利用酵母菌生產(chǎn)蛋白質(zhì)

1、1會(huì)計(jì)學(xué)利用酵母菌生產(chǎn)蛋白質(zhì)利用酵母菌生產(chǎn)蛋白質(zhì)酵母細(xì)胞模式圖 核膜 （雙層膜） 真核：DNA組蛋白R(shí)NA 核仁牛牛文庫(kù)文檔分享細(xì)菌細(xì)胞 無(wú)核膜 、核仁 原核：DNA裸露 細(xì)胞器與膜系統(tǒng)差別很大牛牛文庫(kù)文檔分享- 高水平表達(dá)- 為還原性?xún)?nèi)環(huán)境，不能形成二硫鍵，某些蛋白不能進(jìn)行有效折疊1牛牛文庫(kù)文檔分享- 高水平表達(dá)- 為還原性?xún)?nèi)環(huán)境，不能形 成二硫鍵，某些蛋白不能 進(jìn)行有效折疊1- 相對(duì)高水平表達(dá)- 可發(fā)生一定程度的翻譯后修飾作 用，有利于實(shí)現(xiàn)完整蛋白功能2牛牛文庫(kù)文檔分享- 高水平表達(dá)- 為還原性?xún)?nèi)環(huán)境，不能形 成二硫鍵，某些蛋白不能 進(jìn)行有效折疊1- 相對(duì)高水平表達(dá)- 可發(fā)生一定程度的翻譯

2、后修飾作 用，有利于實(shí)現(xiàn)完整蛋白功能2- 完備的翻譯后修飾系統(tǒng)- 低表達(dá)水平 3牛牛文庫(kù)文檔分享細(xì)菌哺乳動(dòng)物細(xì)胞昆蟲(chóng)細(xì)胞酵母菌人培養(yǎng)細(xì)胞品質(zhì) 細(xì)菌 酵母菌 昆蟲(chóng)細(xì)胞 哺乳動(dòng)物細(xì)胞 產(chǎn)量蛋白質(zhì)產(chǎn)品牛牛文庫(kù)文檔分享 原核表達(dá)系統(tǒng)與真核表達(dá)系統(tǒng)的比較： （1）區(qū)域化 原核生物：細(xì)胞質(zhì) 真核生物： 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)：大部分蛋白 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體：分泌性蛋白 氧化還原電位低氧化型環(huán)境； 二硫化物異構(gòu)酶； 輔助蛋白（折疊酶；分子伴侶chaperonine） 牛牛文庫(kù)文檔分享 在細(xì)菌中合成生產(chǎn)的真核生物蛋白由于缺乏翻譯后加工過(guò)程，往往導(dǎo)致失去生物活性。真核生物翻譯后修飾作用： 形成正確的二硫鍵。 由二硫鍵異構(gòu)酶催化完

3、成。蛋白質(zhì)折疊所必需，否則不能正確折疊的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定，且失去生物學(xué)活性。 血紅蛋白3級(jí)結(jié)構(gòu)4級(jí)結(jié)構(gòu) （2）翻譯后修飾作用牛牛文庫(kù)文檔分享一級(jí)結(jié)構(gòu)二級(jí)結(jié)構(gòu)三級(jí)結(jié)構(gòu)四級(jí)結(jié)構(gòu)螺旋折疊高級(jí)結(jié)構(gòu)牛牛文庫(kù)文檔分享 切割前體。 前體蛋白中的某些氨基酸序列如信號(hào)肽的切出，形成有功能的蛋白質(zhì)。 蛋白質(zhì)的糖基化。 是將寡糖連接到一個(gè)蛋白質(zhì)分子上，是真核生物細(xì)胞表達(dá)基因產(chǎn)物時(shí)最重要的一種翻譯后修飾作用。 作用： i. 有利于保證所表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼郫B； ii. 保護(hù)蛋白質(zhì)免受細(xì)胞蛋白酶的降解。 最常見(jiàn)的是O-糖基化（加在Ser, Thr上）和N-糖基化（加在Asn上）。酵母菌中的寡糖通常含有大量的甘露糖殘基。

