MTT配制、原理、操作步驟、結(jié)果分析、注意事項(xiàng)

1、MTT 配制、原理、操作步驟、結(jié)果分析、注意事項(xiàng)四、實(shí)驗(yàn)所需材料1 MTT 溶液的配制通常 MTT 配成的終濃度為5mg/ml, 須用 PBS 或生理鹽水做溶劑。市面上一般MTT 的包裝為100mg,250mg 或 1g1.1 對于 100mg 這樣的小包裝，廠家都是將MTT 放入小管中的，個(gè)人建議不要再用天平稱量分裝，而應(yīng)該一次性將其全配制成溶液，如100mg 用 20mlPBS 來溶解。具休做法：預(yù)先在50ml 離心管（沒有的話，可用培養(yǎng)瓶替代）加入20ml PBS ，從中先吸取500-1000ul PBS 裝入含 MTT 的小管中，吹打若干次后將其移入50ml 離心管，然后再混勻?？梢灾?/p>

2、復(fù)幾次，以使小管中的MTT 不殘留于管內(nèi)。將MTT完全混勻后，用0.22m 濾膜過濾以除去溶液里的細(xì)菌，分裝避光（避光袋或是黑紙、錫箔紙包?。┛砷L期保存于 -20 度。 按細(xì)胞培養(yǎng)板每孔需加10ul 計(jì)算， 一般每 96 孔板約需1ml ， 所以分裝時(shí)可考慮每管分裝1ml 。1.2 對于大包裝，可按上述方法稱取一部分溶解，也有人將粉劑分裝在EP 管里，用的時(shí)候現(xiàn)配，直接往培養(yǎng)板中加。 注意事項(xiàng)： l 在配制和保存的過程中，容器最好用鋁箔紙包住。l 配成的 MTT 需要無菌，MTT 對菌很敏感l(wèi) MTT 一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后4 度避光保存兩周內(nèi)（個(gè)人曾做過4 度避光保存4 周的 MTT 溶液

3、，效果仍然不錯(cuò)）有效，或配制成5mg/ml 保存在 -20 度長期保存，避免反復(fù)凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。當(dāng)MTT 變?yōu)榛揖G色時(shí)就絕對不能再用。l MTT 有致癌性，用的時(shí)候小心,有條件最好帶那種透明的簿膜手套.2 MTT 甲瓚溶解液2.1 二甲基亞砜DMSO ，可以直接溶解，無需配制，使用方便，溶解速度快，但對人體毒性較大，且需去除原培養(yǎng)液，在去除培養(yǎng)液的過程中，可能會把結(jié)晶去掉，導(dǎo)致結(jié)果不穩(wěn)定。2.2 三聯(lián)溶解液：SDS10g ，異丁醇5ml ， 10M HCl 0.1ml 用雙蒸水溶解配成100ml 溶液（文獻(xiàn)方法：周建軍等，評價(jià)抗癌物質(zhì)活性的改良M

4、TT 方法，中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，1993 ， 24 （ 10 ） ： 455-457 ） ，該溶解液不需去除原培養(yǎng)基，但溶解較慢。（個(gè)人覺得其溶解的能力不如DMSO 強(qiáng)）該溶解液因含有SDS ，在低溫保存的時(shí)候易產(chǎn)生結(jié)晶，因此在用之前必須提前幾小時(shí)拿至室溫，將SDS結(jié)晶全部溶解后再使用。五、 MTT 法實(shí)驗(yàn)步驟1: 胰酶消化對數(shù)期細(xì)胞，終止后離心收集，制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整其濃度至5-10 ×104/ml。細(xì)胞詳細(xì)計(jì)數(shù)方法請參照 中的相關(guān)文章。對于初學(xué)者而言，要使細(xì)胞達(dá)到5-10×104/ml 往往不知從何處著手，我在這里向大家提供一個(gè)簡單的方法以初步確定細(xì)胞數(shù)量。以一般

