第五章毛細管電泳

1、第五章第五章 毛細管電泳法毛細管電泳法High performance capillary High performance capillary electrophoresiselectrophoresis毛細管電泳的基本概念及主要應用毛細管電泳的基本概念及主要應用毛細管電泳毛細管電泳 毛細管電泳毛細管電泳 指一系列以內(nèi)徑指一系列以內(nèi)徑10 10 200m200m的毛細管柱為分的毛細管柱為分離通道，以離通道，以高壓直流電高壓直流電為分離動力對大分子和小為分離動力對大分子和小分子等進行高效分離和檢測的有關技術的統(tǒng)稱分子等進行高效分離和檢測的有關技術的統(tǒng)稱 毛細管電泳和傳統(tǒng)電泳的區(qū)別毛細管電泳和傳

2、統(tǒng)電泳的區(qū)別 傳統(tǒng)的電泳是在平板凝膠的兩端加上一定的電傳統(tǒng)的電泳是在平板凝膠的兩端加上一定的電壓使組分分離壓使組分分離 毛細管電泳是在毛細管電泳是在散熱效率散熱效率極高的毛細管內(nèi)進行，極高的毛細管內(nèi)進行，它可以加上它可以加上 0 0 30 KV 30 KV 的高電壓進行分離，達的高電壓進行分離，達到快速、高效到快速、高效毛細管電泳的特點毛細管電泳的特點毛細管的特點毛細管的特點 容積小，以容積小，以100100長、長、75m75m內(nèi)徑的毛細管計，內(nèi)徑的毛細管計，容積僅為容積僅為4.4 l4.4 l 側(cè)面?zhèn)让? /截面積比大，使毛細管散熱快，能承受截面積比大，使毛細管散熱快，能承受100 100

3、1000V/cm1000V/cm的高電場的高電場 能使用自由溶液、凝膠等作為支持介質(zhì)能使用自由溶液、凝膠等作為支持介質(zhì) 在溶液介質(zhì)下能產(chǎn)生平面形狀的電滲流在溶液介質(zhì)下能產(chǎn)生平面形狀的電滲流毛細管電泳的特點毛細管電泳的特點( (續(xù)）續(xù)） 毛細管電泳的特點毛細管電泳的特點 高效：區(qū)帶電泳中，柱效一般為幾十萬高效：區(qū)帶電泳中，柱效一般為幾十萬幾百萬理論塔扳幾百萬理論塔扳/ /米米 快速：多數(shù)分析在快速：多數(shù)分析在1010分鐘內(nèi)完成，有的可分鐘內(nèi)完成，有的可以在以在6060秒內(nèi)完成秒內(nèi)完成 高靈敏度：高靈敏度： 紫外檢測器紫外檢測器 1010-13-131010-15-15molmol 熒光檢測器熒光

4、檢測器 1010-19-191010-21-21molmol 微量：微量： 進樣量進樣量 1 110 nL10 nL 樣品量樣品量 5ul5ul5 mL5 mL 檢測檢測 : :在線檢測在線檢測毛細管電泳的特點（續(xù)）毛細管電泳的特點（續(xù)） 重現(xiàn)性重現(xiàn)性: : 遷移時間遷移時間 0.5%0.5% 經(jīng)濟：實驗消耗不過幾經(jīng)濟：實驗消耗不過幾mlml緩沖液，沒有泵輸緩沖液，沒有泵輸送系統(tǒng)送系統(tǒng) 樣品對象廣：從無機離子到整個細胞，具有樣品對象廣：從無機離子到整個細胞，具有包羅包羅“萬能萬能”的分析功能和潛力的分析功能和潛力 自動：自動：CECE是目前自動化程度最高的分離方法是目前自動化程度最高的分離方法

5、 自動進樣，緩沖液交換，數(shù)據(jù)處理 潔凈：潔凈：毛細管電泳與平板凝膠電泳的比較毛細管電泳與平板凝膠電泳的比較 毛細管電泳毛細管電泳 平板凝膠電泳平板凝膠電泳 檢測器選擇檢測器選擇 多多 少少 定量定量 與與 HPLC HPLC 相當相當 困難困難 自動化自動化 容易容易 困難困難 分辨率分辨率 高高 低低 毛細管電泳與毛細管電泳與HPLCHPLC的比較的比較相同之處：相同之處：1.1. 快速高效分離技術快速高效分離技術2.2. 可定量可定量3.3. 全自動化全自動化4.4. 可用不同模式可用不同模式5. 5. 在許多領域逐步取代在許多領域逐步取代HPLCHPLC毛細管電泳與毛細管電泳與HPLCH

6、PLC的比較的比較不同之處不同之處: : 毛細管電泳毛細管電泳 HPLCHPLC 1 1、根據(jù)、根據(jù) 電泳淌度差異電泳淌度差異 保留時間差異保留時間差異 2 2、分離效率、分離效率(N) (N) 與擴散系數(shù)（與擴散系數(shù)（D D） 成反比成反比 與擴散系數(shù)（與擴散系數(shù)（D D） 成正比成正比 3 3、樣品量、樣品量 納升（納升（nlnl）級）級 微升（微升（ulul）級）級 4 4、檢測、檢測 在線檢測在線檢測 柱后檢測柱后檢測 5 5、制備量、制備量 微量制備微量制備 常量制備常量制備 毛細管電泳的主要應用毛細管電泳的主要應用 手性化合物手性化合物 堿性藥物分子堿性藥物分子 法醫(yī)毒物法醫(yī)毒物/

7、 /臨床毒理臨床毒理 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)/ /多肽多肽/ /氨基酸氨基酸 糖類糖類/ /糖蛋白糖蛋白 核酸核酸/ /核苷酸核苷酸 無機及有機離子無機及有機離子/ /有機酸有機酸 其它小分子其它小分子 水溶液中分子間的相互作用水溶液中分子間的相互作用 單細胞分析單細胞分析 藥物與細胞的相互作用藥物與細胞的相互作用分析與微量制備手性手性/ /異構(gòu)體拆分異構(gòu)體拆分 方法簡單化方法簡單化 改善分辨率改善分辨率 快速快速 成本降低成本降低 方法開發(fā)過程簡單方法開發(fā)過程簡單堿性藥物分析堿性藥物分析1919種混合堿性藥物的質(zhì)量種混合堿性藥物的質(zhì)量控制分析控制分析在其它藥物分析中的應用在其它藥物分析中的應用 主成分

