第3章_微生物細(xì)胞的破碎技術(shù)

1、 1.1目的物位置目的物位置胞外產(chǎn)品：胞外產(chǎn)品：各種胞外酶、胞外多糖、細(xì)胞代謝物各種胞外酶、胞外多糖、細(xì)胞代謝物細(xì)胞本身：細(xì)胞本身：單細(xì)胞蛋白（單細(xì)胞蛋白（SCP）胞內(nèi)產(chǎn)品胞內(nèi)產(chǎn)品: 胞內(nèi)酶，基因工程產(chǎn)物等胞內(nèi)酶，基因工程產(chǎn)物等1.2 1.2 細(xì)胞的破碎定義細(xì)胞的破碎定義 用物理、化學(xué)、酶或機(jī)械的方法破壞細(xì)胞壁或細(xì)胞膜。用物理、化學(xué)、酶或機(jī)械的方法破壞細(xì)胞壁或細(xì)胞膜。1.3 1.3 細(xì)胞壁特點(diǎn)細(xì)胞壁特點(diǎn)a.a.保護(hù)細(xì)胞保護(hù)細(xì)胞 b.b.調(diào)節(jié)、控制代謝調(diào)節(jié)、控制代謝 c.c.抗機(jī)械撞擊抗機(jī)械撞擊第第3章章 微生物細(xì)胞的破碎微生物細(xì)胞的破碎1. 微生物細(xì)胞的破碎技術(shù)概述微生物細(xì)胞的破碎技術(shù)概述2

2、細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu) 1.細(xì)胞壁的組成和破碎阻力細(xì)胞壁的組成和破碎阻力2.細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu) 2.1 細(xì)胞壁的組成和破碎阻力細(xì)胞壁的組成和破碎阻力2.1.1細(xì)菌細(xì)菌：肽聚糖，蛋白質(zhì)，磷壁酸，糖，脂；主要阻力來自于肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。2.1.2酵母菌：酵母菌：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白質(zhì)，脂；主要阻力來自于壁結(jié)構(gòu)交聯(lián)的緊密程度和厚度。2.1.3絲狀真菌：絲狀真菌：多糖，蛋白質(zhì)，脂類，葡聚糖，幾丁質(zhì)，主要阻力來自于壁強(qiáng)度和聚合物網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。back2.2 細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)細(xì)菌的細(xì)胞壁細(xì)菌的細(xì)胞壁酵母菌的細(xì)胞壁酵母菌的細(xì)胞壁絲狀真菌的細(xì)胞壁絲狀真菌的細(xì)胞壁backnextbac

3、k2.2.1細(xì)菌細(xì)胞壁的組成細(xì)菌細(xì)胞壁的組成a：肽聚糖b：氨基酸：D-丙氨酸， D-谷氨酸，L-丙氨酸， L-賴氨酸c：磷壁質(zhì)：糖醛磷酸酯的聚合物革蘭氏陽性菌d：糖e：脂質(zhì)革蘭氏陰性菌2.2.2 革蘭氏陽性菌革蘭氏陽性菌a.1550層肽聚糖片層b.壁磷壁酸和膜磷壁酸2.2.3革蘭氏陰性菌革蘭氏陰性菌 a.12層肽聚糖片層b.脂蛋白（將外膜固定于肽聚糖層）、脂質(zhì)雙層及脂多糖（穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)）back酵母菌的細(xì)胞壁酵母菌的細(xì)胞壁back絲狀真菌的細(xì)胞壁絲狀真菌的細(xì)胞壁各種微生物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)與組成各種微生物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)與組成 3 微生物細(xì)胞的破碎技術(shù)微生物細(xì)胞的破碎技術(shù) 3.1細(xì)胞破碎機(jī)理圖細(xì)胞破碎機(jī)