5、細(xì)胞培養(yǎng)常用的25cm2 為例，1）細(xì)胞密度在長到約80%90%（下圖所示為80%90%密度時(shí)細(xì)胞的大致狀態(tài)），消化離心收集后，將上清去掉，加入3ml 培養(yǎng)基使其混勻。2） 另取一支新的15ml 無菌離心管（為下一步接種96 孔板用） ，裝入約9ml培養(yǎng)基 .3） 從第一步準(zhǔn)備的3ml 細(xì)胞 懸液中取1ml, 加入上管，混勻后細(xì)胞計(jì)數(shù)，此時(shí)一般為或小于5-10×104/ml，該濃度相當(dāng)于細(xì)胞計(jì)數(shù)板4 個(gè)大格內(nèi)每大格平均5-10 個(gè)細(xì)胞（見下圖）； 如果不夠該濃度，再根據(jù)計(jì)數(shù)的結(jié)果滴加細(xì)胞懸液， 每滴按 50ul 計(jì)算。4） 細(xì)胞數(shù)量因?qū)嶒?yàn)?zāi)康牟煌瑧?yīng)做相應(yīng)調(diào)整，如一般細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔2

6、000 個(gè)就可以（相當(dāng)于細(xì)胞懸液密度為2×104/ml） ，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔5000 10000 個(gè)（相當(dāng)于細(xì)胞懸液密度為 5× 104/ml ）。此外，還應(yīng)根據(jù)細(xì)胞本身特性，如生長快慢，來決定細(xì)胞數(shù)量。比如：生長較快的細(xì)胞密度可略小。2將細(xì)胞懸液制備好后，輕輕混勻，每孔加入100ul, 這樣待測細(xì)胞的密度為5000 10000/孔（邊緣孔用無菌PBS 填充）。注意： 因細(xì)胞在混勻后仍要繼續(xù)沉降，因此接種的過程中要反復(fù)多次混勻，如每加 6 個(gè)孔就混勻一次，以確保接種的細(xì)胞密度在各孔之間完全相同，這對于MTT 的結(jié)果至關(guān)重要。3. 將接種好的細(xì)胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細(xì)胞

7、單層鋪滿孔底（96 孔平底板）,加入濃度梯度的藥物,原則上，細(xì)胞貼壁后即可加藥，或兩小時(shí)，或半天時(shí)間，但我們常在前一天下午鋪板， 次日上午加藥.一般 5-7 個(gè)梯度,每孔100ul,設(shè) 3-5 個(gè)復(fù)孔.建議設(shè)6 個(gè)，否則難以反應(yīng)真實(shí)情況。下圖可做為96 孔板的的參考步局。對于加藥，有人直接將藥物按不同體積加入到96 孔板中，以形成濃度梯度。但本人認(rèn)為應(yīng)盡量在EP 管中將不同濃度的藥物配好，然后將96 孔板中的培養(yǎng)上清去掉（可以用排槍吸走）再加入100ul 含不同濃度藥物的培養(yǎng)基，這樣能保證藥物濃度的準(zhǔn)確。另外，需注意的是，如果用這種方法，不要把96 孔板的培養(yǎng)液全部吸走后再加藥，應(yīng)該吸完一部分

8、后立即加樣，避免由于96 孔板干燥引起細(xì)胞死亡。4. 5%CO2， 37孵育16-48 小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察藥物的作用效果。下圖為一典型的藥物梯度為細(xì)胞的毒性作用。5. 每孔加入10ulMTT 溶液（ 5mg/ml ，即 0.5%MTT ） ，繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與MTT 能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS 沖 2-3 遍后，再加入含MTT 的培養(yǎng)液。6. 終止培養(yǎng)，準(zhǔn)備溶解結(jié)晶。溶解結(jié)晶的方法有兩種，第一種，用DMSO 溶解1） MTT 加入培養(yǎng)4h 后，結(jié)晶可充分形成。將上清去掉，該過程要注意不能把 Formazan 結(jié)晶移走。有人直接用移液器將上清移走，也有人建議先鋪幾張濾紙

9、在桌面，然后將96 孔板輕輕倒置，這樣上清便被濾紙吸走，以減少結(jié)果的損失。個(gè)人認(rèn)為，這兩種方法都有可能導(dǎo)致結(jié)晶的損失，從而引起結(jié)果的不準(zhǔn)確。采用哪種方法，可以自己摸索一下再?zèng)Q定。2） 每孔加入150ul 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm 處測量各孔的吸光值。另一種方法，用三聯(lián)溶解液（見上面MTT 甲瓚溶解液）1） MTT 加入培養(yǎng)4h 后， 結(jié)晶可充分形成。這種方法細(xì)胞上清可以不用去掉，直接在每孔加入100ul 溶解液。（該溶解液因含有SDS，在低溫保存的時(shí)候易產(chǎn)生結(jié)晶，因此在用之前必須提前幾小時(shí)拿至室溫，將 SDS 結(jié)晶全部溶解后再使用

