模式生物酵母菌

1、模式生物-大腸桿菌、酵母菌張紅霞大腸桿菌簡介 大腸桿菌（Escherichia coli），是相對簡單的單細胞原核生物，所有DNA、RNA 和蛋白質合成的機器都包含在同一細胞器中，可以相對容易的培養(yǎng)和操作。酵母菌簡介酵母菌簡介酵母菌（酵母菌（YeastYeast）是一群以芽殖或裂）是一群以芽殖或裂殖方式進行無性繁殖的單細胞真核殖方式進行無性繁殖的單細胞真核生物，分屬于子囊菌綱（子囊酵母生物，分屬于子囊菌綱（子囊酵母菌）、擔子菌綱（擔子酵母菌）、菌）、擔子菌綱（擔子酵母菌）、半知菌類（半知酵母菌），共由半知菌類（半知酵母菌），共由5656個屬和個屬和500500多個種組成。多個種組成。如果說大腸

2、桿菌是外源基因最成熟如果說大腸桿菌是外源基因最成熟的原核生物表達系統(tǒng)，則酵母菌是的原核生物表達系統(tǒng)，則酵母菌是最成熟的真核生物表達系統(tǒng)。最成熟的真核生物表達系統(tǒng)。 釀酒酵母（Sacharomy cescerevisiae）是第一種至少在一萬年前就能被人工培育的真菌，是最簡單的真核生物，是由一個細胞組成的獨立的生物個體，能在基本培養(yǎng)基上生長，易于培養(yǎng)和操作，被稱為真核生物中的“大腸桿菌”。 早在1996年就完成了釀酒酵母的基因組測序，這是人類第一次獲得真核生物基因組的完整核苷酸序列，被稱為遺傳學研究上的一座里程碑。大腸桿菌基因組 大腸桿菌通常只有一條染色體，比高等生物的基因組要小得多，并且具有較

3、高的基因密度（大約每1 kb 就有一個基因），沒有內含子和很少有重復DNA，易于尋找和分析基因. 通過對酵母全基因組序列測定，其基因組大小約為12 Mb，初步確定了5 885 個編碼蛋白質的基因，140 個rRNA 基因、275 個tRNA 基因，第一次揭示了一種真核生物的全部基因的數(shù)目和大體上的功能分類. 酵母基因組中有將近31編碼蛋白質或者具有開放閱讀框，與哺乳動物編碼蛋白質的基因有高度的同源性。酵母菌基因組 酵母與其它真核生物相比，它們的基因組較?。s12 Mb），基因數(shù)目也比較少（約5 885）.與大腸桿菌類似，它們可以在實驗室里快速繁殖，在理想條件下，每次細胞分裂大約90 min，可

4、以從單個細胞繁殖成克隆群體. 酵母作為模式實驗系統(tǒng)最重要的優(yōu)點是，酵母細胞不僅簡單，而且具有所有真核生物細胞的主要特征，如含有一個獨立的細胞核、多條線性染色體包裝成染色質、細胞質包含了全部的細胞器（如線粒體）和具有細胞骨架結構（如肌動纖維蛋白）等.大腸桿菌遺傳學研究應用 大腸桿菌的生活周期很短，并且單個細胞可以很容易的獲得一個遺傳上同源的細胞群體（克隆）. 細菌是單倍體，這意味著即使是隱性突變，也能夠表現(xiàn)出突變的表型，同時細菌之間可以方便地進行遺傳物質的交換，細菌的這些特征便于對其進行遺傳學研究. 大腸桿菌作為生命科學研究的模式系統(tǒng)，其主要優(yōu)勢是具有遺傳交換系統(tǒng). 遺傳交換使定位突變、構建含多

5、種突變的菌株、構建用來辨別顯性突變和隱性突變及進行順反式分析的部分雙倍體的菌株成為可能. 這種遺傳交換系統(tǒng)主要通過兩種方式構建的. 第一種方式是大腸桿菌通過性結合交換DNA，大腸桿菌的育性質粒（F 因子，F(xiàn)-factor）具備把自身從一個細胞轉移到另一個細胞的能力. F 因子介導的結合是一個復制的過程，F(xiàn)+細胞轉移一個拷貝的F 因子給F-細胞. 有時，F(xiàn) 因子整合到染色體中，就會引起寄主染色體通過接合向F-細胞轉移. 含有整合的F 因子的菌株叫做Hfr 菌株（高頻重組菌株，Hfr strain），這種材料對于進行遺傳交換研究非常有用。 第二種方式是通過噬菌體介導的轉導，噬菌體成熟時有一部分噬菌

