生化分析知識點總結(jié)

1、氨基酸1 八種必須氨基酸的英文命名及縮寫賴氨酸 Lysine LysK甲硫氨酸MethionineMetM纈氨酸valine ValV異亮氨酸isoleucineIleI苯丙氨酸phenylaninePheF亮氨酸leucineLeuL色氨酸t(yī)ryptophanTryW蘇氨酸t(yī)hreoninethrT2 倆種氨基酸組成多肽時，有幾種成二肽，有四種 成三肽時，有八種(僅供參考，不一定正確，有不同意見請指出來) 。二 酶分析1 酶活性的定義，國際常用的單位：酶活性( enzyme activity )也稱為酶活力，指酶促反應(yīng)速率，即 規(guī)定條件下在單位時間內(nèi)產(chǎn)物的生成量或底物的減少量。 酶活性單位：

2、表示酶的相對含量，指在一定條件下，單位時間 內(nèi)生成一定量的產(chǎn)物或消耗一定量的底物所催化的酶量。a國際單位 IU( mol/min ) 定義：在規(guī)定條件下( 25及其他最適條件) ，每分鐘催化 1mol 底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的酶量，為 1IU或 1U。 1IU=1mol/minBKatal 單位（ mol/s）定義： 1Katal 是在規(guī)定條件下，每秒鐘催化 1mol 底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn) 物的酶量。 1Katal1mol/s 。IU與Katal單位的關(guān)系： 1katal = 60×106IU，1IU =3 酶促反應(yīng)酶促反應(yīng)的歷程：延滯期，線性期，非線性期 a酶促反應(yīng)式：B米氏方程C Km的含義與意

3、義VmaxvKm的含義: 當(dāng) Km=S時，2 可見 Km值等于反應(yīng)速率達(dá)到最大反應(yīng)速率 Vmax 一半時的底物濃度。Km 的意義：Km 是酶的一個特征性常數(shù)（其他如等電點） ，Km 的大小只與酶的性質(zhì)有關(guān) 反映酶對底物親和力的大小 選擇酶的最適底物或天然底物 計算不同底物濃度時的反應(yīng)程度 鑒別酶的種類判斷可逆反應(yīng)的速率 判斷酶偶聯(lián)反應(yīng)的限速反應(yīng) 計算工具酶的用量3.兩種測定酶活性的方法： a定時法原理： 定時法是固定時間法的簡稱，是指測定反應(yīng)開始后一段時間 （t1t2）產(chǎn)物的增加量或底物的減少量以測定酶活性的方法。該方 法一般需要在反應(yīng)進行到一定時間后用強酸、 強堿、蛋白沉淀劑等終 止反應(yīng)。優(yōu)

4、點：簡單、不需要保溫設(shè)備、不用考慮酶的活性。缺點：如果不做預(yù)試驗則無法了解其酶促反應(yīng)進程（ t1-t2 ）是否 為零級反應(yīng)，故難以確保測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。b連續(xù)檢測法：原理： 連續(xù)監(jiān)測法是指在多個時間點連續(xù)測定產(chǎn)物（或底物）在線 性期內(nèi)的生成量（或消耗量）即零級反應(yīng)速率以測定酶活性的方法， 又稱速率法、零級反應(yīng)速率法、斜率法。該方法是在一定的反應(yīng)時間區(qū)段內(nèi)（至少 9 120s）每隔一定時 間（常為 230s）讀取一次吸光度值，連續(xù)測定多點（至少 4 點）， 然后對吸光度數(shù)據(jù)作最小二乘法處理， 再用線性期內(nèi)的數(shù)據(jù)計算單位 時間內(nèi)的反應(yīng)速率 A/min ，最后計算出酶活性。U/LAu 106 VTu

