蛋白質(zhì)純化技術(shù)復(fù)習(xí)過程

1、蛋白質(zhì)的分離純化蛋白質(zhì)的分離純化(chn hu)與鑒與鑒定定Isolation, Purification and Identification of Protein第一頁(yè)，共84頁(yè)。分子生物學(xué)圣經(jīng)分子生物學(xué)圣經(jīng)分子克隆實(shí)驗(yàn)分子克隆實(shí)驗(yàn)(shyn)指南指南第二頁(yè)，共84頁(yè)。為什么要純化為什么要純化(chn hu)蛋白質(zhì)？蛋白質(zhì)？理論意義：深入研究某種蛋白質(zhì)的功能理論意義：深入研究某種蛋白質(zhì)的功能(gngnng)以及作用機(jī)制，如信號(hào)通路以及作用機(jī)制，如信號(hào)通路中的蛋白質(zhì)中的蛋白質(zhì)應(yīng)用價(jià)值應(yīng)用價(jià)值-蛋白質(zhì)工程蛋白質(zhì)工程 醫(yī)藥、工業(yè)、科研醫(yī)藥、工業(yè)、科研 作為藥物靶點(diǎn)作為藥物靶點(diǎn)蛋白質(zhì)是生命蛋白質(zhì)是

2、生命(shngmng)(shngmng)功能的執(zhí)行者功能的執(zhí)行者第三頁(yè)，共84頁(yè)。蛋白質(zhì)工程蛋白質(zhì)工程(gngchng)中進(jìn)行蛋白質(zhì)純化中進(jìn)行蛋白質(zhì)純化的必要性的必要性 首先，需要單一的蛋白質(zhì)作為實(shí)驗(yàn)材料，首先，需要單一的蛋白質(zhì)作為實(shí)驗(yàn)材料，研究其結(jié)構(gòu)與功能；研究其結(jié)構(gòu)與功能； 其次，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾改造時(shí)需要單一其次，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾改造時(shí)需要單一的蛋白質(zhì)作為原材料；的蛋白質(zhì)作為原材料； 最后，為了生產(chǎn)性能更優(yōu)良的蛋白質(zhì)，需最后，為了生產(chǎn)性能更優(yōu)良的蛋白質(zhì)，需要對(duì)設(shè)計(jì)改造過的蛋白質(zhì)進(jìn)行大量純化要對(duì)設(shè)計(jì)改造過的蛋白質(zhì)進(jìn)行大量純化(chn hu)，從而開發(fā)出相關(guān)產(chǎn)品。，從而開發(fā)出相關(guān)產(chǎn)品。第四頁(yè)

3、，共84頁(yè)。本章本章(bn zhn)概要概要蛋白質(zhì)純化方法蛋白質(zhì)純化方法蛋白質(zhì)純化原則蛋白質(zhì)純化原則(yunz)純化步驟純化步驟蛋白質(zhì)的鑒定蛋白質(zhì)的鑒定第五頁(yè)，共84頁(yè)。一、蛋白一、蛋白(dnbi)純化方法純化方法蛋白質(zhì)純化蛋白質(zhì)純化(chn hu)的根據(jù)：的根據(jù)： 不同的蛋白質(zhì)，理化性質(zhì)不同。不同的蛋白質(zhì)，理化性質(zhì)不同。理化性質(zhì)不同的原因：理化性質(zhì)不同的原因： 氨基酸的數(shù)目和序列不同。氨基酸的數(shù)目和序列不同。第六頁(yè)，共84頁(yè)。1.與蛋白質(zhì)分離與蛋白質(zhì)分離(fnl)純化相關(guān)的理化純化相關(guān)的理化特性特性分子大小分子大小(dxio)分子形狀分子形狀帶電特性帶電特性溶解特性溶解特性與配體特異性結(jié)合不

4、同與配體特異性結(jié)合不同吸附性質(zhì)吸附性質(zhì)變性和復(fù)性變性和復(fù)性第七頁(yè)，共84頁(yè)。1.1分子分子(fnz)大小大小蛋白質(zhì)分子大小主要取決于：蛋白質(zhì)分子大小主要取決于： 蛋白質(zhì)肽鏈的數(shù)目蛋白質(zhì)肽鏈的數(shù)目 每條肽鏈的氨基酸殘基數(shù)目。每條肽鏈的氨基酸殘基數(shù)目。幾百幾百百萬(wàn)百萬(wàn) Da常用方法常用方法透析透析超濾超濾凝膠過濾凝膠過濾(gul)離心離心第八頁(yè)，共84頁(yè)。 透析透析(dialysis)利用利用(lyng)透析袋透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開的方分子化合物分開的方法。法。第九頁(yè)，共84頁(yè)。第十頁(yè)，共84頁(yè)。 超濾法超濾法 應(yīng)用正壓或離心力使應(yīng)用正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液蛋白質(zhì)

