酶聯(lián)免疫吸附實驗

1、酶聯(lián)免疫吸附實驗酶聯(lián)免疫吸附實驗 掌握酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）的原理 熟悉酶聯(lián)免疫吸附實驗的操作方法 了解其他免疫標記技術(shù) 一、實驗?zāi)康囊弧嶒災(zāi)康亩?、實驗原理二、實驗原理免疫學分析方法發(fā)展很快，特別是在使用標記了的抗原和抗體的分析技術(shù)以后，使原來許多經(jīng)典的分析方法在敏感性和特異性方面都不能相比。繼50年代的免疫熒光免疫熒光（IF）和60年代的放射免疫放射免疫(RIA)(RIA)分析技術(shù)之后，在70年代初期又建立了用酶來標記抗原或抗體的分析技術(shù)（酶免疫技術(shù)）。（酶免疫技術(shù)）。是指用熒光素、放射性同位素、酶、發(fā)光劑或電子致密物質(zhì)等作為示蹤劑，標記抗體或抗原進行的抗原抗體反應(yīng)。 特點：高度靈

2、敏、特異、快速，定性、定量、定位 分類：免疫酶技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、放射免疫技術(shù)、免疫電鏡技術(shù)、免疫膠體金技術(shù)和發(fā)光免疫測定。免疫標記技術(shù)（免疫標記技術(shù)（immunolabelling technique）免疫標記技術(shù) =免疫標記技術(shù)的主要特點：免疫標記技術(shù)的主要特點：高度特異性高度特異性、高度靈敏性高度靈敏性 免疫標記技術(shù)放射物標記技術(shù) 酶標記技術(shù) 免疫熒光技術(shù) 其他標記技術(shù)酶聯(lián)免疫吸附技術(shù) 酶免疫組化技術(shù)是將抗原和抗體的特異性免疫反應(yīng)與酶的催化反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種免疫檢測技術(shù)。 就是利用酶標記抗體或抗原，以檢測相應(yīng)抗原或抗體的一種免疫學標記技術(shù)。 Ag + AbAg + AbE E AgA

3、b AgAbE E + + 底物底物 呈色反應(yīng)呈色反應(yīng)酶免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)(enzyme immunoassay) 是一類常用的酶免疫技術(shù)。是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使抗原抗體反應(yīng)在固相表面進行。 ELISA法是免疫診斷中的一項新技術(shù)，現(xiàn)已成功地應(yīng)用于多種病原微生物所引起的傳染病、寄生蟲病及非傳染病等方面的免疫診斷。也已應(yīng)用于大分子抗原和小分子抗原的定量測定。ELISA法具有靈敏、特異、簡單、快速、穩(wěn)定及易于自動化操作等特點。不僅適用于臨床標本的檢查，而且由于一天之內(nèi)可以檢查幾百甚至上千份標本,因此，也適合于血清流行病學調(diào)查。本法不僅可以用來測定抗體，而且也可用于測定體液中的循環(huán)

4、抗原，所以也是一種早期診斷的良好方法。 酶聯(lián)免疫吸附試驗酶聯(lián)免疫吸附試驗ELISA（enzyme linked immunosorbent assay） ELISAELISA的基本原理有三條：的基本原理有三條：（1）抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載體表面，是蛋白和聚苯乙烯表面間的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫學活性；（2）抗原或抗體可通過共價鍵與酶連接形成酶結(jié)合物，而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學和酶學活性；（3）酶結(jié)合物與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合后，可根據(jù)加入底物的顏色反應(yīng)來判定是否有免疫反應(yīng)的存在，而且顏色反應(yīng)的深淺是與標本中相應(yīng)抗原或抗體的量成正比例的，因此，可以按底物顯色的程度顯示試驗結(jié)果

5、。 ELISA過程包括：抗原吸附在固相載體上，這個過程稱為包被，加待測抗體, 再加相應(yīng)酶標記抗體，生成抗原-待測抗體-酶標記抗體的復合物，再與該酶的底物反應(yīng)生成有色產(chǎn)物。借助分光光度計的光吸收計算抗體的量。待測抗體的量與有色產(chǎn)物成正比。同理也可包被抗體，測定抗原含量。由于酶的催化頻率很高，故可極大地地放大反應(yīng)效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。常用酶及其底物常用酶及其底物1.1.辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶(HRP)(HRP)常用底物：常用底物：(1)(1)鄰苯二胺鄰苯二胺(OPD)(OPD)：反應(yīng)顯橙黃色，應(yīng)避光，致癌性。反應(yīng)顯橙黃色，應(yīng)避光，致癌性。(2)(2)四甲基聯(lián)苯胺四甲基聯(lián)苯胺(