6、體的DNA 被寄主DNA所取代，當噬菌體感染下一個細胞時，從以前寄主那里獲得的染色體DNA 片段可以和被感染的寄主染色體發(fā)生重組，導致遺傳信息從一個細胞轉移到另一個細胞。 在酵母系統(tǒng)中，單倍體和雙倍體細胞的存在促進了酵母的遺傳分析. 酵母在單倍體和二倍體的狀態(tài)下均能生長，并能在實驗條件下較為方便地控制單倍體和二倍體之間的相互轉換，這種轉換是通過交配（單倍體到雙倍體）和孢子生成（雙倍體到單倍體）來實現(xiàn)的，這對其基因功能的研究十分有利. 例如，要想知道一個特定的基因是否是細胞生長所必需的，可以在單倍體里敲除這個基因，單倍體細胞只能承受非必需基因的敲除。酵母菌遺傳學研究應用 酵母中容易對其基因組做精

7、確的人為突變，當把末端與基因組的任何一個特定區(qū)域同源的線性DNA 引入到酵母細胞中，酵母基因組就會發(fā)生非常高的同源重組，導致目標染色體序列被所用的目的染色體片段所取代. 如精確地刪除整個基因的編碼區(qū)、改變單個特定的密碼子，甚至改變啟動子中一個特定的堿基對，這使得研究基因或其調控序列的功能等具體問題變得比較容易. 在20 世紀60 年代末，Hartwell、Hunt 和Nurse 便認識到用遺傳學方法研究細胞周期的可能性. Hartwell 采用釀酒酵母細胞建立系統(tǒng)模型，經過一系列試驗，分離出細胞周期基因發(fā)生突變的酵母細胞，相繼發(fā)現(xiàn)了一系列與細胞周期調控相關的CDC 基因（cell divisi

8、on cycle genes）。 一種被稱為“START”的基因對控制各個細胞周期的最初階段具有決定性的作用. Nurse 在Hartwell 的基礎上，發(fā)現(xiàn)了調節(jié)細胞周期的一種關鍵物質CDK（細胞周期蛋白依賴激酶），并證明CDK 是通過對其它蛋白質的化學作用（磷酸化作用） 來驅動細胞周期. 鑒于利用酵母分子遺傳學對細胞周期調控理論的巨大貢獻，Hunt、Hartwell 和Nurse 榮獲了21 世紀的首屆諾貝爾生理醫(yī)學獎. 細胞生命活動中的許多過程諸如酶催化代謝反應、信號轉導、蛋白質的修飾與加工、蛋白質的轉運等都表現(xiàn)為一種蛋白質與另一種蛋白質間的相互作用. 傳統(tǒng)的免疫印跡、Western b

9、lot等方法很難滿足對蛋白質分子之間相互作用這一動態(tài)過程的研究需要. 利用酵母轉錄因子的特點，F(xiàn)ields 和Song 于1989 年創(chuàng)立了一種非常簡便而有效的研究蛋白質相互作用的方法酵母雙雜交系統(tǒng)。酵母雙雜交系統(tǒng) 最突出的特點是可以在酵母這種生長迅速且易操作的體系中研究真核細胞的蛋白質-蛋白質相互作用，而且還可通過cDNA文庫篩選直接找到與未知蛋白質相互作用的蛋白質的基因。 近年來為了適應更廣泛的用途，在原有酵母雙雜交系統(tǒng)基礎上發(fā)展了大量的衍生系統(tǒng)，如蛋白質三雜交系統(tǒng)、激酶三雜交系統(tǒng)、小配體三雜交系統(tǒng)、RNA 三雜交系統(tǒng)等類型. 此外，還出現(xiàn)了為研究膜蛋白的相互作用而改進的SOS 富集系統(tǒng)（

10、SOS recruitment system，SRS），在該系統(tǒng)中，蛋白質之間的相互作用被人為限制在酵母細胞膜上。 應用 利用重組大腸桿菌生產人胰島素利用重組大腸桿菌生產人胰島素 1982年，美國年，美國Ely LiLi公司首先使用重組大腸桿菌生產人公司首先使用重組大腸桿菌生產人胰島素，成為世界上第一個上市的基因工程藥物。胰島素，成為世界上第一個上市的基因工程藥物。 由基因工程菌合成的重組人胰島素在體外胰島素受體結合由基因工程菌合成的重組人胰島素在體外胰島素受體結合性能、淋巴細胞和成纖維細胞的應答能力、降血糖作用、性能、淋巴細胞和成纖維細胞的應答能力、降血糖作用、血漿藥代動力學等指標上均與天然