4、牛牛文庫(kù)文檔分享多糖和蛋白質(zhì)在細(xì)胞壁上的連接方式2. O-glycosidic linkage1. N-glycosidic linkage牛牛文庫(kù)文檔分享牛牛文庫(kù)文檔分享一般酵母菌中的寡糖12酵母菌突變株mnn9中的寡糖 在酵母菌中的糖基化只能添加富含甘露糖的寡糖，而不形成象高等動(dòng)物細(xì)胞中普遍存在的那種糖蛋白復(fù)合物。這種糖基化有時(shí)會(huì)影響蛋白質(zhì)的折疊和對(duì)蛋白酶的敏感性，更重要的是會(huì)影響蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)的半衰期。牛牛文庫(kù)文檔分享 對(duì)氨基酸的修飾作用。 包括磷酸化、甲基化、乙?；?、硫酸化、丙烯酸化、羧酸化、豆蔻酸化及軟脂酰化等。 牛牛文庫(kù)文檔分享牛牛文庫(kù)文檔分享牛牛文庫(kù)文檔分享牛牛文庫(kù)文檔分享 選

5、擇性標(biāo)記基因 啟動(dòng)子 轉(zhuǎn)錄、翻譯終止信號(hào) 給mRNA加上poly(A) 復(fù)制起始位點(diǎn)酵母菌表達(dá)系統(tǒng)牛牛文庫(kù)文檔分享已已在在釀釀酒酒酵酵母母中中表表達(dá)達(dá)的的重重組組蛋蛋白白 種種 類(lèi)類(lèi) 名名 稱(chēng)稱(chēng) 疫疫 苗苗 乙乙肝肝病病毒毒表表面面抗抗原原 瘧瘧原原蟲(chóng)蟲(chóng)環(huán)環(huán)子子孢孢子子蛋蛋白白 HIV-1 外外殼殼蛋蛋白白 診診斷斷試試劑劑 丙丙肝肝病病毒毒蛋蛋白白 HIV-1 抗抗原原 治治療療用用蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)藥藥物物 上上皮皮生生長(zhǎng)長(zhǎng)因因子子 胰胰島島素素 類(lèi)類(lèi)胰胰島島素素生生長(zhǎng)長(zhǎng)因因子子 血血小小板板源源生生長(zhǎng)長(zhǎng)因因子子 胰胰島島素素前前體體 成成纖纖維維細(xì)細(xì)胞胞生生長(zhǎng)長(zhǎng)因因子子 集集落落刺刺激激因因子

6、子 1 抗抗胰胰蛋蛋白白酶酶 凝凝血血因因子子 XIII 牛牛文庫(kù)文檔分享1996年 完成全長(zhǎng)為12Mb釀酒酵母基因組的測(cè)序。 釀酒酵母是一種重要的模式生物，也是第一個(gè)被測(cè)序的真核生物。它有16條染色體，基因組全長(zhǎng)為12Mb，含有6000多個(gè)基因。它的基因組的測(cè)序是作為HGP的一部分于上世紀(jì)80年代末期啟動(dòng)，于1996年完成。1997年Nature專(zhuān)門(mén)為釀酒酵母基因組發(fā)行了增刊。 牛牛文庫(kù)文檔分享釀酒酵母的基因組很小，僅有16條染色體。釀酒酵母細(xì)胞既可以作為單倍體存在，也可以作為二倍體存在有利于發(fā)現(xiàn)隱性基因。12068 kb5109bp3.5109bp1.8108bp4106bp牛牛文庫(kù)文檔分