4、理圖3.1.1高壓勻漿法高壓勻漿法高壓勻漿器原理利用高壓迫使細(xì)胞懸浮液通過針形閥，由于突然減壓和高速沖擊撞擊環(huán)造成細(xì)胞破裂,從低壓環(huán)境釋放出來。構(gòu)造：高壓位移泵、針形閥影響因素：a. Tb.操作壓力高壓勻漿器高壓勻漿器3.1.2 珠磨法珠磨法v原理：在膜腔中裝入小玻璃球或小鋼球，在攪拌漿的作用下，它將使細(xì)胞懸浮液與細(xì)胞懸浮液，細(xì)胞懸浮液與玻璃小珠、石英砂或氧化鋁一起發(fā)生碰撞、剪切，使細(xì)胞在某種程度上破碎，再由液珠分離器分開、排出。（這些裝置的主要缺點(diǎn)是在破碎期間樣品溫度迅速升高，通過用二氧化碳來冷卻容器可得到部分解決。）v構(gòu)件：微珠、冷卻裝置、攪拌漿、液珠分離器、物料進(jìn)出口。見圖高速珠磨機(jī)高速

5、珠磨機(jī)影響因素：攪拌速度 適中細(xì)胞濃度最佳珠粒的大小、用量T5-40流量小(6)微生物特性3.1.3超聲波法原理：細(xì)胞的破碎是由于超聲波的空穴作用，從而產(chǎn)生一個(gè)極為強(qiáng)烈的沖擊波壓力，由它引起的粘滯性旋渦在介質(zhì)中的懸浮細(xì)胞上造成了剪切應(yīng)力，促使細(xì)胞內(nèi)液體發(fā)生流動，從而使細(xì)胞破碎。適用：對于不同菌種的發(fā)酵液、超聲波處理的效果不同，桿菌比球菌易破碎、革蘭氏陰性菌細(xì)胞比革蘭氏陽性菌細(xì)胞容易破碎，對酵母菌的效果級差。特點(diǎn)：該法不適于大規(guī)模操作，因?yàn)榉糯蠛?，要輸入很高的能量來提供必要的冷卻，這是困難的。 電聲超聲波發(fā)生器電聲超聲波發(fā)生器影響因素：a.振幅聲能b.粘度小c.表面張力小d.用量e.球珠大小f.

6、探頭材料、形狀鈦，小g.流速 3.2.1 化學(xué)法定義：化學(xué)試劑溶解細(xì)胞壁或抽提細(xì)胞中某些組分的方法。常用：a.酸堿：可以使蛋白質(zhì)水解或蛋白質(zhì)電荷改變b.脂溶性有機(jī)溶劑如丁醇、丙酮、氯仿及尿素等溶解細(xì)胞壁脂質(zhì)層從而使細(xì)胞溶解或使某些組分從細(xì)胞內(nèi)滲漏出來（但是，這些試劑容易引起生化物質(zhì)破壞，還會帶來分離和回收化學(xué)物質(zhì)的問題。） c.表面活性劑兩性基團(tuán)（親水基團(tuán)、疏水基團(tuán)） 3.2.2 酶解法定義：利用酶反應(yīng)，分解破壞細(xì)胞壁上特殊的鍵使細(xì)胞壁通途性發(fā)生改變，從而達(dá)到破壁的目的。優(yōu)點(diǎn)：專一性強(qiáng)，條件溫和，破壞少，收率高，無細(xì)胞碎片。缺點(diǎn)：酶水解費(fèi)用較貴，一般只適用于小規(guī)模的實(shí)驗(yàn)室研究。常用酶： a.溶

7、菌酶，它能專一地分解細(xì)胞壁上糖蛋白分子的-1，4糖苷鍵，使脂多糖解離，經(jīng)溶菌酶處理后的細(xì)胞移至低滲溶液中使細(xì)胞破裂。b.細(xì)菌：糖苷酶，多肽酶，N-乙酰胞壁酰胺-L-丙氨酸酰胺酶C. 真菌、酵母：葡聚糖酶，甘露糖酶，甲克素酶，蛋白酶d.藻類：纖維素酶注意事項(xiàng)a.適應(yīng)酶以及酶反應(yīng)體系b.特定的反應(yīng)條件：T、pH、濃度等c.與其他方法結(jié)合起來Eg:輻射、高濃度鹽、加EDTA及生長因子等3.2.3 滲透壓沖擊滲透：高低原理：將細(xì)胞放在高滲透壓的介質(zhì)中(如一定濃度的甘油或蔗糖溶液，細(xì)胞失水)，待達(dá)到平衡后，介質(zhì)被突然稀釋，或者將細(xì)胞轉(zhuǎn)入水或緩沖液中，由于滲透壓的突然變化，水迅速進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞壁的破

