紅豆杉組織培養(yǎng)物的成分分析及云南紅豆杉甲素的微生物轉(zhuǎn)化研究（可編輯）

1、 北京中醫(yī)藥大學(xué)碩士學(xué)位論文紅豆杉組織培養(yǎng)物的成分分析及云南紅豆杉甲素的微生物轉(zhuǎn)化研究姓名:賈紅婷申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別:碩士專業(yè):中藥學(xué)指導(dǎo)教師:閻玉凝20060501摘要摘 要紫杉醇是具有較強(qiáng)抗癌活性的紫杉烷類二萜化合物,主要存在于資源有限、生長(zhǎng)緩慢的紅豆杉屬植物的樹皮中,而且含量很低,因而造成了紫杉醇的藥源危機(jī)。通過(guò)紅豆杉植物細(xì)胞培養(yǎng)與微生物轉(zhuǎn)化進(jìn)而產(chǎn)生紫杉醇及其衍生物是解決這個(gè)問(wèn)題的可行途徑之一。從紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)物中分離得到的大多數(shù)成分與天然紅豆杉的化學(xué)成分相同或相似,證明了離體培養(yǎng)的細(xì)胞具有合成與天然植物一樣的化合物的“全能性”。進(jìn)行紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng),不僅可以得到紫杉醇及其類似物,而且還有可能得

2、到一些新的紫杉烷類化合物,另外還可以進(jìn)一步明確紫杉醇等化合物生物合成途徑,為今后采用基因工程手段來(lái)調(diào)控此類化合物的合成打下基礎(chǔ)。微生物轉(zhuǎn)化是利用微生物代謝過(guò)程中產(chǎn)生的酶對(duì)外源物質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾和改造的催化反應(yīng)。與化學(xué)催化劑相比,微生物轉(zhuǎn)化具備選擇性高、條件溫和、相對(duì)成本低、副產(chǎn)物少、不污染環(huán)境等優(yōu)勢(shì)。利用微生物轉(zhuǎn)化對(duì)天然產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾,可得到結(jié)構(gòu)新穎、療效更強(qiáng)的先導(dǎo)化合物,或得到有應(yīng)用價(jià)值的中間體,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。如上所述,本論文對(duì)紅豆杉愈傷組織培養(yǎng)物的化學(xué)成分進(jìn)行了分離與鑒定。共得到十個(gè)單體化合物,均為類一即.位有含氧取代基團(tuán)的紫杉烷類化合物。經(jīng).、”.、.、.、等光譜技術(shù)鑒定這十個(gè)化合物為

3、:,一?,;,旺,?,;,一?,;,?,;旺,一一,;一,:另外四個(gè)為新化合物,?一,一一?,?;,?一?一,:以及一對(duì)異構(gòu)體和:,?一。一,將從組織培養(yǎng)物中分離得到的云南紅豆杉甲素作為底物,利用株微生物對(duì)其進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化試驗(yàn),結(jié)果表明,其中五個(gè)菌株對(duì)有明顯轉(zhuǎn)化反應(yīng),從中選出反應(yīng)最明顯的“方”號(hào)菌株進(jìn)行放大生物轉(zhuǎn)化,得到了選擇性水解轉(zhuǎn)化產(chǎn)物一 .。關(guān)鍵詞:云南紅豆杉甲素;組織培養(yǎng);微生物轉(zhuǎn)化;紫杉烷類化合物北京中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文, ,. , .,. .,. . ., ., ? , ,. .一,. ,一?,;,一.一,;,一?一,.;一值,一:,?一,一;一,?,; :?,一一,?:,

4、一一?,; :瑾,?,?., , ., , ., ;: ; ;獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知,除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外,論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過(guò)的研究成果,也不包含為獲得北京中醫(yī)藥大學(xué)或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過(guò)的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示了謝意。簽名:彰蝗 日期:生:竺蘭:竺關(guān)于論文使用授權(quán)的說(shuō)明本人完全了解北京中醫(yī)藥大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定,即:學(xué)校有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件,允許論文被查閱和借閱;學(xué)?？梢怨颊撐牡娜炕虿糠謨?nèi)容,也可以采用影印、

