工具酶和基因載體

1、 一、基因研究的發(fā)展過程 二、DNA的組成、結(jié)構(gòu)和功能 三、基因工程的概念及主要內(nèi)容 四、工具酶和基因載體 五、基因工程的基本技術(shù) 六、基因工程在食品產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用四、工具酶和基因載體 4.1 基因工程的工具酶 限制性內(nèi)切酶 DNA連接酶 DNA聚合酶 4.2 基因工程載體 質(zhì)粒載體 噬菌體載體 柯斯質(zhì)粒載體 4.1 基因工程的工具酶（1）限制性內(nèi)切酶 限制性內(nèi)切酶的定義和分類 II型限制性內(nèi)切酶的命名 II型限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列 II型限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn) II型限制性內(nèi)切酶的的主要用途 限制性內(nèi)切酶的定義 是一類能識(shí)別雙鏈DNA中特殊核苷酸序列，并在合適的反應(yīng)條件下使每條鏈一定位點(diǎn)上的磷

2、酸二酯鍵斷開，產(chǎn)生具有3-OH基團(tuán)和5-P基團(tuán)的DNA片段的內(nèi)切脫氧核糖核酸酶。 至今發(fā)現(xiàn)的限制性內(nèi)切酶有三種類型，各具特性，基因工程操作中真正有用的是II型酶。 限制性內(nèi)切酶的命名 命名原則一般是以酶源生物的屬名和種名前1、2個(gè)字母以及株(型)代號(hào)來命名。如果從同一種生物中先后分離到多種限制性內(nèi)切酶，則依次用羅馬數(shù)字表示。 舉例：EcoRI中的Eco表示從大腸桿菌(Escherichia coli)中分離出來的，R代表大腸桿菌的R株，I表示從中分離出的第一種限制性內(nèi)切酶。 從流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)菌株d中分離出來的第三種限制酶，被命名為HindIII。 I

3、I型限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列 限制性內(nèi)切酶在雙鏈DNA上能夠識(shí)別的核苷酸序列被稱為識(shí)別序列。 多數(shù)限制酶的識(shí)別序列由6個(gè)核苷酸對(duì)組成。 如常用的限制酶EcoRI、HindIII和BamHI的識(shí)別序列分別是 GAATTC AAGCTT GGATCC CTTAAG 、 TTCGAA、 CCTAGG。 少數(shù)限制酶的識(shí)別序列由4個(gè)或5個(gè)核苷酸對(duì)組成，或者由多于6個(gè)核苷酸對(duì)組成。 如Sau3A的識(shí)別序列是GATC MaeIII的識(shí)別序列是GTNAC CTAG， CANTG。 限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列的共同規(guī)律：呈回文結(jié)構(gòu)，即序列被正讀和反讀是一樣的。 為了便于書寫，識(shí)別序列可以以5 3走向的單鏈DNA表示。例

4、如，識(shí)別序列5AAGCTT 3就可以寫成 3TTCGAA 5 AAGCTT。 有的限制酶可識(shí)別兩種以上的核苷酸序列。例如，AccI既可識(shí)別GTATAC，又可識(shí)別GTCGAC。 II型限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn) DNA在限制性內(nèi)切酶的作用下，使多聚核苷酸鏈上磷酸二酯鍵斷開的位置被稱為酶切位點(diǎn)，可用 表示。 限制酶在DNA上的酶切位點(diǎn)一般是在識(shí)別序列內(nèi)部，如G GATCC、AT CGAT等。少數(shù)在兩側(cè)，如 GATC、 CATG 等。 DNA分子經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切產(chǎn)生的DNA片段末端，因所用限制酶不同而不同。HindIII對(duì)雙鏈DNA分子的切割作用限制性內(nèi)切酶造成粘性末端有利于重組DNA 分子的構(gòu)建 I