10、。）2） 放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 6 小時(shí)，鏡下觀察，待結(jié)晶全部溶解后570nm 測吸光度。通常37孵育 4 小時(shí)左右，紫色結(jié)晶會全部溶解。如果紫色結(jié)晶較小較少，溶解的時(shí)間會短一些。如果紫色結(jié)晶較大較多，溶解的時(shí)間會長一些。在實(shí)際的操作過程中，往往為了等待4 6 小時(shí)，使得實(shí)驗(yàn)者在下班以后或者晚上來測OD 值，給實(shí)驗(yàn)者帶來了很大的不方便。個(gè)人曾經(jīng)摸索，加入溶解液后過夜再測對OD 值基本無影響，但要注意的是一定要避光，不過培養(yǎng)箱關(guān)閉后本身就是閉光的，所以加入溶解液后放入培養(yǎng)箱中，第二天上班時(shí)再測OD 值就可以了。7、同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT 、二甲基亞砜），對照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解

11、介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT 、二甲基亞砜）。MTT 的操作方法1、 MTT 是什么MTT 是一種粉末狀化學(xué)試劑，全稱為3-（4,5）-dimethylthiahiazo （-z-y1）-3,5-di-phenytetrazoliumromide ，漢語化學(xué)名為3-（4， 5-二甲基噻唑-2）-2 ， 5-二苯基四氮唑溴鹽， 商品名：噻唑藍(lán)。是一種黃顏色的染料。2、 MTT 法用來做什么簡單地說：是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法。MTT 主要有兩個(gè)用途1 藥物（也包括其他處理方式如放射線照射）對體外培養(yǎng)的細(xì)胞毒性的測定；2細(xì)胞增殖及細(xì)胞活性測定。MTT 可以用來做上述工作檢測原理為活細(xì)胞 線粒體中的琥珀

12、酸脫氫酶能使外源性MTT 還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（ Formazan ）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO ）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶標(biāo)儀 在 490nm 波長處測定其光吸收值，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT 結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。根據(jù)測得的吸光度值（OD 值），來判斷活細(xì)胞數(shù)量，OD 值越大，細(xì)胞活性越強(qiáng)（如果是測藥物毒性，則表示藥物毒性越?。?。四、實(shí)驗(yàn)所需材料1 MTT 溶液的配制通常 MTT 配成的終濃度為5mg/ml, 須用 PBS 或生理鹽水做溶劑。市面上一般MTT 的包裝為100mg,250mg 或 1g1.1 對于 100mg 這樣的小包裝，廠家都是

13、將MTT 放入小管中的，個(gè)人建議不要再用天平稱量分裝，而應(yīng)該一次性將其全配制成溶液，如100mg 用 20mlPBS 來溶解。具休做法：預(yù)先在 50ml 離心管 （沒有的話，可用培養(yǎng)瓶 替代）加入20ml PBS ，從中先吸取500-1000ulPBS 裝入含 MTT 的小管中，吹打若干次后將其移入50ml 離心管 ，然后再混勻?？梢灾貜?fù)幾次， 以使小管中的MTT 不殘留于管內(nèi)。將 MTT 完全混勻后，用 0.22 m 濾膜過濾以除去溶液里的細(xì)菌，分裝避光（避光袋或是黑紙、錫箔紙包住）可長期保存于-20 度。按 細(xì)胞培養(yǎng)板 每孔需加10ul 計(jì)算，一般每96 孔板約需1ml，所以分裝時(shí)可考慮每

14、管分裝1ml 。1.2 對于大包裝，可按上述方法稱取一部分溶解，也有人將粉劑分裝在EP 管里，用的時(shí)候現(xiàn)配，直接往培養(yǎng)板中加。注意事項(xiàng)：l 在配制和保存的過程中，容器最好用鋁箔紙包住。l 配成的 MTT 需要無菌，MTT 對菌很敏感l(wèi)MTT 一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后4 度避光保存兩周內(nèi)（個(gè)人曾做過4度避光保存4 周的MTT 溶液， 效果仍然不錯(cuò)）有效， 或配制成5mg/ml 保存在 -20 度長期保存，避免反復(fù)凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。當(dāng)MTT 變?yōu)榛揖G色時(shí)就絕對不能再用。lMTT 有致癌性，用的時(shí)候小心,有條件最好帶那種透明的簿膜手套.2 MTT 甲瓚溶