5、縮印或其他復(fù)制手段保存論文。保密的論文在解密后應(yīng)遵守此規(guī)定簽名: 導(dǎo)師簽名:閨墨數(shù)曰期:.旦:堅(jiān)原創(chuàng)性及知識(shí)產(chǎn)權(quán)聲明本碩士論文涉及的課題,從構(gòu)思、設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)、資料整理及論文撰寫均在導(dǎo)師指導(dǎo)下完成。本論文中涉及的資料、結(jié)果等知識(shí)產(chǎn)權(quán)歸屬中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)藥物研究所所有。在本論文發(fā)表以前,知悉者負(fù)有保密義務(wù),任何單位及個(gè)人不得引用、復(fù)制或發(fā)表本論文之內(nèi)容,更不得用于申報(bào)專利或成果。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中曾得到許多同志的指導(dǎo)、幫助和支持,本人均已在論文中提出并致感謝。本論文中所有數(shù)據(jù)均來(lái)自原始實(shí)驗(yàn)記錄,引用資料均以注明,任何數(shù)據(jù)決無(wú)剽竊、篡改、及抄襲之行為。如在本論文的原創(chuàng)性方面出現(xiàn)問(wèn)題,我愿負(fù)法律責(zé)任。特此聲明

6、,以此為據(jù)。也礎(chǔ),頤越也導(dǎo),秕亞 .一鋤銜、挈疑飄鹋蒙彀西案第一章文獻(xiàn)綜述:紫杉醇及其衍生物的研究概況與發(fā)展趨勢(shì)第一章 文獻(xiàn)綜述紫杉醇及其衍生物的研究概況與發(fā)展趨勢(shì)紫杉醇,商品名.結(jié)構(gòu)式見(jiàn) .是紅豆杉中特有的一種二萜類化合物,等人年首次從北美短葉紅豆杉,口.樹皮中分離獲得,為白色結(jié)晶粉末、不溶于水,易溶于氯仿、丙酮等有機(jī)溶劑,是治療轉(zhuǎn)移性卵巢癌和乳腺癌的最好藥物之一。然而,由于紅豆杉已在全球處于瀕臨滅絕狀態(tài),其植株生長(zhǎng)緩慢,自身的紫杉醇含量又非常低微,靠直接砍伐紅豆杉、從其樹皮和枝干中提取紫杉醇的途徑根本不能滿足臨床需求。. 為此,科學(xué)家們開(kāi)展了對(duì)紫杉醇及其衍生物一紫杉烷類化合物資源的研究,并

7、取得了一定進(jìn)展。一方面,對(duì)紅豆杉屬植物進(jìn)行植物學(xué)與細(xì)胞工程學(xué)的研究,如扦插栽培、雜交育種、組織培養(yǎng)及內(nèi)寄生真菌的培養(yǎng)等;另一方面,從紅豆杉屬植物及上述植物資源的化學(xué)成分入手,分離純化各種紫杉烷類化合物,直接進(jìn)行藥理活性篩選,或選擇具有特征結(jié)構(gòu)或含量較高的紫杉烷類化合物進(jìn)行化學(xué)半合成,從而得到紫杉醇或比它易溶于水、高效低毒的活性成分;另外還進(jìn)行了紫杉醇的全合成,雖然已獲成功,但全合成路線復(fù)雜,成本昂貴,目前的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值不大。以下將對(duì)紫杉醇的生物活性、生物資源、化學(xué)合成、細(xì)胞培養(yǎng)、微生物轉(zhuǎn)化以及生物合成路徑等方面的研究概況進(jìn)行闡述。.紫杉醇及其衍生物的生物活性紫杉醇是一種高效細(xì)胞毒素,具有獨(dú)特的