5、I型限制性內(nèi)切酶的主要用途 (1) 在特異位點(diǎn)上切割DNA，產(chǎn)生特異的限制酶切割的DNA片段。 對(duì)于核苷酸序列已知的DNA分子，可利用此法直接分離目的基因。 (2) 建立DNA分子的限制性內(nèi)切酶物理圖譜 B E H BHEH BEM3 kb2kb1.5 kb1 kb500 b(a)BBBEHBHEB(b)BEBEBEEEHHEHHBHBHBBBB3 .31.71.71.61.40.32.03.03.50.61.50.93.51.52.31.00.51.23.31.7限制性作圖的基本原理 (3) 構(gòu)建基因文庫 基因工程中，需要將某種生物的全部基因組的遺傳信息，貯存在可以長(zhǎng)期保存的穩(wěn)定的重組體中，

6、以備需要時(shí)隨時(shí)能夠應(yīng)用。這種保存基因組遺傳信息的材料(受體細(xì)胞)，就稱為基因文庫。 (4) 用限制酶切出相同的黏性末端，以便重組DNA。5G-C-T- C-T-G-C-A-G-G-A-G33C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C5(2)DNA連接酶 DNA連接酶的定義 能將兩段DNA拼接起來的酶稱為DNA連接酶。該酶催化DNA相鄰的5磷酸基團(tuán)和3羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，將DNA單鏈缺口封合起來。 OH PDNA連接酶5G-C-T- C-T-G-C-A G-G-A-G33C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C5OH P DNA連接酶只能封閉雙螺旋DNA骨架上的缺口(nick)

7、，即雙鏈DNA上的某一條鏈上兩個(gè)相鄰核苷酸之間失去一個(gè)磷酸二酯鍵所出現(xiàn)的單鏈斷裂，而不能封閉裂口(gap)，即在雙鏈DNA的某一條鏈上失去一個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸所形成的單鏈斷裂。 DNA連接酶的種類 目前常用的DNA連接酶有大腸桿菌DNA連接酶和T4連接酶。 大腸桿菌DNA連接酶只能催化雙鏈DNA片段互補(bǔ)黏性末端之間的連接。 T4連接酶可用于雙鏈DNA片段互補(bǔ)黏性末端之間的連接，也能催化雙鏈DNA片段平末端之間的連接，但平末端之間的連接效率比較低。 DNA連接酶的連接作用 (a)缺口DNA (b)平末端DNA (c)粘性末端DNA分子 粘性末端DNA片段的連接 具粘性末端的DNA片段的連接比較容易，

8、也比較常用。但是，在連接反應(yīng)混合物中，具有粘性末端的載體DNA分子會(huì)發(fā)生自我環(huán)化作用，并在連接酶的作用下重新變成穩(wěn)定的共價(jià)閉合的環(huán)形結(jié)構(gòu)。這樣，就會(huì)使只含有載體分子的轉(zhuǎn)化子克隆的“本底”比例大幅上升，最終給重組DNA分子的篩選工作帶來麻煩。 用堿性磷酸酶預(yù)先處理線性的載體DNA分子，以移去其末端的5磷酸基團(tuán)，可以克服這一缺點(diǎn)。堿性磷酸酶的脫磷酸作用阻止線性的質(zhì)粒DNA分子再環(huán)化 平末端DNA片段的連接 基因克隆實(shí)驗(yàn)中，常用的平末端DNA片段的連接法，主要有同聚物加尾法、接頭連接法等。 (1)同聚物加尾法 同聚物加尾法是利用互補(bǔ)的同聚物序列之間的退火作用完成的連接。其核心部分是，利用末端脫氧核苷

9、酸轉(zhuǎn)移酶（能夠在無模板鏈的情況下，將核苷酸加到DNA分子單鏈延伸末端的3-OH基團(tuán)上）轉(zhuǎn)移核苷酸的特殊功能。 應(yīng)用互補(bǔ)的同聚物加尾法連接DNA片段 (2)接頭連接法 DNA接頭，是一類人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端，另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片段。人工接頭連接(3)DNA聚合酶 DNA聚合酶的定義 具有催化DNA體外合成反應(yīng)作用的酶稱為DNA聚合酶。這類酶的特點(diǎn)在于，能夠把脫氧核苷酸連續(xù)地加到雙鏈DNA分子引物鏈的3-OH末端，催化核苷酸的聚合作用。DNA聚合酶作用時(shí)大多都需要模板，合成產(chǎn)物的序列與模板互補(bǔ)。 常用的DNA聚合酶 大腸桿菌DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶、 T7