8、的定量測定主成分的定量測定 痕量雜質(zhì)檢測痕量雜質(zhì)檢測 中藥材成分分析中藥材成分分析/ /指紋圖譜指紋圖譜 中藥復方制劑中化學成分測定中藥復方制劑中化學成分測定 藥物計量離子配比測定藥物計量離子配比測定 藥物代謝產(chǎn)物測定藥物代謝產(chǎn)物測定 藥物與蛋白質(zhì)的相互作用研究藥物與蛋白質(zhì)的相互作用研究 濫用藥物測定濫用藥物測定 藥廠質(zhì)控藥廠質(zhì)控在蛋白質(zhì)和多肽分析中的應用在蛋白質(zhì)和多肽分析中的應用 肽、蛋白和糖蛋白的鑒別肽、蛋白和糖蛋白的鑒別 結(jié)構(gòu)分析結(jié)構(gòu)分析 純度檢測純度檢測 非均一性、多樣性研究非均一性、多樣性研究 穩(wěn)定性研究穩(wěn)定性研究 結(jié)合和動力學研究結(jié)合和動力學研究 定量測定定量測定 等電點測定等電點

9、測定 蛋白質(zhì)和多肽的質(zhì)量控制蛋白質(zhì)和多肽的質(zhì)量控制 微量制備微量制備在糖類在糖類/ /糖蛋白中的應用糖蛋白中的應用 多糖譜圖的制定多糖譜圖的制定 水化合物分離及測定水化合物分離及測定 蛋白分析蛋白分析 構(gòu)體分析構(gòu)體分析 糖脂研究糖脂研究在核酸在核酸/ /核苷酸分析中的應用核苷酸分析中的應用 核酸、基因疫苗的質(zhì)量控制核酸、基因疫苗的質(zhì)量控制 堿基、核苷和核苷酸的分析堿基、核苷和核苷酸的分析 純度檢測、片段收集和微量制備純度檢測、片段收集和微量制備 PCR PCR產(chǎn)物分析和產(chǎn)物分析和dsDNAdsDNA分析分析 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)-DNA-DNA相互作用測定相互作用測定 基因突變測定基因突變測定 基因表

10、達測定基因表達測定 DNA DNA序列測定序列測定(CEQ2000XL)(CEQ2000XL)在臨床醫(yī)學中的應用在臨床醫(yī)學中的應用 臨床疾病診斷臨床疾病診斷 臨床蛋白分析臨床蛋白分析 基因診斷基因診斷 病毒檢測病毒檢測 臨床藥物檢測臨床藥物檢測 藥物代謝研究藥物代謝研究 臨床分子生物學測定臨床分子生物學測定 毒物、濫用藥物測定毒物、濫用藥物測定CE/MS/MSCE/MS/MS聯(lián)用技術及應用聯(lián)用技術及應用 藥物的結(jié)構(gòu)藥物的結(jié)構(gòu) 藥物及其代謝產(chǎn)物分析藥物及其代謝產(chǎn)物分析 蛋白質(zhì)和多肽結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)和多肽結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物測定蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物測定 核苷酸、核苷酸、DNADNA結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu) 其它領域的應用其它

11、領域的應用在其它工業(yè)領域中的應用在其它工業(yè)領域中的應用 藥品純度及雜質(zhì)檢測藥品純度及雜質(zhì)檢測 石油化工產(chǎn)品雜質(zhì)監(jiān)測石油化工產(chǎn)品雜質(zhì)監(jiān)測 食品中有機酸檢測及礦物食品中有機酸檢測及礦物質(zhì)分析質(zhì)分析 環(huán)境污染物分析環(huán)境污染物分析 金屬陰和陽離子、無機離金屬陰和陽離子、無機離子檢測子檢測 煙草中成分檢測煙草中成分檢測 紡織染料的測定紡織染料的測定 表面活性劑測定表面活性劑測定毛細管電泳存在問題毛細管電泳存在問題 使用了小管徑的毛細管，制備能力差使用了小管徑的毛細管，制備能力差 光路短，要用高靈敏度的檢測器檢測樣品光路短，要用高靈敏度的檢測器檢測樣品 凝膠、色譜填充管要用專門的灌制技術凝膠、色譜填充管要

12、用專門的灌制技術 大的側(cè)面大的側(cè)面/ /截面積比會截面積比會“放大放大”吸附的作用，吸附的作用，導致蛋白質(zhì)等的分離效率下降或無峰導致蛋白質(zhì)等的分離效率下降或無峰 吸附會引起電滲的變化，進而影響分離重現(xiàn)性吸附會引起電滲的變化，進而影響分離重現(xiàn)性毛細管電泳與毛細管電泳與HPLCHPLC的互補結(jié)合應用的互補結(jié)合應用 逐步代替許多逐步代替許多HPLC HPLC 的功能的功能 手性拆分、蛋白質(zhì)分析、堿性藥物、手性拆分、蛋白質(zhì)分析、堿性藥物、 DNA DNA分析、毛細管電泳中藥指紋圖譜、分析、毛細管電泳中藥指紋圖譜、 藥物的質(zhì)量控制、雜質(zhì)測定藥物的質(zhì)量控制、雜質(zhì)測定 在制備功能上是互補的：在制備功能上是互