7、享基因組全長(zhǎng)12068kb，有5885個(gè)編碼專(zhuān)一性蛋白質(zhì)的開(kāi)放閱讀框。酵母基因組中平均每隔2kb就存在一個(gè)編碼蛋白質(zhì)的基因，即整個(gè)基因組有72的核苷酸順序由開(kāi)放閱讀框組成。酵母基因組的基因間隔區(qū)較短，基因中內(nèi)含子稀少。其開(kāi)放閱讀框平均長(zhǎng)度為1450bp即483個(gè)密碼子，最長(zhǎng)的是位于XII號(hào)染色體上的一個(gè)功能未知的開(kāi)放閱讀框(4910個(gè)密碼子)，還有極少數(shù)的開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度超過(guò)1500個(gè)密碼子。酵母基因組中還包含：約140個(gè)編碼RNA的基因，排列在XII號(hào)染色體的長(zhǎng)末端；40個(gè)編碼snRNA的基因，散布于16條染色體；屬于43個(gè)家族的275個(gè)tRNA基因也廣泛分布于基因組中。牛牛文庫(kù)文檔分享釀酒酵

8、母基因組的結(jié)構(gòu)6108牛牛文庫(kù)文檔分享酵母染色體由大范圍的GC豐富DNA序列和GC缺乏DNA序列鑲嵌組成。GC含量高的區(qū)域一般位于染色體臂的中部，這些區(qū)域的基因密度較高；GC含量低的區(qū)域一般靠近端粒和著絲粒，這些區(qū)域內(nèi)基因數(shù)目較為貧乏；酵母基因組另一個(gè)明顯的特征是含有許多DNA重復(fù)序列，其中一部分為完全相同的DNA序列，如rDNA與CUP1基因、Ty因子及其衍生的單一LTR序列等。牛牛文庫(kù)文檔分享S. cerevisiae基因組的測(cè)序被稱(chēng)為現(xiàn)代分子生物學(xué)歷史上最為分散的實(shí)驗(yàn)。包括美國(guó)、加拿大、歐洲、日本等國(guó)家在內(nèi)的100多個(gè)實(shí)驗(yàn)室，超過(guò)600多名科學(xué)家都參與了這項(xiàng)工作。酵母菌研究社群(the

9、yeast community)，在Andre Goffeau教授(the Universite Catholique de Louvain in Belgium)的領(lǐng)導(dǎo)下，樹(shù)立了一個(gè)效率，合作，組織的典范。這樣一種國(guó)際合作也是基因組學(xué)研究的一個(gè)重要特點(diǎn)。牛牛文庫(kù)文檔分享牛牛文庫(kù)文檔分享 釀酒酵母作為受體菌的優(yōu)勢(shì)：（1）為單細(xì)胞真核生物，對(duì)其遺傳學(xué)和生理學(xué)的研究較為深入；（2）能快速生長(zhǎng)；（3）具有啟動(dòng)活性強(qiáng)的酵母基因啟動(dòng)子；（4）具有內(nèi)源表達(dá)載體和眾多的商業(yè)化載體（如Invitrogen）；（5）可以對(duì)所表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行多種翻譯后修飾；（6）其自然分泌的蛋白質(zhì)很少，產(chǎn)物處理方便簡(jiǎn)單；（7）具

10、有較高的安全性。被美國(guó)食品和醫(yī)藥管理局（FDA）確認(rèn) 為一種安全的生物（Generally recognized as safe, GRAS）。 牛牛文庫(kù)文檔分享 leu2編碼-異丙基蘋(píng)果酸脫氫酶（ - isopropylmalate dehydrogenase），該酶在亮氨酸的合成途徑中有重要作用。 克隆步驟：（1）提取酵母菌染色體DNA，經(jīng)適當(dāng)酶切，建立基因文 庫(kù)（質(zhì)粒載體，在E. coli中可復(fù)制）；（2）將攜帶酵母菌基因的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化E. coli -異丙基蘋(píng)果 酸脫氫酶缺陷型突變株LeuB，用不含Leu的培養(yǎng)基進(jìn) 行篩選轉(zhuǎn)化子；（3）抽提轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒DNA，酶切驗(yàn)證后，進(jìn)行序列分析；（4

