基因工程技術(shù)學(xué)習(xí)教案

1、會計學(xué)1基因工程基因工程(jyn gngchng)技術(shù)技術(shù)第一頁，共52頁。 The Nobel Prize in Chemistry 1980第1頁/共51頁第二頁，共52頁。體通過入工剪切、連接構(gòu)成重體通過入工剪切、連接構(gòu)成重組組DNADNA分子，將其導(dǎo)入受體細(xì)分子，將其導(dǎo)入受體細(xì)胞并使之無性繁殖（稱之為胞并使之無性繁殖（稱之為“克隆克隆”）和）和 表達(dá)，這種有表達(dá)，這種有目的的應(yīng)用分子克隆技術(shù)目的的應(yīng)用分子克隆技術(shù), ,人人為的改造基因為的改造基因, ,改變生物的遺改變生物的遺傳性狀的系列過程傳性狀的系列過程, ,總稱為基總稱為基因工程因工程第2頁/共51頁第三頁，共52頁。基因克隆基因

2、克隆(k ln)(gene cloning )(k ln)(gene cloning )：是指目的基因與載體是指目的基因與載體DNADNA連接構(gòu)成的連接構(gòu)成的DNADNA重組重組體在受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制、擴(kuò)增的技術(shù)。體在受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制、擴(kuò)增的技術(shù)?；虮磉_(dá)基因表達(dá)(biod)(gene expression)(biod)(gene expression)：是指目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)是指目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)(biod)(biod)，研究功能。，研究功能。第3頁/共51頁第四頁，共52頁。第4頁/共51頁第五頁，共52頁。分、切分、切 目的基因目的基因 + 載體分子載體分子 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 導(dǎo)入到合

3、適的受體細(xì)胞（轉(zhuǎn)化）導(dǎo)入到合適的受體細(xì)胞（轉(zhuǎn)化）接接 構(gòu)成重組構(gòu)成重組DNA分子分子篩篩 篩選含有重組分子的克隆篩選含有重組分子的克隆鑒鑒 鑒定重組分子片段鑒定重組分子片段 第5頁/共51頁第六頁，共52頁。第6頁/共51頁第七頁，共52頁。目的基因：研究對象目的基因：研究對象(duxing)載體：目的基因的運載工具載體：目的基因的運載工具工具酶：連接酶、限制性內(nèi)切酶工具酶：連接酶、限制性內(nèi)切酶 第7頁/共51頁第八頁，共52頁。第8頁/共51頁第九頁，共52頁。cDNART-PCR基因表達(dá)基因表達(dá)(biod)調(diào)調(diào)控的研究控的研究基因組DNAPCR第9頁/共51頁第十頁，共52頁。高保真聚合酶

4、：高保真聚合酶：HF, Pfu, Probest 等。等。第10頁/共51頁第十一頁，共52頁。第11頁/共51頁第十二頁，共52頁。按來源分： 質(zhì)粒載體(plasmid vector)、噬菌體載體(phage vector)、柯氏質(zhì)粒載體(cosmid vector)、病毒載體(virus vector ).按作用分：克隆載體(cloning vector )、表達(dá)(biod)載體(expression vector)、穿梭載體(shuttle vector)第12頁/共51頁第十三頁，共52頁。第13頁/共51頁第十四頁，共52頁。第14頁/共51頁第十五頁，共52頁。是細(xì)菌染色體外能夠是

5、細(xì)菌染色體外能夠(nnggu)自我復(fù)自我復(fù)制的雙鏈環(huán)狀制的雙鏈環(huán)狀 DNA 分子。分子。第15頁/共51頁第十六頁，共52頁。第16頁/共51頁第十七頁，共52頁。第17頁/共51頁第十八頁，共52頁。第18頁/共51頁第十九頁，共52頁。AA第19頁/共51頁第二十頁，共52頁。第20頁/共51頁第二十一頁，共52頁。第21頁/共51頁第二十二頁，共52頁。pCDNA3系列系列(xli) (Invitrogen)，第22頁/共51頁第二十三頁，共52頁。第23頁/共51頁第二十四頁，共52頁。第24頁/共51頁第二十五頁，共52頁。第25頁/共51頁第二十六頁，共52頁。（b）目的基因和載體