5、 tu l Vu連續(xù)監(jiān)測法的特點：屬于即時觀測，無需停止酶促反應(yīng)、不需添加其他呈色試劑，可將多點的測定結(jié)果繪圖連線，快速、直觀查看酶 促反應(yīng)進程，很容易找到呈直線的線性期；連續(xù)監(jiān)測法要求不顯色而是直接測定底物 （或輔助底物即中間底 物）或產(chǎn)物量的變化，因此，可以選擇紫外吸收法或生色原顯色法； 能夠準(zhǔn)確地控制溫度、 pH 值和底物濃度等， 要求儀器具有恒溫 裝置及自動監(jiān)測功能，半自動及全自動生化分析儀都能滿足這些要求；測定結(jié)果常較定時法高4.固定化酶和游離酶的優(yōu)點和缺點： a固定化酶 優(yōu)點：增加了酶的活性和穩(wěn)定性可回收重復(fù)使用，降低了酶耗酶反應(yīng)過程便于控制適用于連續(xù)反應(yīng)易于反應(yīng)體系分離 對環(huán)境的

6、耐受性增強 缺點：對酶的物理化學(xué)性質(zhì)產(chǎn)生一定的影響。 b游離酶優(yōu)點：易溶于水于底物的作用面積大，反應(yīng)充分活性接近生理狀態(tài)缺點：難與底物分離反應(yīng)條件控制嚴(yán)格不能反復(fù)利用，易失活 三蛋白質(zhì)分析1. 蛋白質(zhì)的鹽析，變性及二者的區(qū)別 鹽析：在蛋白質(zhì)溶液中加入某些無機鹽的濃溶液，使蛋白質(zhì)的 溶解度下降而從溶液中析出來的現(xiàn)象。變性：在熱、重金屬、酸、堿、某些有機物等作用下，蛋白質(zhì)的物理性質(zhì)和生理功能發(fā)生改變的現(xiàn)象，稱為蛋白質(zhì)的變性。蛋白質(zhì)鹽析和變性的區(qū)別與對比2. 蛋白質(zhì)的序列分析：測得的是蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)。 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)：一級結(jié)構(gòu)：蛋白質(zhì)的氨基酸殘基的序列， 一級結(jié)構(gòu)的作用力：肽鍵， S-S鍵。二級結(jié)構(gòu)

7、： -螺旋， -折疊， -轉(zhuǎn)角，無規(guī)卷曲 二級結(jié)構(gòu)形成的力量：氫鍵超二級結(jié)構(gòu)：若干相鄰的二級結(jié)構(gòu)中的構(gòu)象單元彼此相互作用， 形成有規(guī)則的、在空間上能辨認(rèn)的二級結(jié)構(gòu)組合體是球狀蛋白質(zhì)的折疊單位， 在空間上彼此分隔， 各自具有部分生 物功能的結(jié)構(gòu)含 100200 個氨基酸殘基，1條長的多肽鏈?zhǔn)紫日郫B成幾個相對獨立的結(jié)構(gòu)域再締合成三級 結(jié)構(gòu)。三級結(jié)構(gòu)： 由若干二級結(jié)構(gòu)單位， 完全折疊后可組成一個完整的 蛋白質(zhì)分子，即為三級結(jié)構(gòu)，可具有活性。三級結(jié)構(gòu)形成的力量：氫鍵，離子鍵，疏水鍵， 雙硫鍵3. 蛋白質(zhì)分子量的測定方法： 十二烷基硫酸鈉 -聚丙烯酰胺凝膠電泳法 （SDS-PAGE法）和凝膠過濾層析法。

8、a十二烷基硫酸鈉 -聚丙烯酰胺凝膠色譜法：基本原理：SDS 可以破壞蛋白質(zhì)中的疏水鍵和氫鍵，并按一定比例（ 1g 蛋白質(zhì)結(jié)合 SDS）和蛋白質(zhì)組成復(fù)合物， 使蛋白質(zhì)帶的負(fù)電荷的量遠(yuǎn) 遠(yuǎn)超過其本身的電荷量，并與蛋白質(zhì)的分子量成正比。2-巰基乙醇破壞了蛋白質(zhì)二硫鍵，使蛋白質(zhì)呈橢圓棒形，其軸 長與分子量成正比。q/f q/6r，所有蛋白質(zhì)的遷移率都相同。b凝膠過濾層析法：原理：蛋白質(zhì)在凝膠過濾層析柱中的洗脫體積Ve，與其分子量的關(guān)系如下式所示：lg MrK1K2 Ve在實驗中，只要測得幾種蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)物的 Ve，并以它們 的 lg Mr 對 Ve 作圖得一直線，再測出樣品的 Ve，即可從圖中得到