11、）leu2基因的結(jié)構(gòu)確認(rèn)（啟動(dòng)子、RBS、起始序列、終 止序列與堿基數(shù)等）。牛牛文庫(kù)文檔分享釀酒酵母選擇性標(biāo)記基因leu2的克隆示意圖牛牛文庫(kù)文檔分享 釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)的常用載體通常有：質(zhì)粒載體、整合載體和酵母人工染色體。質(zhì)粒載體 酵母質(zhì)粒載體通常又可以分為酵母附加型載體(Yeast episomal plasmid, YEp)、酵母復(fù)制質(zhì)粒（Yeast replicating plasmid, YRp）和酵母著絲粒質(zhì)粒（Yeast centromere plasmid, YCp）三類(lèi)。 （1）YEp 由酵母菌內(nèi)生性質(zhì)粒改造而成。 釀酒酵母存在一個(gè)內(nèi)生性質(zhì)粒，大小為6.3kb，長(zhǎng)約為2 m，因

12、此又通常稱(chēng)為2 m質(zhì)粒。具有以下特點(diǎn)： 在酵母菌穩(wěn)定存在，自主復(fù)制與分配； 在酵母細(xì)胞中的copy數(shù)可達(dá)500100個(gè)；牛牛文庫(kù)文檔分享 含有一段長(zhǎng)度為599 bp的反向重復(fù)序列。該序列將該質(zhì)粒分成2部分，每一部分均含有一個(gè)啟動(dòng)子和該啟動(dòng)子控制下的2個(gè)基因，其中一個(gè)基因稱(chēng)為FLP，編碼一個(gè)位點(diǎn)特異性的重組酶（recombinase）。 2 m質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖牛牛文庫(kù)文檔分享 2 m質(zhì)粒的進(jìn)一步改造： 酵母菌-大腸桿菌穿梭質(zhì)粒（YEp）：加入部分酵母菌核DNA序列和大腸桿菌的質(zhì)粒復(fù)制子； 位點(diǎn)特異性重組質(zhì)粒載體：將E. coli的DNA插入到重組酶識(shí)別序列的正向重復(fù)序列中，經(jīng)過(guò)重組后該序列可以被丟

13、失。 牛牛文庫(kù)文檔分享帶polyA序列的磷酸甘油醛脫氫酶終止子磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子外源蛋白篩選標(biāo)記牛牛文庫(kù)文檔分享 （2）YRp 由大腸桿菌質(zhì)粒載體pBR322改造而成：加入一段來(lái)自于酵母菌的自主復(fù)制序列，從而使YRp能在酵母菌中復(fù)制，但是具有不穩(wěn)定性，容易丟失。 （3）YCp 含有酵母著絲粒序列的質(zhì)粒載體，能夠自主復(fù)制，穩(wěn)定遺傳。但是對(duì)酵母菌受體菌本身具有較大不利影響。 牛牛文庫(kù)文檔分享整合載體（YIp） 整合載體不含有酵母菌自主復(fù)制序列，不能在酵母菌中復(fù)制分配，但含有轉(zhuǎn)座子序列或者酵母菌染色體同源序列，可使其攜帶的外源基因通過(guò)轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座作用或者同源交換作用而整合到酵母菌的染色體上。 酵