10、 DNA聚合酶、耐熱DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶等。 到目前為止，已從大腸桿菌中純化出了三種不同類型的DNA聚合酶，即大腸桿菌DNA聚合酶I、 DNA聚合酶II和DNA聚合酶III。 DNA聚合酶I、 DNA聚合酶II的主要功能是參與DNA的修復(fù)過程，而DNA聚合酶III的主要功能與DNA的復(fù)制有關(guān)。 基因工程中常用的DNA聚合酶 耐熱DNA聚合酶：是它的發(fā)現(xiàn)使PCR擴(kuò)增特異性DNA片段成為可能。PCR反應(yīng)過程中需將模板DNA置于高溫下變性、解鏈，而耐熱DNA聚合酶在靶DNA變性的高溫下仍能保持活性，因而在PCR過程中只需一次性加入反應(yīng)系統(tǒng)即可，簡(jiǎn)化了操作過程。 目前有于PCR的耐熱DNA聚合酶主要

11、有Taq DNA聚合酶、Pwo DNA聚合酶和Tth DNA聚合酶等。 反轉(zhuǎn)錄酶：催化以單鏈RNA為模板生成雙鏈DNA的反應(yīng)，又稱依賴RNA的DNA聚合酶。 反轉(zhuǎn)錄酶是分子生物學(xué)中最重要的核酸酶之一。以mRNA模板合成cDNA，是其最主要的用途。反轉(zhuǎn)錄酶的5 3方向的DNA聚合酶活性 都齊全了，能夠在試管中切割或連接都齊全了，能夠在試管中切割或連接DNA了了4.2 基因工程載體理想的基因工程載體應(yīng)具備的特征(1)具有復(fù)制起點(diǎn)，能攜帶外源DNA片段進(jìn)入受體細(xì)胞，進(jìn)行穩(wěn)定的DNA自我/同步復(fù)制(2)具有標(biāo)記基因(3) 具有若干限制酶的單一識(shí)別位點(diǎn)(4) 具有較高的外源DNA的載裝能力常見的基因工程

12、載體 包括質(zhì)粒載體、 噬菌體類載體等。(1)質(zhì)粒載體 質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性 質(zhì)粒DNA 質(zhì)粒DNA的復(fù)制類型 質(zhì)粒載體的構(gòu)建及重要的質(zhì)粒載體 天然質(zhì)粒用作克隆載體的局限性 重要的質(zhì)粒載體 質(zhì)粒DNA 質(zhì)粒是存在于細(xì)胞質(zhì)中的一類獨(dú)立于染色體的自主復(fù)制的遺傳成分。 絕大多數(shù)是質(zhì)粒都是由環(huán)形雙鏈DNA分子組成的復(fù)制子。 環(huán)形雙鏈的質(zhì)粒DNA分具有三種不同的構(gòu)型： 共價(jià)閉合環(huán)形DNA(SC)、開環(huán)DNA(OC)和線形DNA(L)。 質(zhì)粒DNA的分子構(gòu)型 在瓊脂糖凝膠電泳中，不同構(gòu)型的同一種質(zhì)粒DNA具有不同的電泳遷移率。走在最前沿的是scDNA，其后依次是LDNA和ocDNA。 質(zhì)粒DNA瓊脂糖凝膠電