5、溶液(rngy)透透過有一定截留分子量過有一定截留分子量的超濾膜，達(dá)到濃縮的超濾膜，達(dá)到濃縮蛋白質(zhì)溶液蛋白質(zhì)溶液(rngy)的的目的。目的。第十一頁(yè)，共84頁(yè)。 超濾法超濾法 應(yīng)用正壓或離心力使應(yīng)用正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液透過有一定蛋白質(zhì)溶液透過有一定(ydng)截留分子量的截留分子量的超濾膜，達(dá)到濃縮蛋白超濾膜，達(dá)到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的。質(zhì)溶液的目的。第十二頁(yè)，共84頁(yè)。凝膠過濾凝膠過濾(gul) 是按照天然蛋白質(zhì)相對(duì)分子是按照天然蛋白質(zhì)相對(duì)分子(fnz)(fnz)質(zhì)量大小進(jìn)行分離的技質(zhì)量大小進(jìn)行分離的技術(shù)，又稱為分子術(shù)，又稱為分子(fnz)(fnz)篩層析篩層析或排阻層析。或排阻層析。 第

6、十三頁(yè)，共84頁(yè)。第十四頁(yè)，共84頁(yè)。超速離心超速離心離心（離心（centrifugation）：利用機(jī)械的快速旋）：利用機(jī)械的快速旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生轉(zhuǎn)所產(chǎn)生(chnshng)的離心力，將不同密度的離心力，將不同密度的物質(zhì)分離開來的方法。的物質(zhì)分離開來的方法。 超速離心法超速離心法 (ultracentrifugation)：60萬(wàn)萬(wàn) g ， 6萬(wàn)萬(wàn)8萬(wàn)萬(wàn) r/min。可用來測(cè)定?？捎脕頊y(cè)定(cdng)蛋白質(zhì)分子量。蛋白質(zhì)分子量。第十五頁(yè)，共84頁(yè)。超速離心超速離心第十六頁(yè)，共84頁(yè)。1.2分子分子(fnz)形狀形狀形狀形狀蛋白質(zhì)在離心通過溶液時(shí)，或通過膜、蛋白質(zhì)在離心通過溶液時(shí)，或通過膜、凝膠過濾填

7、料顆?；螂娪灸z過濾填料顆?；螂娪?din yn)凝膠中時(shí)，都會(huì)受到分子形狀的影響。凝膠中時(shí)，都會(huì)受到分子形狀的影響。方法方法梯度離心梯度離心電泳電泳(din yn)第十七頁(yè)，共84頁(yè)。1.3電荷電荷(dinh)原理原理蛋白質(zhì)的凈電荷與蛋白質(zhì)等電點(diǎn)蛋白質(zhì)的凈電荷與蛋白質(zhì)等電點(diǎn)pI以及以及環(huán)境環(huán)境pH值有關(guān)值有關(guān)(yugun)（pHpI，），）方法方法電泳電泳離子交換層析離子交換層析第十八頁(yè)，共84頁(yè)。第十九頁(yè)，共84頁(yè)。1.4溶解度溶解度原理原理蛋白質(zhì)分子表面親水性和疏水性帶電基蛋白質(zhì)分子表面親水性和疏水性帶電基團(tuán)不同，因此在溶劑中的溶解度不同。團(tuán)不同，因此在溶劑中的溶解度不同。通過改變通過改

8、變pH、離子強(qiáng)度或加入有機(jī)試劑，、離子強(qiáng)度或加入有機(jī)試劑，促進(jìn)蛋白質(zhì)分子的凝聚進(jìn)而促進(jìn)蛋白質(zhì)分子的凝聚進(jìn)而(jn r)形成形成沉淀。沉淀。方法：沉淀法方法：沉淀法鹽析法（鹽析法（eg. 硫酸銨）硫酸銨）有機(jī)溶劑沉淀法（有機(jī)溶劑沉淀法（eg. 丙酮）丙酮）等電點(diǎn)沉淀法等電點(diǎn)沉淀法第二十頁(yè)，共84頁(yè)。 蛋白質(zhì)在高濃度中性蛋白質(zhì)在高濃度中性(zhngxng)鹽溶液中鹽溶液中會(huì)沉淀析出，稱為鹽析。會(huì)沉淀析出，稱為鹽析。 鹽析原理：鹽析原理： 高濃度鹽離子破壞蛋白質(zhì)分子表面的水化高濃度鹽離子破壞蛋白質(zhì)分子表面的水化膜，影響蛋白質(zhì)分子表面所帶電荷，從而膜，影響蛋白質(zhì)分子表面所帶電荷，從而引起蛋白質(zhì)沉淀，但