14、母菌基因組中含有3040拷貝的轉(zhuǎn)座子，稱(chēng)為T(mén)y。Ty與反轉(zhuǎn)錄病毒在結(jié)構(gòu)和功能上具有很多相似之處：包含由兩個(gè)長(zhǎng)的ORF和兩個(gè)長(zhǎng)末端重復(fù)序列（LTR)。 外源基因插入位點(diǎn) 牛牛文庫(kù)文檔分享畢赤酵母整合表達(dá)載體AOX1p乙醇脫氫酶啟動(dòng)子；AOX1t帶有polyA序列的乙醇 脫氫酶終止子；HIS4組氨醇脫氫酶基因；oripp畢赤酵母復(fù)制區(qū)；oriE大腸桿菌復(fù)制區(qū)；Amp氨芐青霉素抗性基因；3-AOX1為乙醇脫氫酶基因3 端的一段DNA序列； 箭頭處指示發(fā)生染色體整合的位點(diǎn)。牛牛文庫(kù)文檔分享酵母人工染色體（YAC） 為一種線狀DNA載體，最初由酵母菌復(fù)制質(zhì)粒 pSZ213發(fā)展而來(lái)，含有選擇性標(biāo)記leu2

15、、自主復(fù)制序列和端粒序列。 現(xiàn)有多種商品化的酵母人工染色體，用于大片段DNA的克隆與序列分析。牛牛文庫(kù)文檔分享酵母人工染色體克隆系統(tǒng)YAC質(zhì)粒（pYAC）包括以下元件：（1）Ampr (大腸桿菌抗性標(biāo)記)（2）oriE（大腸桿菌復(fù)制子）（3）酵母菌DNA序列，包括：CEN，具有著絲粒功能；ARS，酵母自主復(fù)制序列，相當(dāng)于酵母菌復(fù)制子；URA3，尿嘧啶生物合成基因；TRP1，色氨酸生物合成基因。牛牛文庫(kù)文檔分享酵母人工染色體克隆系統(tǒng)YAC質(zhì)粒（pYAC）包括以下元件：（1）Ampr (大腸桿菌抗性標(biāo)記)（2）oriE（大腸桿菌復(fù)制子）（3）酵母菌DNA序列，包括：CEN，具有著絲粒功能；ARS，

16、酵母自主復(fù)制序列，相當(dāng)于酵母菌復(fù)制子；URA3，尿嘧啶生物合成基因；TRP1，色氨酸生物合成基因。T 位點(diǎn)是酵母菌染色體的端粒. SmaI 為克隆插入位點(diǎn). pYAC質(zhì)粒先用 SmaI和BamHI進(jìn)行酶切, 然后經(jīng)堿性磷酸酶處理（防止自連）后連接入外源DNA片段。牛牛文庫(kù)文檔分享牛牛文庫(kù)文檔分享在酵母中表達(dá)外源基因受到很多調(diào)控因子的影響，包括有以下因素： 一般應(yīng)考慮適用高拷貝數(shù)的YEp質(zhì)粒作為載體，但應(yīng)注意過(guò)高量的外源蛋白表達(dá)對(duì)酵母菌具有毒害作用，反而導(dǎo)致最終表達(dá)量的降低。低拷貝數(shù)的YEp質(zhì)粒，甚至YIp能穩(wěn)定地獲得較高外源蛋白表達(dá)量。 質(zhì)粒載體的不穩(wěn)定性也是影響外源蛋白表達(dá)的限制因素，因此在

17、商業(yè)生產(chǎn)中必須使用具有很高穩(wěn)定性能的質(zhì)粒載體。牛牛文庫(kù)文檔分享 大腸桿菌啟動(dòng)子與酵母啟動(dòng)子的比較： 序列：E. coli: TATAAT Yeast：TATATAA 啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的距離： E. coli: 10 bps Yeast：40120 bps 酵母菌啟動(dòng)子的上游存在一個(gè)上游激活序列（UAS）， 一般距轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)1001000 bps，因此一般酵母菌表 達(dá)載體具有很長(zhǎng)的“啟動(dòng)子序列”，通常達(dá)到1 kb。 一般使用可調(diào)控的啟動(dòng)子，可以增加外源蛋白的表達(dá)量。牛牛文庫(kù)文檔分享 酵母菌中幾種適用的可調(diào)控啟動(dòng)子： gal1、gal7和gal10等基因的啟動(dòng)子：受葡萄糖阻遏， 而受半乳糖誘

