血清清蛋白的分離、純化和鑒定知識(shí)分享

1、血清清蛋白的分離、純化和鑒定 二、基本原理二、基本原理 1、測量依據(jù)、測量依據(jù)淀粉酶催化淀粉分子中-1,4糖苷鍵水解,產(chǎn)生還原糖淀粉酶活力的大小與產(chǎn)生的還原糖的量成正比，可以單位體積樣品在一定時(shí)間內(nèi)生成的還原糖的量表示酶活力。2、相關(guān)反應(yīng)、相關(guān)反應(yīng): ：淀粉酶產(chǎn)生的這些還原糖能使3，5二硝基水楊酸還原，生成棕紅色的3氨基5硝基水楊酸。具體反應(yīng)式為： 三、操作步驟三、操作步驟 實(shí)驗(yàn)設(shè)備實(shí)驗(yàn)設(shè)備 試管，滴管，容量瓶，分光光度計(jì)，酸度計(jì)，電熱恒溫水浴鍋，電磁爐。1. 實(shí)驗(yàn)設(shè)備：實(shí)驗(yàn)設(shè)備： 三、操作步驟三、操作步驟 （1）0.1mol/l pH5.6的檸檬酸緩沖液：A液：稱取檸檬酸20.01g，定容至

2、1000ml；B液：稱取檸檬酸鈉29.41g，定容至1000ml；取A液55ml與B液145ml混勻。 （2）1%可溶性淀粉溶液：1g淀粉溶于100ml 0.1mol/l pH5.6的檸檬酸緩沖液；實(shí)驗(yàn)試劑及其配制實(shí)驗(yàn)試劑及其配制： （3）1%3,5-二硝基水楊酸試劑：稱取3,5-二硝基水楊酸1g、NaOH 1.6g、酒石酸鉀鈉30g，定容至100ml水中，緊蓋瓶塞，勿使CO2進(jìn)入； 麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：取麥芽糖0.1g溶于100ml水中； （5）pH 6.8的磷酸緩沖液: 取磷酸二氫鉀6.8g,加水500ml使溶解，用0.1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8，加水稀釋至1000ml即得。

3、（6）0.4mol/L的NaOH溶液； （7）淀粉酶溶液 三、操作步驟三、操作步驟 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟 淀粉酶活力測定淀粉酶活力測定 (1)取試管： 取試管4支,2支為對(duì)照管,2支為測定管。(2) 裝溶液：在2支對(duì)照管中分別加入4m1 0.4mol/L氫氧化鈉。 (3) 加試劑：在4支試管中各加入1ml pH5.6的檸檬酸緩沖液和淀粉酶溶液lml?；静僮骰静僮?4) 保溫：將4支試管置另一個(gè)37 恒溫水浴中保溫15min ,再向各管分別加入37下預(yù)熱的1淀粉溶液 2m1,搖勻,立即放入37恒溫水浴保溫5min。取出后向測定管迅速加入4ml 0.4mol/L氫氧化鈉,終止酶活動(dòng),準(zhǔn)備測糖。麥芽

4、糖的測定麥芽糖的測定 ： (1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作: 取試管7支,編號(hào).分別加入麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液（1mg/ml ）0,0.2,0.6, 1.0,1.4,1.8,2.0ml，然后用吸管向各管加蒸餾水使溶液達(dá)2.0ml,再各加3,5一二硝基水楊酸試劑2.0m1 ,置沸水浴中加熱10min，取出冷卻,用蒸餾水稀釋至25m1?；靹蚝笥梅止夤舛扔?jì)在520nm波長下進(jìn)行比色,記錄吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，以麥芽糖含量（ mg ）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 （操作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)操作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)） 樣品的測定: 取酶作用后的各管溶液2m1,分別放入相應(yīng)的8支25ml具塞刻度試管中,各加入2m1 3,5-二硝基水楊酸試劑。置沸水

5、浴中加熱10min .取出冷卻,用蒸餾水稀釋至25m1?；靹蚝笥梅止夤舛扔?jì)在520nm波長下進(jìn)行比色,記錄吸光度，根據(jù)樣品比色吸光度平均值,從標(biāo)準(zhǔn)曲線查出麥芽糖含量,最后進(jìn)行結(jié)果計(jì)算。計(jì)算公式：計(jì)算公式：相關(guān)實(shí)驗(yàn) 一、實(shí)驗(yàn)拓展一、實(shí)驗(yàn)拓展方法二：方法二：碘碘-淀粉測定淀粉酶活性淀粉測定淀粉酶活性 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆諟y定淀粉酶活性的原理掌握測定淀粉酶活性的原理熟悉測定淀粉酶活性操作方法熟悉測定淀粉酶活性操作方法 二、基本原理二、基本原理原理：淀粉酶催化淀粉分子中-1,4糖苷鍵水解,產(chǎn)生葡萄糖、麥芽糖及糊精。利用已知濃度的淀粉溶液作為底物，加入一定量的淀粉酶，在適應(yīng)條件下淀粉酶將部分淀粉水解。在底物過量的條件下，反應(yīng)后加入碘液與未被水解的淀粉結(jié)合成藍(lán)色復(fù)合物，其藍(lán)色的深淺與淀粉的濃度成正相關(guān),用分光光度計(jì)法測出反應(yīng)后淀粉的濃度，從而推算出單位體積樣品在一定時(shí)間內(nèi)消耗淀粉的量。 五、討論五、討論 依據(jù)血清電泳的結(jié)果作為陽依據(jù)血清電泳的結(jié)果作為陽性對(duì)照，判斷鹽析過濾液中性對(duì)照，判斷鹽析過濾液中有無清蛋白。有無清蛋白。 分析所獲得的清蛋白純度分析所獲得的清蛋白純度 分析有無分離獲得清蛋白分析有無分離獲得清蛋白 根據(jù)層析液樣品電泳結(jié)果中根據(jù)層析液樣品電泳結(jié)果中雜蛋白條帶出現(xiàn)的情況，判雜蛋白條帶出現(xiàn)的情況，判斷分離的清蛋白純