9、通常不會(huì)引起蛋白質(zhì)引起蛋白質(zhì)沉淀，但通常不會(huì)引起蛋白質(zhì)的變性。的變性。鹽析鹽析(yn x)(yn x)法法第二十一頁(yè)，共84頁(yè)。1.5配體特異性結(jié)合配體特異性結(jié)合(jih) 原理原理 生物生物(shngw)大分子的某些特定結(jié)構(gòu)區(qū)域能大分子的某些特定結(jié)構(gòu)區(qū)域能夠特異性識(shí)別其他分子并可逆結(jié)合，生物夠特異性識(shí)別其他分子并可逆結(jié)合，生物(shngw)分子間的這種結(jié)合能力稱為親和力。分子間的這種結(jié)合能力稱為親和力。 方法方法 將具有親和力的兩個(gè)分子中的一個(gè)固定在不溶將具有親和力的兩個(gè)分子中的一個(gè)固定在不溶性基質(zhì)上，利用分子間親和力的特異性和可逆性基質(zhì)上，利用分子間親和力的特異性和可逆性對(duì)另一個(gè)分子進(jìn)行分

10、離純化。性對(duì)另一個(gè)分子進(jìn)行分離純化。 分類分類 免疫親和層析免疫親和層析 生物生物(shngw)親和層析親和層析 金屬螯合親和層析金屬螯合親和層析第二十二頁(yè)，共84頁(yè)。1.6吸附吸附(xf)性質(zhì)性質(zhì) 原理原理 蛋白質(zhì)可吸附在不同材料蛋白質(zhì)可吸附在不同材料(cilio)的表面，的表面，如金屬、陶瓷、塑料等。如金屬、陶瓷、塑料等。 方法方法 疏水層析疏水層析第二十三頁(yè)，共84頁(yè)。1.7變性變性(binxng)和復(fù)性和復(fù)性 原理原理 變性：蛋白質(zhì)在一定變性：蛋白質(zhì)在一定(ydng)的理化條件下會(huì)的理化條件下會(huì)失去原有的空間結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能及部分理化失去原有的空間結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能及部分理化特性。特性。

11、 復(fù)性：當(dāng)變性條件去除后恢復(fù)原有的空間結(jié)構(gòu)復(fù)性：當(dāng)變性條件去除后恢復(fù)原有的空間結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能。及生物學(xué)功能。 方法方法 如，利用尿素的變性和復(fù)性方法，從包涵體中如，利用尿素的變性和復(fù)性方法，從包涵體中純化原核表達(dá)蛋白純化原核表達(dá)蛋白第二十四頁(yè)，共84頁(yè)。2. 分離分離(fnl)方法方法在實(shí)驗(yàn)操作上，分為：在實(shí)驗(yàn)操作上，分為：沉淀法沉淀法離心法離心法電泳法電泳法超濾法超濾法相分配相分配(fnpi)法法層析法層析法第二十五頁(yè)，共84頁(yè)。第二十六頁(yè)，共84頁(yè)。* *不可能有一套統(tǒng)一的方法適用于分離不可能有一套統(tǒng)一的方法適用于分離(fnl)(fnl)純化所有的蛋白質(zhì)，純化所有的蛋白質(zhì)，* *但每一種

12、蛋白質(zhì)可能都有一套適合的分離但每一種蛋白質(zhì)可能都有一套適合的分離(fnl)(fnl)純化程序，純化程序，* *而且所用的主要技術(shù)手段都基本相同。而且所用的主要技術(shù)手段都基本相同。Note第二十七頁(yè)，共84頁(yè)。二、蛋白質(zhì)純化的總原則二、蛋白質(zhì)純化的總原則(yunz)和和純化步驟純化步驟總原則總原則以合理的效率、速度、收率和純度，以合理的效率、速度、收率和純度，將目標(biāo)蛋白從細(xì)胞的全部其他將目標(biāo)蛋白從細(xì)胞的全部其他(qt)成成分，特別是從雜蛋白中分離出來，分，特別是從雜蛋白中分離出來，同時(shí)仍保留其生物學(xué)活性和化學(xué)完整同時(shí)仍保留其生物學(xué)活性和化學(xué)完整性。性。第二十八頁(yè)，共84頁(yè)。二、蛋白質(zhì)純化的總原則