18、導(dǎo)；另一正調(diào)控物為gal4的表達(dá)產(chǎn)物 GAL4； ADH2（乙醇脫氫酶）啟動(dòng)子：受乙醇和葡萄糖調(diào)節(jié)； PHO5（酸性磷酸酶）啟動(dòng)子：由磷酸鹽調(diào)節(jié)； CUP1（Cu2+結(jié)合蛋白）啟動(dòng)子：Cu2+水平調(diào)節(jié)； 溫度調(diào)控啟動(dòng)子：升溫誘導(dǎo)牛牛文庫(kù)文檔分享 在高等動(dòng)物中，轉(zhuǎn)錄終止子一般出現(xiàn)在編碼序列下游很遠(yuǎn)處（幾百bp），然后再進(jìn)行聚腺苷?；饔?，而在酵母菌中，聚腺苷?；饔猛l(fā)生在緊靠轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3端。其終止子序列的精確結(jié)構(gòu)往往還不很清楚。 在構(gòu)建酵母菌表達(dá)載體時(shí)，往往需要從已了解的酵母基因轉(zhuǎn)錄終止的下游序列中克隆一大段終止序列片斷，將其放到需要表達(dá)的基因編碼序列的下游。 在需要表達(dá)的外源基因編碼序列的

19、下游有必要克隆一個(gè)有效的酵母終止序列，才能增加mRNA的穩(wěn)定性。牛牛文庫(kù)文檔分享 除了高效轉(zhuǎn)錄外，高效翻譯也是決定外源蛋白表達(dá)量的影響因素。起始密碼AUG必須容易被起始因子和核糖體準(zhǔn)確識(shí)別，而起始密碼附近序列決定翻譯啟動(dòng)的效率。一般在緊靠AUG密碼前2040個(gè)堿基中G出現(xiàn)的頻率很低（大約5），而如果G在這個(gè)區(qū)域大量出現(xiàn)，就會(huì)抑制翻譯的啟動(dòng)。 在酵母菌中表達(dá)的外源基因可能攜帶有酵母菌很少使用的密碼子，這樣就會(huì)減緩翻譯過(guò)程，若這些密碼子成串排列，則對(duì)翻譯特別有害。 解決辦法：使用酵母菌偏愛(ài)密碼子，可以通過(guò)分析哪些連續(xù)高水平表達(dá)內(nèi)源基因所采用的密碼加以確定。牛牛文庫(kù)文檔分享 許多外源基因在酵母菌中得

20、到高水平表達(dá)，并能進(jìn)行正確折疊，而在細(xì)菌中往往形成包含體（Inclusion body）。 原因： 細(xì)菌細(xì)胞為一個(gè)還原環(huán)境，不能形成二硫鍵； 酵母細(xì)胞內(nèi)存在多種分子伴侶。 在酵母菌中表達(dá)單一外源蛋白也會(huì)受到酵母菌蛋白酶的降解，尤其是N端裸露的單一蛋白。 解決辦法：改變N末端的序列，或者和內(nèi)源蛋白構(gòu)建融合蛋白，這樣在后處理中再設(shè)法去除非必需的融合成分。牛牛文庫(kù)文檔分享 通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體分泌的動(dòng)物蛋白一般都會(huì)在分泌過(guò)程中發(fā)生糖基化作用，這一過(guò)程可能有助于蛋白質(zhì)的正確折疊，增強(qiáng)它們對(duì)于蛋白酶的抗性。 但是，在酵母菌中發(fā)生的糖基化只會(huì)添加富含甘露糖的寡糖，而不會(huì)形成象在高等動(dòng)物細(xì)胞中普遍存在的那種