11、胰島素沒有任何區(qū)別，血漿藥代動力學等指標上均與天然胰島素沒有任何區(qū)別，而且還具有無免疫原性、注射吸收迅速等優(yōu)點，充分展示而且還具有無免疫原性、注射吸收迅速等優(yōu)點，充分展示了基因工程在生物醫(yī)藥領域中的巨大潛力。了基因工程在生物醫(yī)藥領域中的巨大潛力。大腸桿菌作為表達外源基因受體菌的特征大腸桿菌作為表達外源基因受體菌的特征大腸桿菌表達外源基因的優(yōu)勢大腸桿菌作為表達外源基因受體菌的特征大腸桿菌作為表達外源基因受體菌的特征大腸桿菌表達外源基因的劣勢藍白斑篩選 篩選原理 野生型大腸桿菌產生的-半乳糖苷酶可以將無色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深藍色的物質5-溴-4

12、-靛藍。有色物質可以使整個培養(yǎng)菌落產生顏色變化，而顏色變化是鑒定和篩選的最直觀有效的方法。工程菌及載體 基因工程菌為-半乳糖苷酶缺陷型菌株。這種宿主菌的染色體基因組中編碼-半乳糖苷酶的基因突變，造成其編碼的-半乳糖苷酶失去正常N段一個146個氨基酸的短肽（即肽鏈），從而不具有生物活性，即無法作用于X-gal產生藍色物質。 用于藍白斑篩選的載體具有一段稱為lacz的基因，lacz中包括：一段-半乳糖苷酶的啟動子；編碼肽鏈的區(qū)段；一個多克隆位點(MCS)。-互補 缺陷株基因無法單獨編碼有活性的-半乳糖苷酶，但當菌體中含有帶lacz的質粒后，質粒lacz基因編碼的肽鏈和菌株基因組表達的端缺陷的-半乳

13、糖苷酶突變體互補，具有與完整-半乳糖苷酶相同的作用X-gal生成藍色物質的能力，這種現(xiàn)象即-互補。 操作中，添加IPTG(異丙基硫代-半乳糖苷)以激活lacz中的-半乳糖苷酶的啟動子，在含有X-gal的固體平板培養(yǎng)基中菌落呈現(xiàn)藍色。以上是攜帶空載體的菌株產生的表型。當外源DNA（即目的片段）與含lacz的載體連接時，會插入進MCS，使肽鏈讀碼框破壞，這種重組質粒不再表達肽鏈，將它導入宿主缺陷菌株則無互補作用，不產生活性-半乳糖苷酶，即不可分解培養(yǎng)基中的X-gal產生藍色，培養(yǎng)表型即呈現(xiàn)白色菌落。 實驗中，通常藍白篩選是與抗性篩選一同使用的。含X-gal的平板培養(yǎng)基中同時含有一種或多種載體所攜帶

14、抗性相對應的抗生素，這樣，一次篩選可以判斷出：未轉化的菌不具有抗性，不生長；轉化了空載體，即未重組質粒的菌，長成藍色菌落；轉化了重組質粒的菌，即目的重組菌，長成白色菌落。酵母基因工程 利用重組酵母生產乙肝疫苗 由乙型肝炎病毒（HBVHBV）感染引起的急慢性乙型肝炎是一種嚴重的傳染病，每年約有200200萬病人死亡，并有3 3億人成為HBVHBV攜帶者，其中相當一部分人可能轉化為肝硬化或肝癌患者。目前對乙型肝炎病毒還沒有一種有效的治療藥物，因此高純度乙型疫苗的生產對預防病毒感染具有重大的社會效益，而利用重組酵母大規(guī)模生產乙型疫苗為其廣泛應用提供了可靠的保證。產乙肝表面抗原的重組巴斯德畢赤酵母整合

15、型重組巴斯德畢赤酵母的構建整合型重組巴斯德畢赤酵母的構建PARS2Bgl II5 AOX1HBsAgPHIS43 AOX1Bgl IIpBSAG15111 kbBgl II5 AOX1HBsAgPHIS43 AOX1his+的轉化的轉化子子重組分子重組分子轉化轉化his-的受體細的受體細胞胞染色體染色體DNA 重組菌首先在含有甘油的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待甘油耗盡后，加入甲醇誘導乙肝病毒的表面抗原多肽（HBsAgHBsAg）表達，最終S S蛋白的產量可達細胞可溶性蛋白總量的3%3%在大規(guī)模的生產過程中，巴斯德畢赤酵母工程菌在一個240240L L的發(fā)酵罐中培養(yǎng)，最終可獲得9090克2222nmnm的HBsAgHBsAg顆粒，足夠制成900900萬份乙肝疫苗。 酵母菌作為表達外源基因受體菌的特征酵母菌作為表達外源基因受體菌的特征酵母菌表達外源基因的優(yōu)勢酵母菌表達外源基因的優(yōu)勢全基因組測序，基因表達調控機理比較清楚，遺傳操作簡便全基因組測序，基因表達調控機理比較清楚，遺傳操作簡便能將外源基因表達產物分泌至培養(yǎng)基