15、解液2.1 二甲基亞砜DMSO ，可以直接溶解，無需配制，使用方便，溶解速度快，但對人體毒性較大，且需去除原培養(yǎng)液，在去除培養(yǎng)液的過程中，可能會把結(jié)晶去掉，導(dǎo)致結(jié)果不穩(wěn)定。2.2 三聯(lián)溶解液：SDS 10g， 異丁醇 5ml ， 10M HCl 0.1ml 用雙蒸水溶解配成100ml 溶液 （文獻(xiàn)方法：周建軍等，評價(jià)抗癌物質(zhì)活性的改良MTT 方法，中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，1993， 24（ 10）：455-457 ），該溶解液不需去除原培養(yǎng)基，但溶解較慢。（個(gè)人覺得其溶解的能力不如 DMSO 強(qiáng)）該溶解液因含有SDS ，在低溫保存的時(shí)候易產(chǎn)生結(jié)晶，因此在用之前必須提前幾小時(shí)拿至室溫，將SDS 結(jié)晶全

16、部溶解后再使用。五、 MTT 法實(shí)驗(yàn)步驟1 : 胰酶消化對數(shù)期細(xì)胞，終止后離心收集，制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整其濃度至5-10 ×104/ml。細(xì)胞詳細(xì)計(jì)數(shù)方法請參照易生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)中的相關(guān)文章。對于初學(xué)者而言，要使細(xì)胞達(dá)到5-10× 10 4/ml 往往不知從何處著手，我在這里向大家提供一個(gè)簡單的方法以初步確定細(xì)胞數(shù)量。以一般細(xì)胞培養(yǎng)常用的25cm 2為例，2 ） 細(xì)胞密度在長到約80%90% （下圖所示為80%90% 密度時(shí)細(xì)胞的大致狀態(tài)），消化離心收集后，將上清去掉，加入3ml 培養(yǎng)基使其混勻。2）另取一支新的15ml 無菌 離心管 （為下一步接種96 孔板用），裝入約

17、9ml 培養(yǎng)基 .3）從第一步準(zhǔn)備的3ml 細(xì)胞懸液中取1ml, 加入上管，混勻后細(xì)胞計(jì)數(shù)，此時(shí)一般為或小于5-10 ×104/ml，該濃度相當(dāng)于細(xì)胞計(jì)數(shù)板 4 個(gè)大格內(nèi)每大格平均5-10 個(gè)細(xì)胞（見下圖）；如果不夠該濃度，再根據(jù)計(jì)數(shù)的結(jié)果滴加細(xì)胞懸液，每滴按50ul 計(jì)算。）細(xì)胞數(shù)量因?qū)嶒?yàn)?zāi)康牟煌瑧?yīng)做相應(yīng)調(diào)整，如一般細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔2000 個(gè)就可以（相當(dāng)于細(xì)胞懸液密度為2×104/ml），細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔5000 10000 個(gè)（相當(dāng)于細(xì)胞懸液密度為 5× 104/ml）。此外，還應(yīng)根據(jù)細(xì)胞本身特性，如生長快慢，來決定細(xì)胞數(shù)量。比如：生長較快的細(xì)胞密度可略小。

18、3 將細(xì)胞懸液制備好后，輕輕混勻，每孔加入100ul, 這樣待測細(xì)胞的密度為5000 10000/孔（邊緣孔用無菌PBS 填充）。l 注意：因細(xì)胞在混勻后仍要繼續(xù)沉降，因此接種的過程中要反復(fù)多次混勻，如每加6 個(gè)孔就混勻一次，以確保接種的細(xì)胞密度在各孔之間完全相同，這對于MTT 的結(jié)果至關(guān)重要。4 .將接種好的細(xì)胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96 孔平底板）,加入濃度梯度的藥物, 原則上，細(xì)胞貼壁后即可加藥，或兩小時(shí)，或半天時(shí)間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥.一般 5-7 個(gè)梯度,每孔100ul, 設(shè) 3-5 個(gè)復(fù)孔.建議設(shè)6 個(gè)，否則難以反應(yīng)真實(shí)情況。下圖可做為96