6、TMB)(TMB)：反應(yīng)后呈藍色，無需避光，無致癌反應(yīng)后呈藍色，無需避光，無致癌性性, , 但水溶性差。但水溶性差。酶反應(yīng)用HCL或H2SO4終止后，TMB產(chǎn)物由藍色呈黃色，最適吸收波長為 450nm。2.2.堿性磷酸酶堿性磷酸酶(AP)(AP)常用底物常用底物 對硝基苯磷酸酯對硝基苯磷酸酯(p-NPP)(p-NPP)：產(chǎn)物為黃色。產(chǎn)物為黃色。APAP靈敏性高與靈敏性高與HRPHRP，但不易獲得純品，穩(wěn)定性較，但不易獲得純品，穩(wěn)定性較HRPHRP差，且價差，且價高，故應(yīng)用不如高，故應(yīng)用不如HRPHRP普及。普及。peroxidase (POD) Colorimetric ELISA Subst

7、rates ELISA常用的幾種方法 (一)測定抗原的，主要有四種方法 1.競爭法 2.雙抗體夾心法 3.改良的雙抗體夾心法 4.抑制性測定法。(二)測定抗體方面：所用的方法稱為間接法，也 是目前最常用的方法. 三、實驗步驟三、實驗步驟 乙肝病毒存在三對抗原抗體系統(tǒng)乙肝病毒存在三對抗原抗體系統(tǒng)1.即表面抗原（即表面抗原（HbsAg）和表面抗體（抗）和表面抗體（抗-HBs）、）、2.e抗原（抗原（HBeAg）和）和e抗體（抗抗體（抗-HBe）、）、3.核心抗原（核心抗原（HBcAg）和核心抗體（抗）和核心抗體（抗-HBc） 因核心抗原主要存在于肝細胞中，血清中不能表達，檢測困難，因核心抗原主要存

8、在于肝細胞中，血清中不能表達，檢測困難，故只能檢測二對半而不能檢測三對，所以稱為二對半。故只能檢測二對半而不能檢測三對，所以稱為二對半。 實驗材料1.HBsAg診斷試劑盒2.HBsAg抗原（陽性對照），陰性血清，待檢血清微孔條已經(jīng)包被微孔條已經(jīng)包被HBsAb1、編號：微孔條按順序編號。2、加樣：分別加入待檢血清、陽性血清、陰性血清各50ul， 空白對照。3、加入酶結(jié)合物：每孔中加入酶結(jié)合物50ul，空白對照孔不加，輕拍混勻。4、溫育：貼上膠紙，37溫育30分鐘。5、洗滌：用洗滌液充分洗滌5次，洗滌完往后扣干（每次保持30-60秒的浸泡時間）。6、顯色：每孔加底物A、B各50ul，輕拍混勻，封口

9、，37暗置10-15分鐘。7、終止：每孔加終止液50ul，輕拍混勻。8、測定：用酶標儀單波長450nm測定各孔OD值，并記錄結(jié)果，讀數(shù)在加終止液10分鐘內(nèi)完成。結(jié)果判定：結(jié)果判定：1、臨界值（CO，cutoff）的計算：臨界值=陰性對照孔OD均值N2.1。2、陰性對照孔OD (optical density)均值大于0.1時重新實驗，小于0.05時以0.05計算。 結(jié)果判定：樣品OD值S/ CO1者為陽性， 樣品OD值S/ CO1者為陰性。四、注意事項四、注意事項 1、所有樣品按傳染源處理；2、加試劑前應(yīng)混勻，力求滴加準確；3、加樣應(yīng)加在板孔的底部，避免產(chǎn)生氣泡并迅速完成；4、洗滌時各孔均需加

10、滿，洗滌必須徹底，防止產(chǎn)生假陽性；5.溫育的時間要嚴格控制。五、五、 ELISA的影響因素的影響因素（一）固相載體（二）抗原 （三）試驗樣品 （四）結(jié)合物 (五）洗滌劑與稀釋劑 （六）底物 （七）作用時間 （八）結(jié)果判斷 (九)試驗的重復性（精確度） （十）對使用儀器要求 自習自習（一）固相載體（一）固相載體在在ELISAELISA中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反應(yīng)板及塑中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反應(yīng)板及塑料管。但每批微量反應(yīng)板對抗原或抗體蛋白質(zhì)的吸附性能料管。但每批微量反應(yīng)板對抗原或抗體蛋白質(zhì)的吸附性能是有顯著差別的。實驗證明，吸附效果似乎與塑料的類型是有顯著差別的。實驗證明，吸

