合效率與病毒量 呈正比。但在34 振搖則融合率下降。在 37時(shí)不振搖則幾乎不融合。 影響細(xì)胞融合的因素影響細(xì)胞融合的因素第33頁/共43頁(5)有些細(xì)胞融合時(shí)需要Ca2+，否則不融合，細(xì)胞蛋 白質(zhì)亦發(fā)生變化。實(shí)驗(yàn)表明Sr2+、Ba2+、Mg2+、 Mn2+等離子可代替Ca2+但有效濃度較Ca2+大 的多。融合時(shí)最適合的離子強(qiáng)度一般為0.1mol/L(6)最適合的pH為7478之間，在此范圍之外， 融合率均較低。影響細(xì)胞融合的因素影響細(xì)胞融合的因素第34頁/共43頁第35頁/共43頁第36頁/共43頁異核體異核體(heterokaryon）多核體（多核體（polykaryon）異胞質(zhì)體異胞質(zhì)體(heterocybrid)第37頁/共43頁同源