13、二、蛋白質(zhì)純化的總原則(yunz)和和純化步驟純化步驟 步驟步驟(bzhu) 選擇實(shí)驗(yàn)材料，實(shí)驗(yàn)材料預(yù)處理選擇實(shí)驗(yàn)材料，實(shí)驗(yàn)材料預(yù)處理 蛋白質(zhì)的提取蛋白質(zhì)的提取 蛋白質(zhì)的粗分級(jí)蛋白質(zhì)的粗分級(jí) 蛋白質(zhì)的細(xì)分級(jí)蛋白質(zhì)的細(xì)分級(jí) 蛋白質(zhì)的鑒定蛋白質(zhì)的鑒定 第二十九頁(yè)，共84頁(yè)。蛋白質(zhì)純化蛋白質(zhì)純化(chn hu)的前期準(zhǔn)的前期準(zhǔn)備備 關(guān)于蛋白質(zhì)我們已知什么？關(guān)于蛋白質(zhì)我們已知什么？最好的來源？最好的來源？蛋白質(zhì)純度要求？活性要求？蛋白質(zhì)純度要求？活性要求？純化蛋白的量？純化蛋白的量？如何進(jìn)行如何進(jìn)行(jnxng)鑒定？鑒定？純化時(shí)間長(zhǎng)短？純化時(shí)間長(zhǎng)短？最終花費(fèi)？最終花費(fèi)？純化方案？純化方案？第三十頁(yè)，

14、共84頁(yè)。1、選擇實(shí)驗(yàn)、選擇實(shí)驗(yàn)(shyn)材料及預(yù)處理材料及預(yù)處理 選擇實(shí)驗(yàn)材料選擇實(shí)驗(yàn)材料 物種的選擇物種的選擇 組織的選擇組織的選擇 實(shí)驗(yàn)材料預(yù)處理實(shí)驗(yàn)材料預(yù)處理 液體材料液體材料 過濾過濾 離心離心 固體材料固體材料 洗滌：自來水洗滌：自來水蒸餾水蒸餾水提取提取(tq)緩沖液緩沖液 材料破碎：材料破碎：第三十一頁(yè)，共84頁(yè)。材料材料(cilio)破碎破碎 機(jī)械剪碎機(jī)械剪碎 研磨研磨 反復(fù)凍融法反復(fù)凍融法 超聲破碎法超聲破碎法 高壓勻漿高壓勻漿(yn jin)法法 酶解法酶解法第三十二頁(yè)，共84頁(yè)。2、蛋白質(zhì)的提取、蛋白質(zhì)的提取(tq) 提取分離原則提取分離原則 盡可能多地提取目的蛋白，

15、同時(shí)避免活盡可能多地提取目的蛋白，同時(shí)避免活性丟失性丟失(dis)（溫度過高、（溫度過高、 pH、有機(jī)試、有機(jī)試劑、金屬離子、蛋白酶等因素）劑、金屬離子、蛋白酶等因素） 選擇合適的選擇合適的pH、選擇合適的離子強(qiáng)度、選擇合適的離子強(qiáng)度第三十三頁(yè)，共84頁(yè)。2、蛋白質(zhì)的提取、蛋白質(zhì)的提取(tq) 提取液成分提取液成分(chng fn)的確定的確定 pH 緩沖液：緩沖液：Tris-HCl, Tris-Gly, Gly-HCl, 檸檬檸檬酸酸-檸檬酸鈉檸檬酸鈉 離子：動(dòng)物離子：動(dòng)物 NaCl, 植物植物KCl 還原劑還原劑:DTT 蛋白酶抑制劑：蛋白酶抑制劑：EDTA, PMSF 金屬離子螯合劑金屬

16、離子螯合劑: EDTA, EGTA 去污劑去污劑:SDS, CHAPS, Triton X-100, Tween-20 甘油甘油 溫度溫度 04第三十四頁(yè)，共84頁(yè)。3、蛋白質(zhì)的粗分級(jí)、蛋白質(zhì)的粗分級(jí)(fn j)（粗提）（粗提） 使用蛋白質(zhì)提取緩沖液提取實(shí)驗(yàn)材料后，蛋白使用蛋白質(zhì)提取緩沖液提取實(shí)驗(yàn)材料后，蛋白提取液中目標(biāo)蛋白質(zhì)的濃度往往較低，采取一提取液中目標(biāo)蛋白質(zhì)的濃度往往較低，采取一些簡(jiǎn)單的方法使目標(biāo)蛋白質(zhì)濃縮，同時(shí)去除大些簡(jiǎn)單的方法使目標(biāo)蛋白質(zhì)濃縮，同時(shí)去除大量的雜質(zhì)。量的雜質(zhì)。 常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)(jsh)：沉淀法（鹽析、有機(jī)：沉淀法（鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、等電點(diǎn)沉淀）、超速離