13、補的： HPLC HPLC 強調(diào)較大的制備量強調(diào)較大的制備量 CE CE 強調(diào)可獲得極高的純度強調(diào)可獲得極高的純度基本理論基本理論分離原理分離原理 高效毛細管電泳是離子或荷電粒子以電場為驅(qū)動力，高效毛細管電泳是離子或荷電粒子以電場為驅(qū)動力，在毛細管中按淌度或在毛細管中按淌度或/ /和分配系數(shù)不同進行高效和分配系數(shù)不同進行高效, ,快速分離快速分離的一種電泳新技術的一種電泳新技術例：以應用最多的毛細管區(qū)帶電泳（例：以應用最多的毛細管區(qū)帶電泳（CZECZE）為例）為例 在移動過程中，由于樣品組分間的淌度不同，它們在移動過程中，由于樣品組分間的淌度不同，它們的遷移速度不同，所以經(jīng)過一定時間后，各組分

14、就按的遷移速度不同，所以經(jīng)過一定時間后，各組分就按其速度或淌度的大小順序，依次到達檢測器檢測窗口其速度或淌度的大小順序，依次到達檢測器檢測窗口被檢出，這樣就可以得到按時間荷響應值（被檢出，這樣就可以得到按時間荷響應值（A A）分布）分布的電泳譜圖的電泳譜圖 分離原理分離原理 毛細管和電泳毛細管和電泳槽中充有相同組分槽中充有相同組分和相同濃度的背景和相同濃度的背景電介質(zhì)溶液，樣品電介質(zhì)溶液，樣品從毛細管的進樣端從毛細管的進樣端導入。當毛細管兩導入。當毛細管兩端加上一定的電壓端加上一定的電壓后，荷電溶質(zhì)便朝后，荷電溶質(zhì)便朝著與其電荷極性相著與其電荷極性相反的電極方向移動。反的電極方向移動。毛細管電

15、泳預備知識毛細管電泳預備知識偶電層和偶電層和ZetaZeta電勢電勢 偶電層是浸沒在液體中的所有表面都具備的一種特性，偶電層是浸沒在液體中的所有表面都具備的一種特性，通常是指兩相之間的分離表面由相對固定和游離的兩部分離通常是指兩相之間的分離表面由相對固定和游離的兩部分離子組成的與表面電荷異號的離子層子組成的與表面電荷異號的離子層 按照近代偶電層模型，在偶電層溶液一側(cè)由兩層組成：按照近代偶電層模型，在偶電層溶液一側(cè)由兩層組成： 第一層：吸附層，又稱為第一層：吸附層，又稱為斯特恩（斯特恩（Stern Stern ）層或）層或 緊密層（緊密層（Compact layerCompact layer）

16、第二層：擴散層第二層：擴散層diffuse layerdiffuse layer 00為表面電勢為表面電勢 ，它在，它在sternstern層中線性地降到層中線性地降到dd，它是，它是sternstern面和溶液內(nèi)部的電勢差，和特性吸附離子的性質(zhì)和數(shù)量面和溶液內(nèi)部的電勢差，和特性吸附離子的性質(zhì)和數(shù)量有關。在有關。在sternstern面外側(cè)很近的地方有一剪切面，是緊貼在固相面外側(cè)很近的地方有一剪切面，是緊貼在固相表面粘度迅速變化的區(qū)域，我們把剪切面上的電勢稱為表面粘度迅速變化的區(qū)域，我們把剪切面上的電勢稱為zetazeta（）電勢，其值略低于）電勢，其值略低于dd，公式計，公式計 式中：式中：

17、e e溶液中每單位面積總?cè)芤褐忻繂挝幻娣e總 的過剩電荷的過剩電荷 介質(zhì)的介電常數(shù)介質(zhì)的介電常數(shù) - -擴散層的厚度，它和電擴散層的厚度，它和電 介質(zhì)濃度（介質(zhì)濃度（C C）有關，）有關， 確切地說，和溶液的離子確切地說，和溶液的離子 強度有關強度有關e 4毛細管電泳中的毛細管電泳中的zetazeta電勢電勢第一種：毛細管壁上的第一種：毛細管壁上的zetazeta電勢電勢 熔硅毛細管表面上的熔硅毛細管表面上的zetazeta電勢正比于它表電勢正比于它表面上的電荷數(shù)與對離子層厚度的乘積，但電面上的電荷數(shù)與對離子層厚度的乘積，但電荷數(shù)和對離子層厚度又會受到對離子的性質(zhì)、荷數(shù)和對離子層厚度又會受到對離

18、子的性質(zhì)、緩沖液的緩沖液的pHpH、緩沖液中陽離子和熔硅基表面、緩沖液中陽離子和熔硅基表面間的平衡等因素的影響。間的平衡等因素的影響。 對于熔硅或聚四氟乙烯材質(zhì)的毛細管，管對于熔硅或聚四氟乙烯材質(zhì)的毛細管，管壁上的壁上的zetazeta電勢是毛細管電泳中的一個重要電勢是毛細管電泳中的一個重要參數(shù)，對控制電滲流、優(yōu)化毛細管分離有重參數(shù)，對控制電滲流、優(yōu)化毛細管分離有重要意義。要意義。毛細管電泳中的毛細管電泳中的zetazeta電勢電勢第二種：荷電粒子表面上的第二種：荷電粒子表面上的zetazeta電勢電勢 在電介質(zhì)中，任何帶電粒子都可以被看成在電介質(zhì)中，任何帶電粒子都可以被看成是一個偶電層系統(tǒng)的

19、一部分。在這個系統(tǒng)中，是一個偶電層系統(tǒng)的一部分。在這個系統(tǒng)中，粒子自身的電荷被異號的帶電離子中和，這些粒子自身的電荷被異號的帶電離子中和，這些異號離子中有一些被不可逆地吸附到粒子上，異號離子中有一些被不可逆地吸附到粒子上，而另一些則游離在附近，并擴散到電介質(zhì)中進而另一些則游離在附近，并擴散到電介質(zhì)中進行離子交換。行離子交換?！肮潭ü潭ā彪x子有一個切平面，它離子有一個切平面，它和離得最近的游離離子間的電勢稱為粒子的和離得最近的游離離子間的電勢稱為粒子的zetazeta電勢。電勢。電泳電泳 在半導體中，荷電粒子在外電場作用下的泳在半導體中，荷電粒子在外電場作用下的泳動現(xiàn)象稱為電泳（動現(xiàn)象稱為電泳（