6、用兩種產(chǎn)生粘末端的限制酶 切割(qig)后連接，可控制目的基因的插入方向(定向克隆)。第26頁/共51頁第二十七頁，共52頁。第27頁/共51頁第二十八頁，共52頁。第28頁/共51頁第二十九頁，共52頁。Eco REco REco R第29頁/共51頁第三十頁，共52頁。Bgl IIAGATCTTCTAGABamH IGGATCCCCTAGGA GATCTTCTAG AG GATCCCCTAG G第30頁/共51頁第三十一頁，共52頁。pCMV第31頁/共51頁第三十二頁，共52頁。第32頁/共51頁第三十三頁，共52頁。第33頁/共51頁第三十四頁，共52頁。10ul 體系體系(tx)H2

7、O BufferVectorInsertligase4/14過夜過夜(guy)連接反應(yīng)條件連接反應(yīng)條件 連接酶的活性連接酶的活性; DNA的純度的純度, 載體與目的基因載體與目的基因(jyn)的比例的比例; PH值值7.2-7.8適宜適宜; 14(不高于不高于16)過夜過夜第34頁/共51頁第三十五頁，共52頁。第35頁/共51頁第三十六頁，共52頁。第36頁/共51頁第三十七頁，共52頁。第37頁/共51頁第三十八頁，共52頁。第38頁/共51頁第三十九頁，共52頁。第39頁/共51頁第四十頁，共52頁。第40頁/共51頁第四十一頁，共52頁?？焖偕L的細(xì)菌用低滲低濃(50 100mM) 的

8、氯化鈣（CaCl2)處理，使細(xì)胞腫脹成球形加入質(zhì)粒后，即于細(xì)胞表面形成抗DNAase的羥基(qingj)-磷酸鈣復(fù)合物經(jīng)42熱休克后，復(fù)合物被細(xì)胞吸收。非選擇性培養(yǎng)基上生長數(shù)小時，球狀細(xì)胞復(fù)原開始增殖,抗生素基因表達(dá)。第41頁/共51頁第四十二頁，共52頁?？剐曰虿迦肟剐曰虿迦?ch r)失活：生存或是毀滅失活：生存或是毀滅？互補(bǔ)現(xiàn)象：藍(lán)白斑篩選互補(bǔ)現(xiàn)象：藍(lán)白斑篩選LacZ-受體菌編碼受體菌編碼半乳糖苷酶羧基端（半乳糖苷酶羧基端（C端）片斷端）片斷載體編碼載體編碼一半乳糖一半乳糖苷酶氨基端（苷酶氨基端（N端）的端）的肽肽分解X-gal，藍(lán)色克隆不分解X-gal白色克隆第42頁/共51頁第四

9、十三頁，共52頁。第43頁/共51頁第四十四頁，共52頁。第44頁/共51頁第四十五頁，共52頁。4290s,+900ulLB,37 45min3*1ml菌液菌液沉淀沉淀(chndin)+0.5mlCaCl26000rpm 5min冰浴冰浴30min6000rpm 5min沉淀沉淀(chndin)+0.1mlCaCl2+10ul 連接連接(linji)產(chǎn)物產(chǎn)物+6ulPBR322陰性對照陰性對照A+TA+T陽性對照陽性對照AmpTet冰浴冰浴30min第45頁/共51頁第四十六頁，共52頁。挑菌落挑菌落(jnlu)，小抽質(zhì)粒，電泳，小抽質(zhì)粒，電泳菌落菌落(jnlu)PC(jnlu)PCR R94 10 min94 30s55 40s72 1min72 8min 4 holdX 30堿裂解