17、心、透析、溶劑沉淀、等電點(diǎn)沉淀）、超速離心、透析、超濾超濾第三十五頁(yè)，共84頁(yè)。4、蛋白質(zhì)的細(xì)分級(jí)、蛋白質(zhì)的細(xì)分級(jí) 粗分級(jí)只是使蛋白質(zhì)得到濃縮和初步分離純化，粗分級(jí)只是使蛋白質(zhì)得到濃縮和初步分離純化，多數(shù)情況下還要根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小、分子形多數(shù)情況下還要根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小、分子形狀、分子表面特征或分子帶電狀況進(jìn)一步純化。狀、分子表面特征或分子帶電狀況進(jìn)一步純化。 常用的實(shí)驗(yàn)常用的實(shí)驗(yàn)(shyn)技術(shù)：層析技術(shù)：層析第三十六頁(yè)，共84頁(yè)。4.1. 層析層析(cn x)（ chromatography ）固定固定(gdng)(gdng)相：凝膠相：凝膠流動(dòng)流動(dòng)(lidng)(lidng)相：緩沖液

18、相：緩沖液原理：原理：第三十七頁(yè)，共84頁(yè)。BioGelA agaroseBioGel P acrylamideSephadex glucose (dextrose)Sepharose agaroseSephacryl glucose + acrylamideSephacel cellulose第三十八頁(yè)，共84頁(yè)。 層析層析(cn x)裝置裝置（Chromatographic equipment）蠕動(dòng)泵蠕動(dòng)泵層析柱層析柱檢測(cè)器檢測(cè)器記錄儀記錄儀部分部分(b (b fen)fen)收集器收集器第三十九頁(yè)，共84頁(yè)。 第四十頁(yè)，共84頁(yè)。第四十一頁(yè)，共84頁(yè)。4.1. 層析層析(cn x)（ c

19、hromatography ） 分子篩層析（分子篩層析（ Gel filtration ） 離子交換離子交換(l z jio hun)層析（層析（ Ion exchange ） 疏水作用層析（疏水作用層析（ Hydrophobic interaction ） 親和層析（親和層析（ Affinity ）第四十二頁(yè)，共84頁(yè)。4.1.1 分子篩層析分子篩層析(cn x) （Gel filtration） 原理原理 也稱為也稱為(chn wi)凝膠過濾、排阻層析。凝膠過濾、排阻層析。是以多孔凝膠材料為支持物，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液是以多孔凝膠材料為支持物，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液流經(jīng)此支持物時(shí)，分子大小不同的蛋白質(zhì)所流經(jīng)

20、此支持物時(shí)，分子大小不同的蛋白質(zhì)所受到的阻滯作用不同而先后流出，從而達(dá)到受到的阻滯作用不同而先后流出，從而達(dá)到分離純化的目的。分離純化的目的。 凝膠介質(zhì)凝膠介質(zhì) 葡聚糖葡聚糖 （glucose） 瓊脂糖瓊脂糖 （agarose） 聚丙烯酰胺（聚丙烯酰胺（acrylamide） 纖維素（纖維素（cellulose）第四十三頁(yè)，共84頁(yè)。分子篩層析分子篩層析(cn x)Gel filtration chromatographyHydrophilicNo spontaneous binding to proteins.Chemically and physically stableRigid to

21、allow a high linear flow-rate親水親水對(duì)蛋白質(zhì)親和力低對(duì)蛋白質(zhì)親和力低物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定(wndng)(wndng)流速穩(wěn)定流速穩(wěn)定(wndng)(wndng)第四十四頁(yè)，共84頁(yè)。分子篩層析分子篩層析(cn x)Gel filtration chromatography第四十五頁(yè)，共84頁(yè)。分子篩層析分子篩層析(cn x)Gel filtration chromatography第四十六頁(yè)，共84頁(yè)。分子篩層析分子篩層析(cn x)Gel filtration chromatography第四十七頁(yè)，共84頁(yè)。4.1.2 離子交換離子交換(l z j