8、抗癌機(jī)理。紫杉醇能與微量蛋白結(jié)合,促北京中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文進(jìn)其聚合,并抑制其解聚,從而抑制癌細(xì)胞的有絲分裂,有效阻止癌細(xì)胞的增殖孔。紫杉醇表現(xiàn)出廣譜而高效的抗癌活性,對(duì)人的卵巢癌、乳腺癌、宮頸癌、肺癌、癌、黑色素瘤、肝癌和自血病細(xì)胞系等有細(xì)胞毒作用。其抗癌活性高于噻唑呋啉、順鉑、依托泊甙、阿霉素和氟尿嘧啶等常用抗癌藥物。目前已發(fā)現(xiàn)其他一些天然來(lái)源的紫杉烷類化合物也表現(xiàn)出一定的生物活性。許多學(xué).者發(fā)現(xiàn)某些紫杉烷類化合物能夠逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性. 、。例如從東北紅豆杉丁. .樹皮中分離得到、及類紫杉醇化合物、等,它們多數(shù)都能促使具有多藥抗性的長(zhǎng)春新堿在多藥耐藥人乳腺癌細(xì)胞株內(nèi)聚集,增

9、強(qiáng)耐藥細(xì)胞多藥物的敏感性【】。由南方紅豆杉丁. .中分得的、 具有抗肝癌細(xì)胞活性【。從云南紅豆杉.、 、.中分得的/、都具有一定的抗胂瘤活性;另外,. .在體外具有抗、和活性嗍。具有抑制從西藏紅豆杉 .中分離出的.不但具有抑制細(xì)細(xì)胞增殖活性,.、和.胞增殖活性,同時(shí)還具有體內(nèi)抑制白血病細(xì)胞活性。意大利學(xué)者以來(lái)源于西藏紅豆杉的紫杉烷類化合物.為原料合成了一系列抗多藥耐藥腫瘤的衍生物,其中的.已完成臨床前藥理研究,結(jié)果表明它能克服因過(guò)度表達(dá)或其它機(jī)制微管蛋白及凋亡調(diào)控蛋白表達(dá)改變而引起的腫瘤多藥耐藥,對(duì)紫杉醇等多種化療耐藥的、荷人癌裸鼠有效。由于其低毒,耐受性強(qiáng)于紫杉醇與紫杉醇的最大耐受量分別為和

10、/,而且其水溶性也較紫杉醇好,可以口服,是一個(gè)很有價(jià)值的抗腫瘤候選藥物【“。弋。. 第一章文獻(xiàn)綜述:紫衫醇及其衍生物的研究概況與發(fā)展趨勢(shì).紫杉醇及其衍生物的生物資源紅豆杉科共有屬種植物,除澳洲紅豆杉屬生長(zhǎng)在南半球,其余均產(chǎn)自北半球。紅豆杉為紅豆杉科紅豆杉屬植物,約有個(gè)種及幾個(gè)變種曲.,我國(guó)有種及個(gè)變種,中國(guó)紅豆杉婦.,西藏紅豆杉 .,云南紅豆杉東北紅豆杉.和南方紅豆杉美麗紅豆杉. .婦. .。研究表明,這些紅豆杉都含有紫杉醇。.紫杉醇及紫杉烷類化合物的化學(xué)合成由于紫杉醇的資源有限,而且自身水溶性差,不良反應(yīng)嚴(yán)重等缺點(diǎn),有機(jī)合成已成為擴(kuò)大其資源,同時(shí)尋找更加高效低毒的類紫杉醇化合物的重要手段。年

11、,和小組研究并報(bào)道了紫杉醇的全合成【?！?后來(lái)又有不少研究涉及到了紫杉醇的全合成,但是目前的情況是全合成路線復(fù)雜,成本昂貴,尚無(wú)實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。相對(duì)于紫杉酵的全合成,紫杉醇的半合成,更有實(shí)際意義。紫杉醇的半合成主要是將紅豆杉植物中的紫杉烷類成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造,得到紫杉醇或具有生物活性的紫杉醇衍生物。為中間體的紫杉醇的半合成.詳細(xì)敘較為成功的是以述。一廣泛存在于多種紅豆杉屬植物中,具有紫杉烷的母核結(jié)構(gòu)。雖然其活性低于紫杉醇,但它在針葉中的含量相對(duì)較高。針葉的數(shù)量大且可以再生,所作為紫杉醇半合成的前體是非常適宜的。年,以,以半合成得到紫杉醇,總產(chǎn)率達(dá)%?。等成功地從一又。八。耐匆.通過(guò)有機(jī)合成,還可以