20、electrophoresiselectrophoresis）. . 帶電粒子在電場中受到向前的帶電粒子在電場中受到向前的力力F F F=q F=qE E 同時，帶電粒子受到粘滯阻力同時，帶電粒子受到粘滯阻力FF F=f F=f u u 當當F=F F=F ，粒子以穩(wěn)態(tài)速度運動，有：，粒子以穩(wěn)態(tài)速度運動，有：u=qE/fu=qE/f對于球形粒子，對于球形粒子，f f由由stokesstokes定律給出，定律給出，f=6f=6 r,r,有：有：ErqEue66電泳（續(xù)）電泳（續(xù)） 根據(jù)上式，電泳速度是和外加電場有關，所根據(jù)上式，電泳速度是和外加電場有關，所以電泳中常用以電泳中常用淌度淌度（mob

21、ility, mobility, ）來描述荷電粒）來描述荷電粒子的電泳行為和特性子的電泳行為和特性. . 電泳淌度（電泳淌度（ epep）定義：單位場強下離子的）定義：單位場強下離子的平均電泳速度平均電泳速度 影響荷電粒子在電場中的遷移速度的因素有：影響荷電粒子在電場中的遷移速度的因素有： 電場強度、電場強度、 介質(zhì)性質(zhì)、介質(zhì)性質(zhì)、 粒子的荷電情況、粒子的荷電情況、 粒子的大小和形狀粒子的大小和形狀6eepEu電滲（電滲（electroosmoticelectroosmotic flow ,EOF flow ,EOF） 電滲流是一種液體相對于帶電的管壁移動電滲流是一種液體相對于帶電的管壁移動的

22、現(xiàn)象。的現(xiàn)象。 在毛細管電泳里在所指的在毛細管電泳里在所指的電滲電滲是：在高電是：在高電壓下，溶液中的正電荷與毛細管管壁表面的負壓下，溶液中的正電荷與毛細管管壁表面的負電荷之間作用，引起流體朝負極方向運動的現(xiàn)電荷之間作用，引起流體朝負極方向運動的現(xiàn)象。象。 和電泳淌度相似，電滲淌度（和電泳淌度相似，電滲淌度（ eoeo ）可）可表示為：表示為： Euweo4 在普通的毛細管區(qū)帶電泳條件下，電滲在普通的毛細管區(qū)帶電泳條件下，電滲流從陽極流向陰極，大小受到流從陽極流向陰極，大小受到ZetaZeta電勢、偶電勢、偶電層厚度、介質(zhì)粘度的影響，一般電勢愈大、電層厚度、介質(zhì)粘度的影響，一般電勢愈大、偶電層

23、愈薄、粘度愈小，電滲流值就愈大。偶電層愈薄、粘度愈小，電滲流值就愈大。 通常，通常，滲流速度是泳流速度滲流速度是泳流速度5 57 7倍倍 電滲（續(xù)）電滲（續(xù)） 粒子在毛細管中同時受到泳流和滲流兩粒子在毛細管中同時受到泳流和滲流兩種運動速度的影響，粒子在毛細管電介質(zhì)的種運動速度的影響，粒子在毛細管電介質(zhì)的運動速度應該是兩種速度的矢量和：運動速度應該是兩種速度的矢量和： 令令app= ep+ eoapp= ep+ eo為表現(xiàn)淌度為表現(xiàn)淌度（apparent apparent mobilitymobility）或凈淌度或凈淌度(net mobility)(net mobility)Euuueoepe

24、oep)(電滲（續(xù)）電滲（續(xù)） 從毛細管電泳測量中得到的淌度應為粒子自身從毛細管電泳測量中得到的淌度應為粒子自身的電泳淌度和由電滲引起的淌度的矢量和：的電泳淌度和由電滲引起的淌度的矢量和： 式中：式中：Ld-Ld-毛細管從進樣口到檢測器的距離毛細管從進樣口到檢測器的距離 tm-tm-粒子通過毛細管到達檢測器的時間粒子通過毛細管到達檢測器的時間 Lt-Lt-毛細管柱長，毛細管柱長，V-V-電壓電壓VtLLEeoepappmtd粒子的表觀淌度粒子的表觀淌度電滲（續(xù)）電滲（續(xù)）通過以上討論可得：通過以上討論可得： 表現(xiàn)淌度表現(xiàn)淌度appapp可以從毛細管電泳的測量結(jié)果求可以從毛細管電泳的測量結(jié)果求得

25、得 電滲淌度電滲淌度eoeo可以用中性粒子按同樣的方法測得可以用中性粒子按同樣的方法測得 電泳淌度電泳淌度epep帶電粒子的電泳淌度可用中性粒子帶電粒子的電泳淌度可用中性粒子為參照從式中求得為參照從式中求得電滲（續(xù)）電滲（續(xù)）各帶電離子在毛細管中的流出順序為：各帶電離子在毛細管中的流出順序為： 正正 離離 子子運動方向與電滲一致運動方向與電滲一致 中性粒子中性粒子泳流速度為零，隨電滲而行泳流速度為零，隨電滲而行 負負 離離 子子運動方向與電滲相反，當運動方向與電滲相反，當eoeo epep時，最后流出，否則無法流出時，最后流出，否則無法流出結(jié)論：結(jié)論：只有當電滲速度的絕對值大于所有負離子泳流只