22、io hun)層析層析（ Ion exchange ） 原理原理 在一定的在一定的pH條件下，不同的蛋白質(zhì)帶有的條件下，不同的蛋白質(zhì)帶有的電荷的種類和數(shù)量不同，因此它們與帶電電荷的種類和數(shù)量不同，因此它們與帶電的凝膠顆粒間的電荷相互作用不同。的凝膠顆粒間的電荷相互作用不同。 利用利用(lyng)蛋白質(zhì)和帶電凝膠之間作用蛋白質(zhì)和帶電凝膠之間作用力的差別，把蛋白質(zhì)分開的層析方法。力的差別，把蛋白質(zhì)分開的層析方法。第四十八頁(yè)，共84頁(yè)。4.1.2 離子交換離子交換(l z jio hun)層析層析（ Ion exchange ） 種類種類 陽(yáng)離子交換柱：凝膠帶負(fù)電荷，蛋白質(zhì)帶陽(yáng)離子交換柱：凝膠帶負(fù)電

23、荷，蛋白質(zhì)帶正電荷正電荷 陰離子交換柱：凝膠帶正電荷，蛋白質(zhì)帶陰離子交換柱：凝膠帶正電荷，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷負(fù)電荷 介質(zhì)介質(zhì)(jizh) 惰性支持物：瓊脂糖，葡聚糖惰性支持物：瓊脂糖，葡聚糖 帶電基團(tuán)：羧甲基帶電基團(tuán)：羧甲基帶負(fù)電；二乙基氨帶負(fù)電；二乙基氨基基帶正電帶正電 平衡離子：平衡離子： 負(fù)電基團(tuán)：負(fù)電基團(tuán)：H+或或Na+ 正電基團(tuán)：正電基團(tuán)：OH-或或Cl-第四十九頁(yè)，共84頁(yè)。離子交換離子交換(l z jio hun)層析層析（ Ion exchange ）陽(yáng)離子交陽(yáng)離子交換換(jiohu(jiohun)n)：陰離子陰離子 先，陽(yáng)離先，陽(yáng)離子子 后后陰離子交陰離子交換換(jiohu(ji

24、ohun)n)：陽(yáng)離子陽(yáng)離子 先，陰離先，陰離子子 后后第五十頁(yè)，共84頁(yè)。4.1.3 親和層析親和層析（Affinity chromatography） 原理原理 利用蛋白質(zhì)與配體專一性識(shí)別并結(jié)合的利用蛋白質(zhì)與配體專一性識(shí)別并結(jié)合的特性而分離蛋白質(zhì)的一種層析方法。特性而分離蛋白質(zhì)的一種層析方法。 將配體固定于支持物上，當(dāng)混合將配體固定于支持物上，當(dāng)混合(hnh)樣品流過此支持物時(shí)，只有目標(biāo)蛋白能樣品流過此支持物時(shí)，只有目標(biāo)蛋白能與配體專一性結(jié)合。先用緩沖液洗脫雜與配體專一性結(jié)合。先用緩沖液洗脫雜蛋白，然后改變洗脫條件，將目標(biāo)蛋白蛋白，然后改變洗脫條件，將目標(biāo)蛋白洗脫下來。洗脫下來。第五十一頁(yè)

25、，共84頁(yè)。親和層析親和層析（Affinity chromatography）第五十二頁(yè)，共84頁(yè)。His-親合示意圖（金屬親合示意圖（金屬(jnsh)螯螯合層析）合層析） 鎳柱（鎳柱（Ni-NTA）第五十三頁(yè)，共84頁(yè)。4.1.4 疏水作用疏水作用(zuyng)層析層析 原理原理 蛋白質(zhì)表面疏水基團(tuán)蛋白質(zhì)表面疏水基團(tuán)(j tun)與與介質(zhì)疏水配體的可逆相互作用介質(zhì)疏水配體的可逆相互作用 方法方法 高離子強(qiáng)度下待分離的樣品吸高離子強(qiáng)度下待分離的樣品吸附在疏水介質(zhì)上，然后降低離附在疏水介質(zhì)上，然后降低離子強(qiáng)度選擇性將樣品解吸，疏子強(qiáng)度選擇性將樣品解吸，疏水弱的物質(zhì)先洗脫，疏水強(qiáng)的水弱的物質(zhì)先洗脫

26、，疏水強(qiáng)的物質(zhì)后洗脫。物質(zhì)后洗脫。第五十四頁(yè)，共84頁(yè)。4.2.電泳電泳(din yn)（ Electrophoresis ） 電泳就是帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，向著與其電性相電泳就是帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，向著與其電性相反反(xingfn)的電極移動(dòng)。的電極移動(dòng)。第五十五頁(yè)，共84頁(yè)。蛋白質(zhì)常用蛋白質(zhì)常用(chn yn)電泳技術(shù)電泳技術(shù) 聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE） SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE） 等電聚焦等電聚焦(jjio)電泳（電泳（ Isoelectric focusing- IEF） 雙向電泳（雙向電泳（ Two Dimension