19、 孔板的的參考步局。l 對于加藥，有人直接將藥物按不同體積加入到96 孔板中，以形成濃度梯度。但本人認(rèn)為應(yīng)盡量在EP 管中將不同濃度的藥物配好，然后將96 孔板中的培養(yǎng)上清去掉（可以用排槍吸走）再加入100ul 含不同濃度藥物的培養(yǎng)基，這樣能保證藥物濃度的準(zhǔn)確。另外，需注意的是，如果用這種方法，不要把96 孔板的培養(yǎng)液全部吸走后再加藥，應(yīng)該吸完一部分后立即加樣，避免由于96 孔板干燥引起細(xì)胞死亡。4.5%CO2 ， 37 孵育 16-48 小時(shí)， 倒置顯微鏡下觀察藥物的作用效果。下圖為一典型的藥物梯度為細(xì)胞的毒性作用。5 .每孔加入10ulMTT 溶液（ 5mg/ml ，即 0.5%MTT ）

20、，繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與MTT 能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS 沖 2-3 遍后，再加入含MTT 的培養(yǎng)液。6 . 終止培養(yǎng)，準(zhǔn)備溶解結(jié)晶。l 溶解結(jié)晶的方法有兩種，第一種，用DMSO 溶解1） MTT 加入培養(yǎng)4h 后，結(jié)晶可充分形成。將上清去掉，該過程要注意不能把Formazan結(jié)晶移走。有人直接用移液器 將上清移走，也有人建議先鋪幾張濾紙 在桌面，然后將96 孔板輕輕倒置，這樣上清便被濾紙 吸走，以減少結(jié)果的損失。個(gè)人認(rèn)為，這兩種方法都有可能導(dǎo)致結(jié)晶的損失，從而引起結(jié)果的不準(zhǔn)確。采用哪種方法，可以自己摸索一下再?zèng)Q定。2） 每孔加入150ul 二甲基亞砜，置搖床 上低速振蕩1

21、0min ，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm 處測量各孔的吸光值。l 另一種方法，用三聯(lián)溶解液（見上面MTT 甲瓚溶解液）1） MTT 加入培養(yǎng)4h 后，結(jié)晶可充分形成。這種方法細(xì)胞上清可以不用去掉，直接在每孔加入 100ul 溶解液。（該溶解液因含有SDS ，在低溫保存的時(shí)候易產(chǎn)生結(jié)晶，因此在用之前必須提前幾小時(shí)拿至室溫，將SDS 結(jié)晶全部溶解后再使用。）2） 放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 6 小時(shí)，鏡下觀察，待結(jié)晶全部溶解后570nm 測吸光度。通常 37 孵育4 小時(shí)左右，紫色結(jié)晶會全部溶解。如果紫色結(jié)晶較小較少，溶解的時(shí)間會短一些。如果紫色結(jié)晶較大較多，溶解的時(shí)間會長一些。在

22、實(shí)際的操作過程中，往往為了等待4 6 小時(shí)，使得實(shí)驗(yàn)者在下班以后或者晚上來測OD值， 給實(shí)驗(yàn)者帶來了很大的不方便。個(gè)人曾經(jīng)摸索，加入溶解液后過夜再測對OD 值基本無影響， 但要注意的是一定要避光，不過培養(yǎng)箱關(guān)閉后本身就是閉光的，所以加入溶解液后放入培養(yǎng)箱中，第二天上班時(shí)再測OD 值就可以了。7、同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT 、二甲基亞砜）。六、 MTT 結(jié)果分析關(guān)于如何計(jì)算IC501 、改良寇式法:lgIC50=Xm-I（P-（3-Pm-Pn）/4）Xm:lg 最大劑量I:lg（最大劑量/相臨劑量）P: 陽性反應(yīng)率之和Pm:

23、 最大陽性反應(yīng)率Pn: 最小陽性反應(yīng)率舉個(gè)例子：各藥物濃度作用于某腫瘤細(xì)胞后所得MTT 值如下藥物濃度ug/ml100502512.56.253.1250OD 均值0.0800.0930.2360.3740.4410.5310.614公式中的最大最小陽性反應(yīng)率就是最大最小抑制率抑制率 =1-加藥組 OD 值 /對照組OD 值，如對于100ug/ml 的藥物，其抑制率=1-0.080/0.614=0.869 ，各組抑制率如下：ug/ml100502512.56.253.1250.8690.8490.6160.3910.2820.135代入計(jì)算公式：Pm=0.869Pn=0.135P=0.869+