26、有當電滲速度的絕對值大于所有負離子泳流速度的絕對值時，混合物中的所有組分才將向一個速度的絕對值時，混合物中的所有組分才將向一個方向遷移，才能檢測出所有組分方向遷移，才能檢測出所有組分毛細管電泳流型毛細管電泳流型 毛細管電泳是屬于電驅(qū)動系統(tǒng)，在毛細管中毛細管電泳是屬于電驅(qū)動系統(tǒng)，在毛細管中流體的流型呈扁平型的塞子向前流動。流體的流型呈扁平型的塞子向前流動。毛細管電泳的分類及主要應用方向毛細管電泳的分類及主要應用方向按分離機理分：按分離機理分： 毛細管區(qū)帶電泳（毛細管區(qū)帶電泳（CZECZE） 毛細管凝膠電泳（毛細管凝膠電泳（CGECGE） 毛細管等電聚焦（毛細管等電聚焦（CIEFCIEF） 毛細管

27、電動色譜（毛細管電動色譜（EKCEKC） 毛細管膠束電動色譜毛細管膠束電動色譜（MECCMECC） 毛細管電色譜（毛細管電色譜（CECCEC） 毛細管等速電泳（毛細管等速電泳（CITPCITP） 親和毛細管電泳（親和毛細管電泳（ACEACE） 非水相毛細管電泳（非水相毛細管電泳（NACE)NACE)各種電泳的主要應用方向各種電泳的主要應用方向小型離子小型離子: CZE CITP : CZE CITP 小分子小分子: MECC CZE CITP: MECC CZE CITP肽類肽類 : CZE MECC CIEF CITP CGE: CZE MECC CIEF CITP CGE蛋白質(zhì)蛋白質(zhì): C

28、ZE CGE CIEF CITP: CZE CGE CIEF CITP低聚核苷酸低聚核苷酸 : CGE MEKC: CGE MEKCDNA :CGEDNA :CGE毛毛細細管管電電泳泳儀儀毛細管電泳儀的基本結(jié)構(gòu)毛細管電泳儀的基本結(jié)構(gòu) 毛細管電泳系統(tǒng)包括：進樣、填灌毛細管電泳系統(tǒng)包括：進樣、填灌/ /清洗、電流回清洗、電流回路、毛細管路、毛細管/ /溫度控制、檢測溫度控制、檢測/ /記錄記錄/ /數(shù)據(jù)處理等部分數(shù)據(jù)處理等部分 毛細管電泳儀的性能毛細管電泳儀的性能 多種靈活的分離模式多種靈活的分離模式 電壓、電流、功電壓、電流、功率、壓力和真空率、壓力和真空可恒壓、恒流、可恒壓、恒流、恒功率或梯度

29、編程恒功率或梯度編程可壓力與電壓、可壓力與電壓、電流、功率的組合電流、功率的組合可程序控制切換可程序控制切換極性極性毛細管電泳儀的性能毛細管電泳儀的性能 控溫范圍寬，至少應能夠在控溫范圍寬，至少應能夠在20204040內(nèi)恒溫內(nèi)恒溫 可選擇的樣品溫度控制系統(tǒng)可選擇的樣品溫度控制系統(tǒng) 半導體的溫控系統(tǒng)可供選擇半導體的溫控系統(tǒng)可供選擇 樣品溫度控制與緩沖液的溫度控制分開樣品溫度控制與緩沖液的溫度控制分開 樣品量可達樣品量可達192192個個 恒溫精度能到達恒溫精度能到達0.1 0.1 毛細管電泳儀的性能毛細管電泳儀的性能準確、自動的進樣系統(tǒng)性準確、自動的進樣系統(tǒng)性 具有精確的進樣控制和校正系統(tǒng)，進樣

30、量準確具有精確的進樣控制和校正系統(tǒng)，進樣量準確 可直接從可直接從9696孔樣品板上自動進樣，也可從孔樣品板上自動進樣，也可從2ml2ml或或0.5ml0.5ml或或PCRPCR試管中進樣試管中進樣 可電動、壓力、真空或三者組合進樣可電動、壓力、真空或三者組合進樣 可從毛細管兩端的任一端進樣可從毛細管兩端的任一端進樣 進樣后，有等待功能進樣后，有等待功能 毛細管電泳儀的性能毛細管電泳儀的性能最佳的緩沖液供給系統(tǒng)最佳的緩沖液供給系統(tǒng) 可容納可容納3636種緩沖液種緩沖液組合功能組合功能 緩沖液的溫度控制緩沖液的溫度控制與樣品的溫度控制分開與樣品的溫度控制分開 還有備選的還有備選的4 x 25 4

31、x 25 ml ml 的大容量緩沖液瓶可的大容量緩沖液瓶可供選擇供選擇毛細管電泳儀的性能毛細管電泳儀的性能 配備性能優(yōu)良的檢測器，以滿足不同的應用配備性能優(yōu)良的檢測器，以滿足不同的應用 二極管陣列檢測器（二極管陣列檢測器（DADDAD） 紫外檢測器（紫外檢測器（UV/VISUV/VIS） 激光誘導熒光檢測器（激光誘導熒光檢測器（LIFLIF） 通用型外部接口（通用型外部接口（EDAEDA），連接），連接 串聯(lián)串聯(lián)質(zhì)譜檢測器（質(zhì)譜檢測器（MS/MSMS/MS） 電導檢測器（電導檢測器（ConductivityConductivity）等）等進樣進樣 進樣必須滿足的要求：進樣必須滿足的要求： 進樣

32、時不能引入顯著的區(qū)帶擴張進樣時不能引入顯著的區(qū)帶擴張 樣品的量必須小于樣品的量必須小于100nl100nl，否則會引起過載，否則會引起過載 進樣方式進樣方式 真空進樣真空進樣 電進樣電進樣 壓力進樣壓力進樣進樣進樣- -電動進樣（電遷移進樣）電動進樣（電遷移進樣） 電動進樣屬于普適性方法，是凝膠電泳進樣唯一電動進樣屬于普適性方法，是凝膠電泳進樣唯一的方法的方法 缺點：對離子組分存在進樣偏向，即進樣歧視缺點：對離子組分存在進樣偏向，即進樣歧視 進樣進樣- -壓力進樣壓力進樣方法方法： 壓力進樣也叫壓力進樣也叫流動進樣，要求毛細管流動進樣，要求毛細管中的填充介質(zhì)具有流動中的填充介質(zhì)具有流動性，也即