27、al Electrophoresis ）第五十六頁(yè)，共84頁(yè)。4.2.1 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 SDS： 1、覆蓋蛋白質(zhì)表面電荷，消除電荷差異、覆蓋蛋白質(zhì)表面電荷，消除電荷差異 2、改變、改變(gibin)蛋白質(zhì)分子構(gòu)象，消除形狀差蛋白質(zhì)分子構(gòu)象，消除形狀差異異第五十七頁(yè)，共84頁(yè)。電泳法測(cè)目標(biāo)電泳法測(cè)目標(biāo)(mbio)蛋白的分子量蛋白的分子量第五十八頁(yè)，共84頁(yè)。4.2.2不連續(xù)不連續(xù)PAGE分離分離(fnl)蛋白質(zhì)的原理蛋白質(zhì)的原理 在不連續(xù)電泳系統(tǒng)中，所帶電荷、分子大小和形狀在不連續(xù)電泳系統(tǒng)中，所帶電荷、分子大小和形狀不同不同(b tn)的蛋白質(zhì)在凝膠中能夠被分離。的

28、蛋白質(zhì)在凝膠中能夠被分離。 原理原理 電荷效應(yīng)電荷效應(yīng) 濃縮效應(yīng)濃縮效應(yīng) 快慢離子效應(yīng)快慢離子效應(yīng) 凝膠濃度差效應(yīng)凝膠濃度差效應(yīng) 分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng)第五十九頁(yè)，共84頁(yè)。4.2.3 等電聚焦等電聚焦(jjio)電泳電泳（Isoelectric focusingIEF）第六十頁(yè)，共84頁(yè)。等電聚焦等電聚焦(jjio)（Isoelectric focusing）第六十一頁(yè)，共84頁(yè)。4.2.4 雙向電泳雙向電泳 第一向：等電聚焦第一向：等電聚焦 （pI） 第二向：第二向：SDS-PAGE (MW) 雙向電泳技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中蛋白質(zhì)多肽雙向電泳技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中蛋白質(zhì)多肽鏈分離純化鏈分離純

29、化(chn hu)和鑒定的主要實(shí)驗(yàn)技術(shù)之和鑒定的主要實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一。一。第六十二頁(yè)，共84頁(yè)。Isoelectric focusingSDS gel electrophoresis第六十三頁(yè)，共84頁(yè)。Two Dimensional Electrophoresis of E. coli Proteins - more than 2,000 proteins were visualized第六十四頁(yè)，共84頁(yè)。蛋白質(zhì)純化蛋白質(zhì)純化(chn hu)策略策略方案設(shè)計(jì)篇方案設(shè)計(jì)篇 Protein purification strategy第六十五頁(yè)，共84頁(yè)。三、純化三、純化(chn hu)方案設(shè)計(jì)原則

30、方案設(shè)計(jì)原則確定純化目標(biāo)確定純化目標(biāo)purity, activity and quantity充分了解目的充分了解目的(md)蛋白及主要雜質(zhì)的理化特性蛋白及主要雜質(zhì)的理化特性to simplify technique selection and optimisation確定活性測(cè)定方法確定活性測(cè)定方法fast detection of protein activity/recovery and critical contaminants 盡量減少純化步驟盡量減少純化步驟extra steps reduce yield and increase time, combine steps logic

31、ally第六十六頁(yè)，共84頁(yè)。確定確定(qudng)(qudng)純化目標(biāo)純化目標(biāo)第六十七頁(yè)，共84頁(yè)。三、純化三、純化(chn hu)方案設(shè)計(jì)原則方案設(shè)計(jì)原則確定目標(biāo)確定目標(biāo)purity, activity and quantity充分了解充分了解(lioji)目的蛋白及主要雜質(zhì)的理化特目的蛋白及主要雜質(zhì)的理化特性性to simplify technique selection and optimisation確定活性測(cè)定方法確定活性測(cè)定方法fast detection of protein activity/recovery and critical contaminants 盡量減少純化