24、0.849+0.616+0.391+0.282+0.135=3.142Xm=lg100=2lgI=lg100/50=0.301lgIC50=2-0.301*(3.142-(3-0.869-0.135)/4)=1.655IC50=45.186該藥物的IC50 值為 45.186ug/mlMTT 所有問題大匯總實(shí)驗(yàn)前應(yīng)明確的問題1. 選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度。一般情況下，96 孔培養(yǎng)板的一內(nèi)貼壁細(xì)胞長滿時(shí)約有105 個(gè)細(xì)胞。但由于不同細(xì)胞貼壁后面積差異很大，因此，在進(jìn)行MTT 試驗(yàn)前，要進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測其貼壁率、倍增時(shí)間以及不同接種細(xì)胞數(shù)條件下的生長曲線，確定試驗(yàn)中每孔的接種細(xì)胞數(shù)和培養(yǎng)時(shí)間，以保證培

25、養(yǎng)終止致細(xì)胞過滿。這樣，才能保證MTT 結(jié)晶形成酌量與細(xì)胞數(shù)呈的線性關(guān)系。否則細(xì)胞數(shù)太多敏感性降低，太少觀察不到差異。2. 藥物濃度的設(shè)定。一定要多看文獻(xiàn)，參考別人的結(jié)果再定個(gè)比較大的范圍先初篩。根據(jù)自己初篩的結(jié)果縮小濃度和時(shí)間范圍再細(xì)篩。切記！否則，可能你用的時(shí)間和濃度根本不是藥物的有效濃度和時(shí)間。3. 時(shí)間點(diǎn)的設(shè)定。在不同時(shí)間點(diǎn)的測定OD 值，輸入excel 表，最后得到不同時(shí)間點(diǎn)的抑制率變化情況，畫出變化的曲線，曲線什么時(shí)候變得平坦了（到了平臺期）那個(gè)時(shí)間點(diǎn)應(yīng)該就是最好的時(shí)間點(diǎn)（因?yàn)檫@個(gè)時(shí)候的細(xì)胞增殖抑制表現(xiàn)的最明顯）。4. 培養(yǎng)時(shí)間。200ul 的培養(yǎng)液對于10 的 45 次方的增殖期

26、細(xì)胞來說，很難維持68h ，如果營養(yǎng)不夠的話，細(xì)胞會由增殖期漸漸趨向G0 期而趨于靜止，影響結(jié)果，我們是在48h 換液的。5. MTT 法只能測定細(xì)胞相對數(shù)和相對活力，不能測定細(xì)胞絕對數(shù)。做 MTT 時(shí)， 盡量無菌操作，因?yàn)榧?xì)菌也可以導(dǎo)致MTT 比色 OD 值的升高。6. 理論未必都是對的。要根據(jù)自己的實(shí)際情況調(diào)整。7. 實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)設(shè)置調(diào)零孔，對照孔，加藥孔。調(diào)零孔加培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜。對照孔和加藥孔都要加細(xì)胞、培養(yǎng)液、MTT 、二甲基亞砜，不同的是對照孔加溶解藥物的介質(zhì)，而加藥組加入不同濃度的藥物。8. 避免血清干擾。用含15% 胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，高的血清物質(zhì)會影響試驗(yàn)孔的光吸

27、收值。由于試驗(yàn)本底增加，會試驗(yàn)敏感性。因此，一般選小于10% 胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行。在呈色后，盡量吸凈培養(yǎng)孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)步驟 貼壁細(xì)胞：1. 收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100ul ，鋪板使待測細(xì)胞調(diào)密度至1000-10000 孔，（邊緣孔用無菌PBS 填充）。2. 5%CO2 ， 37 孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96 孔平底板），加入濃度梯度的藥物，原則上，細(xì)胞貼壁后即可加藥，或兩小時(shí)，或半天時(shí)間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥 . 一般 5-7 個(gè)梯度，每孔100ul ，設(shè) 3-5 個(gè)復(fù)孔 . 建議設(shè) 5 個(gè)，否則難以反應(yīng)真實(shí)情況3. 5%CO2 ， 37 孵育 16-48 小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。4. 每孔加入20ulMTT 溶液（ 5mg/ml ，即 0.5%MTT ），繼續(xù)培養(yǎng)4h 。若藥物與MTT 能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS 沖 2-3 遍后，再加入含MTT 的培養(yǎng)液。5. 終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。6. 每孔加入150ul 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min ，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀 OD490nm 處測量各孔的吸光值。7. 同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT 、二甲基亞砜），對照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT 、二甲基亞砜）懸浮細(xì)胞：1.