21、糖蛋白復(fù)合物，這種糖基化作用有時(shí)會(huì)影響到蛋白質(zhì)的折疊和對(duì)蛋白酶的敏感性，更重要的是會(huì)影響蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)的半衰期。 另外，在酵母菌中表達(dá)的外源蛋白也可能發(fā)生超糖基化，即每個(gè)N-寡糖鏈上都含有100個(gè)以上的甘露糖，而正常的高甘露糖寡糖鏈僅含有813個(gè)甘露糖。過(guò)多的甘露糖可能會(huì)影響蛋白質(zhì)的生物活性及其免疫原性。牛牛文庫(kù)文檔分享構(gòu)建過(guò)程（Merck）： （1）將HBsAg編碼基因克隆到乙醇氧化酶基因（aox1）啟動(dòng)子的下游；下游加上該基因的終止子和加poly(A)信號(hào)； （2）加入可在巴斯德畢赤酵母中復(fù)制的復(fù)制子、大腸桿菌pBR322的復(fù)制子、大腸桿菌的選擇標(biāo)記、一段幫助該質(zhì)粒整合到特定染色體位點(diǎn)的

22、序列（3-aox1）以及His合成過(guò)程中所需的His脫氫酶基因（his4）。 （3）受體菌采用His脫氫酶缺陷型（His4-），經(jīng)過(guò)雙交換后，染色體上的aox1丟失，而整合入aox1啟動(dòng)子-HBsAg-aox1終止子及加poly(A)信號(hào)序列、his4和3-aox1。牛牛文庫(kù)文檔分享 整合后的細(xì)胞可在不含His的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，或者選擇哪些在甲醇存在下生長(zhǎng)緩慢的細(xì)胞，因?yàn)閍ox1丟失后，僅剩aox2可以起作用了，而aox2沒(méi)有aox1有效，因此aox2可以使整合細(xì)胞在不含His的甲醇培養(yǎng)基中緩慢生長(zhǎng)。牛牛文庫(kù)文檔分享牛牛文庫(kù)文檔分享 在酵母菌中，只有分泌型的蛋白才能夠糖基化， 因此，凡是需要糖基

23、化的重組蛋白都必須是分泌型蛋白。 表達(dá)的外源蛋白在向外運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程中，會(huì)進(jìn)行二硫鍵形成、蛋白質(zhì)水解等翻譯后修飾。一般來(lái)說(shuō)，分泌到胞外后就成為具有活性的蛋白。前導(dǎo)肽的作用是引導(dǎo)蛋白質(zhì)穿膜，使蛋白質(zhì)分泌到壁膜間隙。 用釀酒酵母表達(dá)分泌型外源蛋白時(shí)，要求在前導(dǎo)肽（信號(hào)肽）的C端是Lys-Arg。因?yàn)榈鞍追置诘桨鈺r(shí)，酵母菌的內(nèi)切蛋白酶會(huì)識(shí)別Lys-Arg并切除前導(dǎo)肽， 把Lys-Arg密碼子緊接在cDNA基因之前，那么除去前導(dǎo)肽后就是正確的蛋白了。 構(gòu)建過(guò)程：在外源cDNA上游加上編碼酵母交配型因子1的前導(dǎo)肽的DNA序列。牛牛文庫(kù)文檔分享 應(yīng)用： （1）水蛭素（hirudin）的表達(dá) 水蛭素是一種強(qiáng)抗凝劑，在人體內(nèi)沒(méi)有免疫副反應(yīng)，可望發(fā)展成一種有效的溶血栓藥物。 牛牛文庫(kù)文檔分享（2）牛溶菌酶C2在畢赤酵母中的表達(dá) 牛溶菌酶可作用于細(xì)菌的細(xì)胞壁，促進(jìn)反芻動(dòng)物消化的飼料添加劑。 牛牛文庫(kù)文檔分享 （1）與原核表達(dá)系統(tǒng)相比較，酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組蛋白的表達(dá)量明顯較低； （2）質(zhì)粒的不穩(wěn)定性。在大量表達(dá)外源蛋白時(shí)，