11、附效果似乎與塑料的類型及其表面性質(zhì)有關(guān)。特別是塑料制品在加工過程中因工藝及其表面性質(zhì)有關(guān)。特別是塑料制品在加工過程中因工藝不同或受其他因素的影響而造成吸附性能的極大差異，甚不同或受其他因素的影響而造成吸附性能的極大差異，甚至完全喪失吸附能力。因此，對每批制品在使用前，必須至完全喪失吸附能力。因此，對每批制品在使用前，必須經(jīng)過實驗室鑒定經(jīng)過實驗室鑒定 。（二）抗原（二）抗原 包被所用的抗原必須是可溶性的，而且要求是優(yōu)質(zhì)和穩(wěn)定的制劑，純度和免疫原性要高。如果不純，由于抗原中所含雜質(zhì)就會競爭固相載體上的有限位置，降低敏感性和特異性。此外還應(yīng)考慮到制備包被抗原不應(yīng)破壞其免疫學活性。 對大多數(shù)傳染病和寄

12、生蟲病的血清學診斷中所用的抗原并非要求十分嚴格，一般能用于補體結(jié)合試驗的可溶性抗原均可用于ELISA。 對某些抗原必須進行提純，如病毒的組織培養(yǎng)和雞胚培養(yǎng)物以及病毒接種動物的臟器等，它們當中存在著許多非抗原的蛋白質(zhì)，必須設(shè)法除去，常用梯度超速離心或親和層析法提純，不經(jīng)提純是不能使用的。（三）試驗樣品（三）試驗樣品血清、血漿或其他體液，均可作為ELISA的試驗樣品（標本）。但應(yīng)注意分離血清時，血液要求放置室溫中凝固收縮，不宜置冰箱（4）中凝固，否則會使大部分IgM和少量IgG喪失活性。關(guān)于人血清在保存過程中抗體的穩(wěn)定性報導尚不多。但一般認為作ELISA血清最好要新鮮，若要貯藏，必須少量分裝保存于

13、低溫冰箱，并防止反復凍融。血漿可用肝素毛細管法采血，而血清可用濾紙片法采血。（四）結(jié)合物（四）結(jié)合物在ELISA中，用酶標記的抗體或抗原統(tǒng)稱為結(jié)合物，此為進行ELISA檢測的關(guān)鍵試劑。常規(guī)使用ELISA法的主要問題是能夠簡便地制備酶結(jié)合物，而此種制備好的酶結(jié)合物要求穩(wěn)定，具有很高的酶活性，抗原或抗體的特異性，產(chǎn)量高及成本低。（五）洗滌劑與稀釋劑（五）洗滌劑與稀釋劑加入牛血清白蛋白（BSA）和吐溫20抑制非特異性蛋白的競爭性吸附作用。它們有良好的封阻作用（六）底物（六）底物（1）底物在未被酶催化以前應(yīng)該是無色的，而經(jīng) 酶催化后有明顯的顏色變化，這樣可使結(jié)果分辨清楚；（2）所顯色澤易干洗脫；（3）

14、顯色后的產(chǎn)物要求穩(wěn)定，在作定量測定時所產(chǎn)生的有色物質(zhì)應(yīng)該是可溶性的；（4）價廉，易得而且無毒。（七）作用時間（七）作用時間(1) 任意確定一個時間，如20分鐘或30分鐘終止反應(yīng)，測定被檢標本和陽性參考標本的O.D值。這樣所得的數(shù)據(jù)要進行校正，校正可按下列公式： 校正后O.D絕對值=被檢標本的O.D值*（1.0/陽性標本的O.D值）(2) 制備好一批酶結(jié)合物后預試時間，在反應(yīng)溫度固定時，當陽性參考血清O.D值達到1.0時終止反應(yīng)，記錄這個時間，如30分鐘，以后用本批酶結(jié)合物測定待檢樣品時都采用同一時間終止反應(yīng)，這個辦法不需要校正，比較方便。（八）結(jié)果判斷（八）結(jié)果判斷 ELISA的試驗結(jié)果可用肉

15、眼觀察顏色反應(yīng)的深淺作出判斷，也可用分光光度計作精確測定。當然,后者更為正確。而肉眼觀察更為簡便，而且也有一定正確性。 不論用哪種方法判定結(jié)果，每次都要有陽性和陰性參考血清作對照，這樣可以消除一些外界的影響因素。( (九九) )試驗的重復性（精確度）試驗的重復性（精確度）記錄結(jié)果有下列幾種方法：1、“+”或“-”：所有超過規(guī)定的O.D值（如O.D，0.4）的標本均屬陽性，此規(guī)定O.D值是根據(jù)事先測定大量陰性標本所取得的，此規(guī)定值是陰性標本的上限?；蛘咭砸唤M陰性標本O.D平均值加23個標準差作為陽性閾值。 2、直接以O(shè).D值來表示，如0.4、0.7、1.2，O.D值越大，陽性反應(yīng)越強，但此數(shù)值是