9、樣 品的分子量。倆者的聯(lián)系與關(guān)系： 凝膠過濾法測得的是蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu) （如果它有 的話）的分子量；SDS-PAGE測得的是蛋白質(zhì)亞基的分子量；在有 2-巰基乙醇（或 DTT）存在時， SDS-PAGE可測得蛋白質(zhì)每 條多肽鏈的分子量。綜合應(yīng)用這兩種方法，可得到待測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的許多信息。SDS-PAGE與凝膠過濾法是互補的4. 兩種測定蛋白質(zhì)的方法：a凱氏定氮法：蛋白質(zhì) +硫酸 CO2+H2O+NH3 硫酸銨 +強堿氨 優(yōu)點：適用樣品廣泛，結(jié)果可靠 缺點：樣品中非蛋白態(tài)氨影響測定值； 蛋白質(zhì)氨基酸有偏差時 （大 量堿性氨基酸、酰胺、小分子量氨基酸）誤差較大；操作繁瑣。 b紫外光譜吸收法：原理：色

10、氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在 280 nm 附近。大多數(shù)蛋 白質(zhì)含有這兩種氨基酸殘基，在一定濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)的 A280 與 其濃度呈正比，據(jù)此可進行蛋白質(zhì)定量測定。是一種快速簡便分析溶液中蛋白質(zhì)含量的的方法。 計算方法：標(biāo)準(zhǔn)曲線法：蛋白質(zhì)濃度 (mg/ml)= ×× A260注意事項：石英比色杯調(diào)零所用溶液光密度范圍四抗原抗體，全抗原和半抗原的關(guān)系1. 抗原抗原是能夠引起免疫反應(yīng)的分子?？乖哂幸韵聝煞N特性： 免疫原性( immunogenicity )，即誘導(dǎo)刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體或者 激活淋巴細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答的能力， 具有這種特性的物質(zhì)稱為免疫原 (immunogen)

11、； 抗原性( antigenicity ) ，指能與相應(yīng)抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特 異性結(jié)合，引起免疫反應(yīng)的性能。全抗原：具有上述兩種特性的物質(zhì)稱為完全抗原。包括：蛋白質(zhì)，多糖，核酸，合成多肽，低分子物質(zhì)。 半抗原：不能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體，但能和適當(dāng)抗體起反應(yīng)，即有免疫反應(yīng) 性的簡單分子稱為半抗原。只具有抗原性。全抗原能引起機體的免疫反應(yīng)，半抗原不能引起機體的免疫反應(yīng)。2. 親和常數(shù)：免疫反應(yīng)： Ag+Ab Ag-Ab該免疫反應(yīng)遵循可逆生物大分子相互作用的熱動力學(xué)基本原理， 其反應(yīng)式為Ab -Agk1KAbAgk2K式中： Ab為游離的抗體結(jié)合位點的濃度； Ag為游離的抗原結(jié)合位 點的濃度；Ab-Ag

12、為抗原-抗體復(fù)合物的濃度； k1為正反應(yīng)速率常數(shù)； k2 為負(fù)反應(yīng)速率常數(shù)； K 為反應(yīng)平衡常數(shù)（親和常數(shù)） ?？乖涂贵w在體內(nèi)進行的反應(yīng)稱為免疫反應(yīng)， 在體外進行的反 應(yīng)稱為血清學(xué)反應(yīng)。3. 酶聯(lián)免疫分析法（ ELISA）。酶聯(lián)免疫吸附分析法 （ enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA） 原理 使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面； 抗原或抗體與某種酶聯(lián)結(jié)成酶標(biāo)抗原或抗體； 在測定時，使受檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相抗原 或固相抗體起反應(yīng)； 用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分 開，結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的