33、當把毛細管的性，也即當把毛細管的兩端置于不同的壓力環(huán)兩端置于不同的壓力環(huán)境中時，管中溶液即能境中時，管中溶液即能流動，將樣品帶入。流動，將樣品帶入。進樣進樣- -壓力進壓力進樣樣 三種方式：三種方式： 正壓正壓 負壓（管尾抽吸）負壓（管尾抽吸） 重力（虹吸）重力（虹吸） 正壓進樣的優(yōu)點正壓進樣的優(yōu)點 進樣過程中沒有組分歧視，進樣過程中沒有組分歧視， 在嚴格控制樣品的粘度和溫度下，進入毛細在嚴格控制樣品的粘度和溫度下，進入毛細管的量是固定的管的量是固定的檢測檢測器器紫外檢測紫外檢測 (UV/VIS) (UV/VIS) 二極管陣列檢測二極管陣列檢測 (UV/VIS DAD)(UV/VIS DAD)

34、激光誘導熒光檢測激光誘導熒光檢測 (LIF) (LIF) 間接檢測間接檢測 (Indirect Detection) (Indirect Detection) 電化學檢測電化學檢測 質(zhì)譜檢測質(zhì)譜檢測 (CE-MS/MS) (CE-MS/MS) 化學發(fā)光檢測化學發(fā)光檢測紫外檢測光路圖紫外檢測光路圖二極管陣列檢測器二極管陣列檢測器間接檢測法間接檢測法 CECE間接檢測法中，信號不是來自樣品本身，間接檢測法中，信號不是來自樣品本身，而是來自背景電解質(zhì)離子而是來自背景電解質(zhì)離子( (緩沖溶液或加入其緩沖溶液或加入其中的添加劑離子中的添加劑離子) )。 樣品溶質(zhì)在毛細管樣品溶質(zhì)在毛細管中遷移時，為了保持

35、中遷移時，為了保持局部區(qū)域的電荷平衡，局部區(qū)域的電荷平衡，要求置換同電荷離子，要求置換同電荷離子，即在區(qū)帶內(nèi)產(chǎn)生電荷即在區(qū)帶內(nèi)產(chǎn)生電荷的物理置換，使背景的物理置換，使背景電解質(zhì)離子濃度降低，電解質(zhì)離子濃度降低，從而產(chǎn)生背景信號減從而產(chǎn)生背景信號減弱。通過相對于穩(wěn)態(tài)弱。通過相對于穩(wěn)態(tài)時背景信號的減弱時背景信號的減弱( (負負峰峰) )進行樣品溶質(zhì)的間進行樣品溶質(zhì)的間接測定。接測定。間接檢測法間接檢測法特點：特點： 不要求分析物具有能被檢測的信號特性，不要求分析物具有能被檢測的信號特性，如光的吸收、發(fā)射、碎滅及電化學活性等如光的吸收、發(fā)射、碎滅及電化學活性等 是一種近于通用性的檢測方法，非常適合是

36、一種近于通用性的檢測方法，非常適合于無機離子、有機小分子、氨基酸和糖類化于無機離子、有機小分子、氨基酸和糖類化合物等的檢測合物等的檢測 不需要柱前或柱后衍生，分析物沒有發(fā)生不需要柱前或柱后衍生，分析物沒有發(fā)生化學變化，是非破壞性檢測，便于組分收集化學變化，是非破壞性檢測，便于組分收集后作進一步研究后作進一步研究 間接檢測間接檢測法法 測定的機理是物理置換，可以根據(jù)所用儀器的類測定的機理是物理置換，可以根據(jù)所用儀器的類型來選擇背景電解質(zhì)離子型來選擇背景電解質(zhì)離子( (如吸收波長、電極電位如吸收波長、電極電位等等) ) 由于間接法是在強背景信號下測定信號的微弱變由于間接法是在強背景信號下測定信號的

37、微弱變化，靈敏度沒有相應的直接測定法高化，靈敏度沒有相應的直接測定法高 基線噪聲大，存在基線漂移和較大擾動等缺點基線噪聲大，存在基線漂移和較大擾動等缺點 具有具有通用性，對雜質(zhì)也較敏感通用性，對雜質(zhì)也較敏感 采用的間接檢測法有采用的間接檢測法有：間接吸收法、間接熒光法、間接吸收法、間接熒光法、間接電化學法、間接化學發(fā)光法間接電化學法、間接化學發(fā)光法CECE檢測器的檢測限及其特點檢測器的檢測限及其特點毛細管區(qū)帶電泳毛細管區(qū)帶電泳毛細管區(qū)帶電泳毛細管區(qū)帶電泳-分分離原理離原理 樣樣品在電解液中泳動品在電解液中泳動, ,根根據(jù)物據(jù)物質(zhì)的荷質(zhì)的荷/ /質(zhì)比（質(zhì)比（chargecharge/ /mass

38、mass比比值）差值）差異來進異來進行分離，比值愈大行分離，比值愈大, ,跑得愈快。跑得愈快。Capillary Zone Electrophoresis毛細管區(qū)帶電泳毛細管區(qū)帶電泳-分分離原理離原理毛細管區(qū)帶電泳毛細管區(qū)帶電泳-分分離原理離原理 特點特點 可使用可使用凃?qū)觾驅(qū)踊蛭椿蛭磧驅(qū)拥膬驅(qū)拥拿毠芗毠?避免樣品吸附避免樣品吸附 抑制抑制電滲電滲透流透流 毛毛細管中除細管中除電解電解質(zhì)外質(zhì)外, ,無需填充任何無需填充任何物質(zhì)物質(zhì) 使用未使用未凃?qū)拥拿毠苓M行分離時凃?qū)拥拿毠苓M行分離時, ,不僅是正不僅是正電荷，電荷，包括無電荷包括無電荷及及負電荷物質(zhì)負電荷物質(zhì)都會向都會向負電負電極移極