13、泳模式圖 不同質(zhì)粒DNA分子量差異顯著，小的不到1 kb，大的超過500 kb，多數(shù)在10 kb。 標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)粒命名，通常用一個(gè)小寫的p來代表質(zhì)粒，而用一些英文縮寫或數(shù)字來對(duì)這個(gè)質(zhì)粒進(jìn)行描述。例如，pBR322，BR代表研究出這個(gè)質(zhì)粒的研究者Bolivar和Rogigerus姓氏的頭一個(gè)字母，322是實(shí)驗(yàn)編號(hào)。 質(zhì)粒DNA的復(fù)制類型 根據(jù)寄主細(xì)胞所含拷貝數(shù)的多少，可將質(zhì)粒分成兩個(gè)不同的復(fù)制型：一種是低拷貝數(shù)的質(zhì)粒（1-3份拷貝），稱為“嚴(yán)密型”復(fù)制控制的質(zhì)粒；另一種是高拷貝數(shù)的質(zhì)粒（10-60份拷貝)，稱為“松弛型”復(fù)制控制的質(zhì)粒。 拷貝數(shù)的常用定義：生長(zhǎng)在標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)基條件下，每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞中所含

14、有的質(zhì)粒DNA分子的數(shù)目。 有的文獻(xiàn)定義為每條細(xì)菌染色體所平均具有的質(zhì)粒DNA分子的數(shù)目。 一種質(zhì)粒究竟是屬于嚴(yán)密型還是松弛型并非絕對(duì)的，還受到寄主的控制。例如，R1質(zhì)粒 大腸桿菌寄主（嚴(yán)密型）、奇異變型桿菌寄主（松弛型）。 2.質(zhì)粒載體的構(gòu)建及重要的質(zhì)粒載體 (1)重組體分子的轉(zhuǎn)化存在三種可能性 (1)沒有轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主細(xì)胞 (2)質(zhì)粒發(fā)生自身環(huán)化，沒有重組成功（空載質(zhì)粒） (3)重組成功（重組質(zhì)粒） 質(zhì)粒的克隆位點(diǎn)位于抗菌素標(biāo)記之外無抗性有抗性有抗性質(zhì)粒的克隆位點(diǎn)位于抗菌素標(biāo)記之內(nèi)無抗性有抗性無抗性克隆位點(diǎn)克隆位點(diǎn)克隆位點(diǎn)克隆位點(diǎn) 質(zhì)粒的克隆位點(diǎn)位于抗菌素標(biāo)記之外無抗性有兩種抗性有兩種抗性質(zhì)粒

15、的克隆位點(diǎn)位于抗菌素標(biāo)記之內(nèi)無抗性有兩種抗性有一種抗性克隆位點(diǎn)克隆位點(diǎn)抗菌素抗性基因抗菌素抗性基因克隆位點(diǎn)克隆位點(diǎn)抗菌素抗性基因抗菌素抗性基因(2) 天然質(zhì)粒用作克隆載體的局限性q 天然質(zhì)粒是指那些沒有經(jīng)過以基因克隆為目標(biāo)的體外修飾改造的質(zhì)粒。 例如：天然質(zhì)粒pSC101 特點(diǎn)：只有一個(gè)四環(huán)素抗性選擇標(biāo)記(Tetr)，三個(gè)基因插入失活克隆位點(diǎn)和一個(gè)其它克隆位點(diǎn)(EcoRI)。 缺點(diǎn)：分子量較大(9.1 kb)，拷貝數(shù)較低，只有一個(gè)抗菌素抗性基因（無法使用插入失活技術(shù)選擇重組體分子） (3)重要的質(zhì)粒載體 為改進(jìn)轉(zhuǎn)化子篩選技術(shù)，有必要用人工的方法構(gòu)建一種既帶有多種抗藥性的選擇記號(hào)，又具有低分子量