13、量成一定的比例； 加入酶反應(yīng)底物， 底物被酶催化為有色產(chǎn)物， 產(chǎn)物量與標(biāo)本中受檢 物的量相關(guān)，用分光光度法進行定量。酶聯(lián)免疫分析法的流程以檢測氯胺酮為例1 包被抗原 (10 和 5 g/m)L2 洗滌3 加入氯胺酮抗體和氯胺酮小分子4 洗滌5 加酶標(biāo)抗體 -HRP標(biāo)記羊抗兔 IgG6 洗滌7 加底物顯色、終止8 觀察結(jié)果4. 時間分辨熒光分析法TRFIA所用的標(biāo)記物是鑭系元素螯合物，利用這類熒光物質(zhì)熒 光壽命長及 Stokes位移大的特點， 通過波長和時間兩種分辨技術(shù)， 有 效排除了非特異本底熒光的干擾，具有靈敏度高，標(biāo)記物制備簡單， 穩(wěn)定性好，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍寬，操作方便的優(yōu)點。5.單克隆抗

14、體和多克隆抗體的比較：6.設(shè)計合適的方案檢測生活中的小分子有機物。五 ，核酸（ DNA 和 RNA）1. DNA 是雙螺旋結(jié)構(gòu)， RNA是單鏈的！DNA:ATGCRNA: AUGC2. PCR的意義和簡單操作流程意義： PCR（ Polymerase chain reaction） 是用一對寡聚 DNA 作 為引物，通過加溫變性退火 DNA 合成這一周期的多次循環(huán)， 使目的 DNA 片段得到擴增。由于這種擴增產(chǎn)物是以指數(shù)形式積累 的，經(jīng) 2530 個循環(huán)后，擴增倍數(shù)可達(dá) 106.流程： （一）原理雙鏈 DNA 通過高溫變性解離成互補單鏈 DNA 變性 與一對寡核苷酸引物（ 5'， 3&

15、#39;）降低溫度退火DNA 加熱變性 +引物慢慢冷卻使其結(jié)合，形象地稱為退火適溫延伸 5'3/'引物形成新鏈變成 4條鏈 DNA 延伸第二輪：變性 退火 延伸呈指數(shù)增長理論值：一輪一倍10 輪 103=1000 倍20 輪 10630 輪 109理論 模板擴增 30 輪1ng1g實際 模板擴增 30 輪1ng10g 模板 DNA 經(jīng)加熱至 93左右一定時間后，使模板 DNA雙鏈或 經(jīng) PCR擴增形成的雙鏈 DNA 解離，使之成為單鏈，以便它與引物 結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備； 模板 DNA 經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至 55左右，引物與模 板 DNA 單鏈的互補序列配對結(jié)合； D

16、NA 模板-引物結(jié)合物在 TaqDNA聚合酶的作用下，以 dNTP為 反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成 一條新的與模板 DNA 鏈.每完成一個循環(huán)需 24分鐘， 23 小時就能將待擴目的基因擴 增放大幾百萬倍 .3. DNA 測序的倆種方法基本原理：a sanger 雙脫氧鏈終止法：引入了雙脫氧核苷三磷酸( 2' ,3' -ddNTP)作為鏈終止劑； 2',3'-ddNTP與普通的 dNTP不同之處在于前者的脫氧核糖的 3'位 又少了個羥基。 它可以在 DNA 聚合酶的作用下和多核苷酸鏈的 3'羥 基形成磷酸二酯鍵， 但卻