32、步驟盡量減少純化步驟extra steps reduce yield and increase time, combine steps logically第六十八頁(yè)，共84頁(yè)。三、純化三、純化(chn hu)方案設(shè)計(jì)原則方案設(shè)計(jì)原則確定目標(biāo)確定目標(biāo)purity, activity and quantity充分了解目的蛋白及主要充分了解目的蛋白及主要(zhyo)雜質(zhì)的理化特性雜質(zhì)的理化特性to simplify technique selection and optimisation確定活性測(cè)定方法確定活性測(cè)定方法fast detection of protein activity/recove

33、ry and critical contaminants 盡量減少純化步驟盡量減少純化步驟extra steps reduce yield and increase time, combine steps logically第六十九頁(yè)，共84頁(yè)。 嚴(yán)格依據(jù)目標(biāo)蛋白質(zhì)的特殊生物學(xué)性質(zhì)，來設(shè)計(jì)活嚴(yán)格依據(jù)目標(biāo)蛋白質(zhì)的特殊生物學(xué)性質(zhì)，來設(shè)計(jì)活性檢測(cè)方案性檢測(cè)方案 常見常見(chn jin)檢測(cè)方法檢測(cè)方法: 酶學(xué)檢測(cè)酶學(xué)檢測(cè) enzymatic assays. 配體檢測(cè)配體檢測(cè) ligand-binding assays 免疫檢測(cè)免疫檢測(cè) immunological assays活性測(cè)定方法的要求：快

34、速活性測(cè)定方法的要求：快速(kui s)(kui s)、簡(jiǎn)便、簡(jiǎn)便、特異和定量特異和定量確定活性檢測(cè)確定活性檢測(cè)(jin c)(jin c)方法方法第七十頁(yè)，共84頁(yè)。三、純化三、純化(chn hu)方案設(shè)計(jì)原則方案設(shè)計(jì)原則確定目標(biāo)確定目標(biāo)purity, activity and quantity充分了解充分了解(lioji)目的蛋白及主要雜質(zhì)的理化特目的蛋白及主要雜質(zhì)的理化特性性to simplify technique selection and optimisation確定活性測(cè)定方法確定活性測(cè)定方法fast detection of protein activity/recovery

35、and critical contaminants 盡量減少純化步驟盡量減少純化步驟extra steps reduce yield and increase time, combine steps logically第七十一頁(yè)，共84頁(yè)。盡量減少純化盡量減少純化(chn hu)(chn hu)步驟步驟純化步驟純化步驟(bzhu)(bzhu)越多，樣品損失越大（產(chǎn)量、活性）越多，樣品損失越大（產(chǎn)量、活性）第七十二頁(yè)，共84頁(yè)。 減少每步操作時(shí)間減少每步操作時(shí)間 to avoid lengthy procedures which risk losing activity/reducing rec

36、overy 減少添加物減少添加物 additives may need to be removed in an extra purification step or may interfere with activity assays 早期早期(zoq)除去降解物（如蛋白酶）除去降解物（如蛋白酶） for example, proteases 每步使用不同的純化方法每步使用不同的純化方法 to take advantage of sample characteristics which can be used for separation (size, charge, hydrophobici

37、ty, ligand specificity)KEEP IT SIMPLE!盡量減少純化盡量減少純化(chn hu)(chn hu)步驟步驟第七十三頁(yè)，共84頁(yè)。四、蛋白質(zhì)的鑒定四、蛋白質(zhì)的鑒定(jindng) 1. 濃度測(cè)定：凱氏定氮法、紫外吸收法濃度測(cè)定：凱氏定氮法、紫外吸收法 2. 純度測(cè)定：電泳法純度測(cè)定：電泳法 3. 特性測(cè)定：特性測(cè)定： 蛋白質(zhì)分子蛋白質(zhì)分子(fnz)質(zhì)量與等電點(diǎn)的測(cè)定質(zhì)量與等電點(diǎn)的測(cè)定 氨基酸組成及順序分析氨基酸組成及順序分析 蛋白質(zhì)結(jié)晶與結(jié)構(gòu)分析蛋白質(zhì)結(jié)晶與結(jié)構(gòu)分析 蛋白質(zhì)活性及功能測(cè)定蛋白質(zhì)活性及功能測(cè)定第七十四頁(yè)，共84頁(yè)。1 濃度濃度(nngd)測(cè)定測(cè)定凱氏定氮法凱氏定氮法紫外吸收紫外吸收(xshu)法法分光光度法分光光度法考馬斯亮藍(lán)法考馬斯亮藍(lán)法第七十五頁(yè)，共84頁(yè)。1 濃度濃度(nngd)測(cè)定測(cè)定凱氏定氮法：凱氏定氮法：蛋白質(zhì)平均含氮量為蛋白質(zhì)平