16、在固定實驗條件下得到的結(jié)果，而且每次實驗都要有參考標本作對照。 3、以終點滴度表示：將標本作連續(xù)稀釋，最高稀釋度能出現(xiàn)陽性反應(yīng)者（即OD值仍大于陽性閾值，即為該標本的滴度。 4、以“比值”表示：求出被檢標本的O.D值與一組陰性標本O.D值的比值，例如為陰性標本的2倍或3倍，即為陽性，比值小于2.1而大于1.5為可疑，1.5為陰性。 測定標本O.D值-空白O.D值 2.1 陰性對照O.D值-空白O.D值 如在此測定時以空白校正“O”點。 5、以“單位”來表示：在測定被檢標本的同時，再測定一個含已知單位數(shù)的陽性參考血清，用不同稀釋度作ELISA檢測后，以O(shè).D值為縱坐標，單位數(shù)為橫坐標，畫出標準曲

17、線。以后可根據(jù)被檢標本的O.D值，從曲線上找出相應(yīng)的單位數(shù)，再乘于血清的稀釋倍數(shù)，即可得出被檢標本的單位數(shù)。 （十）對使用儀器要求（十）對使用儀器要求所用儀器如吸管、燒杯試管都要清潔，用于酶結(jié)合和底物的吸管和容器一定要分開。試劑要求標準化ELISA應(yīng)用的范圍很廣，而且正在不斷地擴大，原則上ELISA可用于檢測一切抗原、抗體及半抗原，可以直接定量測定體液中的可溶性抗原。酶免疫試驗（EIA）結(jié)合光學顯微鏡或電子顯微鏡可進行抗原定位與結(jié)構(gòu)的研究，用酶標記抗原或抗體結(jié)合免疫擴散及免疫電泳可提高試驗的敏感性。在實際應(yīng)用方面可作疾病的臨床診斷、疾病監(jiān)察、疾病普查、法醫(yī)檢查、獸醫(yī)及農(nóng)業(yè)上的植物病害的診斷檢定

18、等。因此，它和生物化學、免疫學、微生物學、藥理學、流行病學及傳染病學等方面密切相關(guān) 。六六、ELISA的應(yīng)用的應(yīng)用( (一一):):檢查抗原和半抗原方面檢查抗原和半抗原方面 1.內(nèi)分泌方面已經(jīng)用于檢測雌性激素、絨毛膜促性腺激素、黃體素、胰島素、皮質(zhì)醇、促甲狀腺素和孕酮等，其敏感性與RIA相當 2.在血液學方面可用于檢查凝固因子（如第凝固因子）、紅細胞抗原及結(jié)合球蛋白（Hapto Globin）等 3.在腫瘤方面已試用檢查甲胎蛋白（AFP）癌胚抗原（CEA），對前者的敏感性已達到與放射免疫試驗相當?shù)乃?，但對CEA檢查的敏感性較低，目前尚不能用于常規(guī)診斷 4.在傳染病的診斷方面正在日益擴大，其中

19、最滿意的是用于檢查乙型肝炎表面抗原 5.在免疫化學方面可用于檢測白蛋白，免疫球蛋白的各種組份，也可用于檢測補體成份，還能用于檢測蛇毒。 6.還可用于植物組織漿液中檢查植物病毒。此外尚試用于測鉤體抗原及血吸蟲病的循環(huán)抗原等。 (二):檢查抗體方面 用ELISA間接法檢查抗體，已獲得對多種傳染病和寄生蟲病的血清學診斷，亦開始廣泛用于現(xiàn)場流行病學調(diào)查。1.在寄生蟲病方面，它用于對瘧原蟲、阿米巴、利日曼原蟲、錐蟲、血吸蟲、囊蟲、弓漿蟲、肺吸蟲、肝吸蟲、血絲蟲、旋毛蟲病等血清學診斷，這對人醫(yī)和獸醫(yī)都很重要。2.在病原微生物方面已用于檢查鏈球菌、沙門氏菌、布氏桿菌、結(jié)核桿菌、麻瘋桿菌、霍亂弧菌、淋球菌、假絲酵母菌等的抗體，還可用于破傷風抗毒素和霍亂弧菌抗毒素的測定以及檢測斑疹傷寒立克次氏體感染后的抗體，可作診斷 3.試用于病毒抗體檢查報告的有：流感病毒、腮腺炎病毒、麻診、風疹、輪狀病毒、皰疹病毒、巨細胞病毒、EB病毒、腺病毒、腸道病毒、腦炎病毒、黃熱病毒、