17、不能再與下一個核苷酸縮合， 結(jié)果使得多核 苷酸鏈的延伸終止；在 DNA 的合成反應(yīng)中，除了加入 4 種正常的 dNTP外，再加入一 種少量的 ddNTP，反應(yīng)產(chǎn)物是一系列的長短不一的核苷酸鏈。 在 4 組 獨立的 DNA合成反應(yīng)中，分別加入 4 種不同的 ddNTP，結(jié)果將生成 4 組核苷酸鏈，它們將分別終止于每一個 A，每一個 G，每一個 C，每 一個 T的位置上。對這 4 組核苷酸鏈進行聚丙烯酰胺凝膠電泳， 就可 讀出序列 .b Gillbert 化學(xué)裂解法：將 DNA 片段的 5端磷酸基作放射性標(biāo)記， 再分別采用不同的化 學(xué)方法修飾和裂解特定堿基，從而產(chǎn)生一系列長度不一而 5'

18、端被標(biāo) 記的 DNA 片段，這些以特定堿基結(jié)尾的片段群通過凝膠電泳分離， 再經(jīng)放射線自顯影，確定各片段末端堿基，從而得出目的 DNA 的堿 基序列.4. 分子印記的原理和流程：（一） Southern Blot原理：將待檢測的 DNA分子用 /不用限制性內(nèi)切酶消化后， 通 過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，繼而將其變性并按其在凝膠中的位 置轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，固定后再與同位素或其它 標(biāo)記物標(biāo)記的 DNA或 RNA探針進行反應(yīng)。 如果待檢物中含有與探針互補的序列，則二者通過堿基互補的原理進行結(jié)合，游離探針洗滌后用自顯影或其它合適的技術(shù)進行檢測，從而顯示出待檢的 片段及其相對大小 .DNA 瓊

19、脂糖電泳 印跡轉(zhuǎn)移 預(yù)雜交雜交（變性探針） 洗膜 放射自顯影或顯色 用途：檢測樣品中的 DNA 及其含量，了解基因的狀態(tài) , 如是 否有點突變、擴增重排等 .（二） Northern Blot原理：在變性條件下將待檢的 RNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳， 繼而按照同 Southern Blot 相同的原理進行轉(zhuǎn)膜和用探針進行雜交檢 測.操作過程mRNA 提取 甲醛變性電泳 印跡轉(zhuǎn)移預(yù)雜交 雜交（變性探針） 洗膜 放射自顯影或化學(xué) 發(fā)光。用途：檢測樣品中是否含有基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 （ mRNA）及其含量。六 生物大分子。1. 倆種分離純化蛋白質(zhì)的方法：a。反向高效液相色譜 蛋白質(zhì)分子中既有親水性基團（

20、-OH，-NH、-COOH、SH 等）， 也有疏水性基團（如苯環(huán)、 -CH3、-CH2和-CH等） . 不同的蛋白質(zhì)在相同流動相中由于疏水基團多少、種類以及表 面分布情況不同，與填料的親合力也不同，從而得到分離 . 結(jié)果：疏水性強的蛋白質(zhì)親合力大 ,出峰遲 ; 疏水性小的蛋白質(zhì) 就容易被洗脫 .其分離蛋白質(zhì)和酶等生物大分子具有速度快、分離性能好，重復(fù) 性好，溶劑和流動相易除去等優(yōu)點 . 在所有的液相色譜法中反相 色譜的分離性能 .缺點是很多蛋白質(zhì)或酶在分離過程中失活， 而且回收的樣 品中總含有有機溶劑 .b凝膠過濾層析亦稱凝膠色譜、排阻色譜或分子篩，是利用凝膠 把分子大小不同的物質(zhì)分離開的一種方法 .其機理是分子篩效應(yīng)。在洗脫過程中，大分子不能進入凝膠 內(nèi)部，而沿凝膠顆粒間的空隙最先流出柱外；而小分子可以進入 凝膠顆粒內(nèi)部的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，路徑長、流速慢，以至最后流出 柱外。因此，混合樣品如同“過篩”一樣，因分子大小的不同得 以彼此分開 .它具有分離條件溫和，產(chǎn)品收