39、移動動( (因因為電為電滲滲流流),),所以可所以可同時檢測同時檢測正正電荷電荷、負電荷負電荷及中性物及中性物質(zhì)質(zhì) 以以電解質(zhì)電解質(zhì)之之pHpH值、值、離子濃度離子濃度、溫度溫度、毛細管電泳毛細管電泳及及電壓電壓大小來控制分大小來控制分離狀態(tài)離狀態(tài) 毛細管區(qū)帶電泳毛細管區(qū)帶電泳-分分離原理離原理 主要應用主要應用 蛋白蛋白質(zhì)、質(zhì)、多肽多肽及帶及帶電荷電荷的大小分子的大小分子 可取代可取代傳統(tǒng)電泳傳統(tǒng)電泳及及離子交換離子交換HPLCHPLC膠束電動毛細管電泳膠束電動毛細管電泳膠束電動毛細管電泳膠束電動毛細管電泳-分離設想分離設想 電解質(zhì)電解質(zhì)中加入表面活性中加入表面活性劑劑, ,使使之形成之形成

40、膠束，樣膠束，樣品根據(jù)疏水性品根據(jù)疏水性的強弱的的強弱的差差異異，在，在膠束與膠束與電解質(zhì)電解質(zhì)的分配系數(shù)有所不同的分配系數(shù)有所不同, ,來進行分來進行分離離 樣品樣品疏水性愈強疏水性愈強, ,則進則進入入膠束膠束的的機會機會愈大愈大 通常通常物質(zhì)進物質(zhì)進入入膠束后膠束后, ,泳動的速度泳動的速度會變會變慢慢, ,因因此疏水性愈強的物質(zhì)則愈慢出來此疏水性愈強的物質(zhì)則愈慢出來膠束電動毛細管電泳膠束電動毛細管電泳-特特點及主要點及主要應用應用 根根據(jù)分子之疏水性及親水性的強弱差據(jù)分子之疏水性及親水性的強弱差異進異進行分行分離離 可分離不帶可分離不帶電荷電荷的物質(zhì)的物質(zhì), ,疏水性強的物疏水性強的物

41、質(zhì)或質(zhì)或電荷電荷/ /質(zhì)量質(zhì)量比值相近之比值相近之物質(zhì)物質(zhì) 對樣品分子大小有限制，要求分子量小于對樣品分子大小有限制，要求分子量小于50005000（CZECZE則沒有此限制）則沒有此限制） 藥物分析、藥物分析、環(huán)境環(huán)境污染物分析及其他小分子污染物分析及其他小分子物質(zhì)物質(zhì) 可取代可取代反相反相HPLCHPLC分離原理分離原理 被分離檢測物質(zhì)在水相和假固定相之間進行分配，被分離檢測物質(zhì)在水相和假固定相之間進行分配，由于它們在膠束中具有保留能力不同而產(chǎn)生不同的由于它們在膠束中具有保留能力不同而產(chǎn)生不同的保留時間，所以溶質(zhì)的遷移速度決定于溶質(zhì)在兩相保留時間，所以溶質(zhì)的遷移速度決定于溶質(zhì)在兩相間的分配

42、系數(shù)間的分配系數(shù) 在膠束電動毛細管色譜中，中性粒子間的分離在膠束電動毛細管色譜中，中性粒子間的分離是根據(jù)粒子本身的疏水性的不同而達到的是根據(jù)粒子本身的疏水性的不同而達到的 不同疏水性的粒子和膠束的相互作用不同，疏不同疏水性的粒子和膠束的相互作用不同，疏水性強的作用力大，保留時間就大，反之，保水性強的作用力大，保留時間就大，反之，保留時間短留時間短 是唯一能分離是唯一能分離帶電粒子和帶電粒子和中性化合物中性化合物的模式的模式 常用的表面活性劑有：常用的表面活性劑有：十二烷基硫酸鈉十二烷基硫酸鈉、十二烷基磺酸鈉、膽酸、十二烷基三甲基十二烷基磺酸鈉、膽酸、十二烷基三甲基溴化胺、十四烷基三甲基溴化胺、

43、溴化胺、十四烷基三甲基溴化胺、十六烷十六烷基三甲基溴化胺基三甲基溴化胺等等MECCMECC應用應用- -七種青霉素的分離七種青霉素的分離(A)(A) CZE : CZE : 20mM Pi-Borate, pH 8.520mM Pi-Borate, pH 8.5( (B) MEKC : B) MEKC : 0.1 M SDS in (A) 0.1 M SDS in (A) solnsoln. . 的遷移的遷移毛細管凝膠電泳毛細管凝膠電泳 毛細管凝膠電泳毛細管凝膠電泳 毛細管凝膠電泳毛細管凝膠電泳 (capillary gel (capillary gel electrophoresiselec

44、trophoresis，CGE)CGE)是是2020世紀世紀8080年代后期發(fā)年代后期發(fā)展起來的毛細管電泳的分離模式，它將凝膠電展起來的毛細管電泳的分離模式，它將凝膠電泳對生物大分子的高效分離能力和毛細管電泳泳對生物大分子的高效分離能力和毛細管電泳的快速、微量和定量分析相結(jié)合，成為當今分的快速、微量和定量分析相結(jié)合，成為當今分離度極高的一種分離技術。離度極高的一種分離技術。 目前主要用于生命科學和生物化學領目前主要用于生命科學和生物化學領域，如對大分子蛋白質(zhì)的分離，分子量測域，如對大分子蛋白質(zhì)的分離，分子量測定，定，DNADNA、寡聚核苛酸的分離與純化。、寡聚核苛酸的分離與純化。CGECGE與