8、裂。適用：滲透壓沖擊的方法僅對細(xì)胞壁較脆弱的菌，或者細(xì)胞壁預(yù)先用酶處理，或合成受抑制而強(qiáng)度減弱時(shí)才是合適的。 3.2.4凍結(jié)-融化法定義：將細(xì)胞放在低溫下突然冷凍和室溫下融化，反復(fù)多次而達(dá)到破壁作用。原理：疏水鍵破壞；水結(jié)成冰體積增大。適用：對于細(xì)胞壁較脆弱的菌體，可采用此法。但通常破碎率很低即使反復(fù)循環(huán)多次也不能提高收率。另外，還可能引起對凍融敏感的某些蛋白質(zhì)的變性。3.2.5干燥法可采用空氣干燥，真空干燥，噴霧干燥和冷凍干燥等?？諝飧稍镏饕m用于酵母菌。真空干燥適用于細(xì)菌的干燥。冷凍干燥適用于較不穩(wěn)定的生化物質(zhì)。干燥法條件變化較劇烈，容易引起蛋白質(zhì)或其它組織變性。細(xì)胞破碎主要方法細(xì)胞破碎主

9、要方法 機(jī)械破碎法與非機(jī)械法比較機(jī)械破碎法與非機(jī)械法比較 3.3 破碎方法的選擇破碎方法的選擇細(xì)胞的數(shù)量破碎條件目標(biāo)產(chǎn)物對破碎條件的敏感性破碎目標(biāo)待破碎細(xì)胞的機(jī)械強(qiáng)度3.3.1破碎方法選擇原則破碎方法選擇原則(1) (1) 目標(biāo)生化物質(zhì)的位置：目標(biāo)生化物質(zhì)的位置：(2) (2) 目標(biāo)生化物質(zhì)對破碎條件的敏感性：目標(biāo)生化物質(zhì)對破碎條件的敏感性： (3) 破碎程度、目的破碎程度、目的 (4) 規(guī)模、經(jīng)濟(jì)規(guī)模、經(jīng)濟(jì)3.4破碎率的測定破碎率的測定 1.直接測定法平板計(jì)數(shù)直接測定法平板計(jì)數(shù)2.間接法測定釋放的蛋白質(zhì)量或酶的活力或間接法測定釋放的蛋白質(zhì)量或酶的活力或相對電導(dǎo)率相對電導(dǎo)率4. 4. 基因工程

10、表達(dá)產(chǎn)物的后處理基因工程表達(dá)產(chǎn)物的后處理 包含體的分離與復(fù)性包含體的分離與復(fù)性 4.1什么是包含體 外源蛋白質(zhì)基因在受體菌中表達(dá)時(shí)形成的不溶的沒有活性的蛋白質(zhì)聚集體稱為包含體。（包含體內(nèi)除目標(biāo)蛋白外還有微量的質(zhì)粒，rRNA和RNA聚合酶。） 4.2包含體形成的原因 蛋白質(zhì)的多肽鏈折疊成立體結(jié)構(gòu)的過程中受周圍環(huán)境的影響，分子間的相互作用影響到分子內(nèi)的折疊。a.由于表達(dá)的外源蛋白缺少某些折疊的協(xié)助因子或局部微環(huán)境不適宜，不能正確的形成次級鍵。b.表達(dá)率過高，合成速度太快，無足夠的時(shí)間折疊，二硫鍵不能正確配對，過多的蛋白質(zhì)間非特異性結(jié)合，導(dǎo)致溶解度降低。 c.重組蛋白氨基酸組成硫氨基酸越多越易形成包含體。 d.重組蛋白質(zhì)是E.coli異源蛋白，大量生成后，缺乏修飾所需要的酶和輔助因子，致使中間體大量累積，異形成包含體。E.蛋白質(zhì)的自身溶解性特點(diǎn)a.穩(wěn)定性好b.表達(dá)量高c.雜蛋白少e.對機(jī)械攪拌和超聲破碎不敏感，易破碎 包含體分離的工藝路線 收集菌體細(xì)胞破碎離心分離洗滌除變性劑復(fù)性變性溶解1.破碎2.洗滌尿素、Triton-1003.變性溶解SDS、尿素、鹽酸胍、DDT、2ME4.復(fù)性a.定義：變性包含體