16、、高拷貝、以及外源DNA插入不影響復(fù)制功能的多種限制酶單酶切位點(diǎn)等優(yōu)點(diǎn)的新的質(zhì)粒載體。 pBR322質(zhì)粒載體 酵母2m質(zhì)粒 pBR322質(zhì)粒載體 構(gòu)建pBR322質(zhì)粒的關(guān)鍵性步驟是，通過體內(nèi)易位或體外重組加入可選擇的抗藥性記號(hào)，同時(shí)設(shè)法除去非必要的區(qū)段（親本質(zhì)粒DNA上一些對(duì)基因克隆無關(guān)緊要的DNA片段，及對(duì)DNA克隆無用的限制酶識(shí)別位點(diǎn)），以降低分子量。pBR322質(zhì)粒三個(gè)不同來源的組成部分質(zhì)粒載體pBR322pBR322質(zhì)粒的優(yōu)點(diǎn)質(zhì)粒的優(yōu)點(diǎn)具有較小的分子量(4.36 kb)；具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號(hào)；具有較高的拷貝數(shù)2) 酵母2m質(zhì)粒 酵母是一種最簡(jiǎn)單的單細(xì)胞真核生物，

17、具有對(duì)外源基因翻譯后進(jìn)行蛋白質(zhì)加工和修飾的功能。 在啤酒酵母中發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒，多數(shù)長(zhǎng)度為2m 。在每個(gè)細(xì)胞中的平均拷貝數(shù)為50-100，能穩(wěn)定地存活于細(xì)胞中。 目前已構(gòu)建了一系列用于酵母轉(zhuǎn)基因的質(zhì)粒載體，也包括穿梭質(zhì)粒載體。酵母質(zhì)粒具有廣闊的發(fā)展前景。(2)噬菌體類載體 質(zhì)粒載體在基因工程研究中快速簡(jiǎn)便，但由于其自身特性的限制，最大可以克隆的DNA片段一般在10 kb左右。若要構(gòu)建一個(gè)基因文庫，往往需要克隆更大一些的DNA片段。為滿足這一要求，人們把噬菌體發(fā)展成為一種克隆載體。 噬菌體是寄生在細(xì)菌中的病毒，其結(jié)構(gòu)比細(xì)菌或真核細(xì)胞簡(jiǎn)單，但比質(zhì)粒分子復(fù)雜得多。它由蛋白質(zhì)外殼和頭部外殼內(nèi)的DNA組成。高

18、效率的感染性能使外源基因高效導(dǎo)入受體細(xì)胞；自主復(fù)制繁殖性能使外源基因在受體細(xì)胞中高效擴(kuò)增，因而噬菌體能被開發(fā)成基因工程的有用載體。 v噬菌體的一般生物學(xué)特性噬菌體的結(jié)構(gòu)及其核酸類型 噬菌體有三種不同的基本類型，即無尾部結(jié)構(gòu)的二十面體型、具尾部結(jié)構(gòu)的二十面體型和線狀體型。 噬菌體的核酸，最常見的是雙鏈線性DNA。 噬菌體的結(jié)構(gòu)示意圖 噬菌體的生命周期 可分為溶菌周期和溶源周期兩種不同的類型。溶菌周期噬菌體（烈性噬菌體）將其感染的寄主細(xì)胞變成噬菌體的“制造廠”，產(chǎn)生大量的子代噬菌體顆粒。溶源生長(zhǎng)周期噬菌體（溫和噬菌體）不產(chǎn)生子代噬菌體顆粒，噬菌體DNA是整合到寄主細(xì)胞染色體DNA上。噬菌體的生命周期 烈性噬菌體的生命周期噬菌體的生命周期 溫和噬菌體的生命周期v噬菌體載體 噬菌體是一種中等大小的溫和噬菌體。其基因組中有部分基因?yàn)榉潜匾颍煌庠椿蛉〈?，并不影響其生命功能。這是賴以發(fā)展作為基因克隆載體的一種重要特性。 噬菌體線性DNA分子的粘性末端(cos位點(diǎn))及其環(huán)化作用v 噬菌體載體的主要類型 構(gòu)建噬菌體載體的基本原理是多余限制位點(diǎn)的刪除和切除掉非必要的區(qū)段。 構(gòu)建出的派生載體，可歸納成兩種類型：一種只具有一個(gè)可供外源DNA插