45、激光誘導熒光與激光誘導熒光 (LIF)(LIF)檢測技術相結(jié)合已檢測技術相結(jié)合已成為成為DNADNA快速序列分析的優(yōu)選方法?？焖傩蛄蟹治龅膬?yōu)選方法。分離機制分離機制 CGECGE的分離機制與凝膠電泳相同，因凝膠具的分離機制與凝膠電泳相同，因凝膠具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有分子篩作用有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有分子篩作用 分離取決于溶質(zhì)的凈電性質(zhì)、電荷多少和分分離取決于溶質(zhì)的凈電性質(zhì)、電荷多少和分子的大小子的大小 當帶電溶質(zhì)通過凝膠時，即按分子大小、電當帶電溶質(zhì)通過凝膠時，即按分子大小、電荷性質(zhì)及電荷多少依次篩分荷性質(zhì)及電荷多少依次篩分 對荷電量不隨分子大小而變化的大分子如對荷電量不隨分子大小而變化的大分子如DNA DN

46、A 、 SDS-SDS-蛋白質(zhì)復合物，必須經(jīng)凝膠篩分得蛋白質(zhì)復合物，必須經(jīng)凝膠篩分得到分離到分離 CGECGE的特點的特點 可分可分離蛋白質(zhì)離蛋白質(zhì)、DNADNA、RNARNA、多多糖類糖類及高分子聚合物及高分子聚合物, ,並並確定確定其分子量其分子量 可改可改變變GelGel的的濃度來控制分濃度來控制分離的離的范圍范圍 分離介質(zhì)凝膠黏度大，能減少溶質(zhì)分離介質(zhì)凝膠黏度大，能減少溶質(zhì)的擴散（分離對象為大分子物質(zhì)，擴的擴散（分離對象為大分子物質(zhì)，擴散系數(shù)?。┥⑾禂?shù)小） 所得的峰形尖銳，是所得的峰形尖銳，是CECE分離模式中分離模式中柱效最高的柱效最高的(10(107 7/m)/m)一種分離方法一種

47、分離方法 可可制成不同濃度的凝膠制成不同濃度的凝膠 可得到不同孔徑的分子篩，用于分可得到不同孔徑的分子篩，用于分離不同分子量的物質(zhì)離不同分子量的物質(zhì) 毛細管等速電泳毛細管等速電泳(CITP)(CITP) vCITPCITP基于有效離子淌度的差異進行帶電離子的分離基于有效離子淌度的差異進行帶電離子的分離 v屬于不連續(xù)介質(zhì)電泳，需要兩種緩沖液屬于不連續(xù)介質(zhì)電泳，需要兩種緩沖液 前導電解液：前導電解液：含有與溶質(zhì)離子電荷相同且淌度為含有與溶質(zhì)離子電荷相同且淌度為體系中最高的離子體系中最高的離子 尾隨電解液：尾隨電解液：體系中淌度最低的離子體系中淌度最低的離子 樣品離子的淌度介于這兩者之間樣品離子的淌

48、度介于這兩者之間 缺點缺點 ：需要采用不連續(xù)緩沖體系，空間分辨率差：需要采用不連續(xù)緩沖體系，空間分辨率差 毛細管等電聚焦電泳毛細管等電聚焦電泳毛細管等電聚焦電泳毛細管等電聚焦電泳 毛細管等電聚焦電泳毛細管等電聚焦電泳(capillary (capillary isoelectricisoelectric focusing focusing，CIEF)CIEF)是將常規(guī)等是將常規(guī)等電聚焦凝膠電泳的高分辨率與現(xiàn)代毛細管電泳電聚焦凝膠電泳的高分辨率與現(xiàn)代毛細管電泳的特點相結(jié)合的一種毛細管電泳分離模式的特點相結(jié)合的一種毛細管電泳分離模式用于分離用于分離不同等電點不同等電點的兩性大分子，尤其在分的兩性大

49、分子，尤其在分離蛋白質(zhì)方面顯示了較大的優(yōu)越性，可分離等離蛋白質(zhì)方面顯示了較大的優(yōu)越性，可分離等電點電點(pI(pI) )相差相差0.0lpH0.0lpH單位的不同蛋白質(zhì)單位的不同蛋白質(zhì) 除測定除測定pIpI外，還可用于其他方法無法分離的外，還可用于其他方法無法分離的蛋白樣，如免疫球蛋白、血紅蛋白、血清轉(zhuǎn)鐵蛋白樣，如免疫球蛋白、血紅蛋白、血清轉(zhuǎn)鐵蛋白以及低濃度生物樣品的分析蛋白以及低濃度生物樣品的分析分離原理分離原理等等電點的定義：電點的定義： 當當?shù)鞍踪|(zhì)存在於某一蛋白質(zhì)存在於某一個個pHpH值值環(huán)境下環(huán)境下, ,其正其正電荷及電荷及負電負電荷的數(shù)目相等荷的數(shù)目相等( (凈電凈電荷等于零荷等于零

50、, ,不不帶電帶電),),則此則此pHpH值即為其等值即為其等電點電點(pI(pI) ). .分分離原理離原理 電解電解質(zhì)中混合質(zhì)中混合凝膠凝膠及及兩性電解質(zhì)兩性電解質(zhì), ,通通電后電后，兩性電解質(zhì)會，兩性電解質(zhì)會先形成先形成pHpH梯度梯度, ,樣品樣品會各自會各自向其等向其等電點電點移動移動, ,直到不帶電荷直到不帶電荷( (等等電點電點) )時時則停止移動則停止移動, ,利用利用氣壓壓氣壓壓力力將已等電聚焦將已等電聚焦的的樣樣品推品推動動, ,經(jīng)過檢測經(jīng)過檢測器進行器進行檢測檢測分離原理（續(xù)）分離原理（續(xù)） CIEFCIEF的電泳緩沖液由的電泳緩沖液由不同不同pHpH值范圍的兩性電值范圍的兩性電解質(zhì)組成解質(zhì)組成 ( (其其 pHpH值范圍值范圍應包括被分離溶質(zhì)如蛋應包括被分離溶質(zhì)如蛋白質(zhì)的白質(zhì)的pIpI值值) )，將溶質(zhì)和，將溶質(zhì)和不同不同pHpH值范圍的載體兩值范圍的載體兩性電解質(zhì)的混