12、得到其他有活性的紫杉醇衍生物。紫杉特爾就為前體是一個(gè)成功的范例結(jié)構(gòu)式見(jiàn) .。研究人員以通過(guò)半合成得到了。該化合物具有良好的生物利用度和水溶性,毒副作用低,是迄今為止唯一可與紫杉醇媲美的紫杉烷類抗腫瘤藥物。紫杉醇的抗癌機(jī)北京中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文理是:能與微量蛋白結(jié)合,并促進(jìn)其聚合,抑制癌細(xì)胞的有絲分裂,有效阻止癌細(xì)胞的增殖。研究結(jié)果表明,在相當(dāng)毒性劑量下的抗腫瘤作用為紫杉醇的兩倍,其作用機(jī)理與紫杉醇完全一樣。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明,對(duì)所有實(shí)驗(yàn)過(guò)的移植腫瘤的毒性均高于紫杉醇。.紅豆杉科紅豆杉屬植物資源拉丁學(xué)名 英文名 中文學(xué)名歐洲紅豆杉; ;. 短葉紅豆杉; ;缸 加拿大紅豆杉中國(guó)紅豆杉?.

13、.東北紅豆杉. 云南紅豆杉. 佛羅里達(dá)紅豆杉. 蘇門答臘紅豆杉.加 . 西藏紅豆杉. 墨西哥紅豆杉.雜種紅豆杉. . . 南方紅豆杉. 俗名:美麗紅豆杉. . ?在我國(guó)境內(nèi)有分布第一章文獻(xiàn)綜述:紫杉醇及其衍生物的研究概況與發(fā)展趨勢(shì).細(xì)胞培養(yǎng)法生產(chǎn)紫衫醇目前解決紫杉醇資源短缺的途徑主要有化學(xué)合成,人工栽培,真菌發(fā)酵生產(chǎn)等。由于目前化學(xué)合成大多只能從紫杉烷類物質(zhì)合成,而紫杉烷類物質(zhì)在紅豆杉中含量同樣很低,成本昂貴。如果人工栽培,至少需要年以上樹齡的的紅豆杉才能提取紫杉醇,周期長(zhǎng),成本也比較高。為此.國(guó)內(nèi)外學(xué)者把目標(biāo)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)這一領(lǐng)域,并做了大量的研究。細(xì)胞培養(yǎng)法生產(chǎn)紫杉醇就是對(duì)離體的紅豆杉組織

14、細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),從而生產(chǎn)紫杉醇及其衍生物。在理想情況下該方法能夠連續(xù)均勻生產(chǎn),受外界條件影響不大,無(wú)污染,而且可以在生物反應(yīng)器中大規(guī)模培養(yǎng),易于提高產(chǎn)量和進(jìn)行產(chǎn)物的分離提取純化,是進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)的首選方法。在細(xì)胞培養(yǎng)方面,從年掣獲得紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)的第一個(gè)專利以來(lái),已經(jīng)有多種紅豆杉植物建立了細(xì)胞懸浮培養(yǎng)系統(tǒng),培養(yǎng)技術(shù)也取得了很大的進(jìn)展】。、她鼬舢 隨舭舭 觚觚 舢觚 觚犯夠舢 : 七,一,一一 弼 四 歸颶缸一一一觚觚一.美國(guó)農(nóng)業(yè)部于年批準(zhǔn)了羊等用細(xì)胞培養(yǎng)法生產(chǎn)紫杉醇及其類韭塞生匿塹查蘭塑主塹塞生蘭垡堡塞?似物的專利。目前,美國(guó)和加拿大處于領(lǐng)先地位,我國(guó)也有數(shù)家研究所和大學(xué)從事該方向的研究。近幾年

15、,這一領(lǐng)域作過(guò)許多工作,已研究了 旭胡, , 細(xì),等多個(gè)種的植物,用于培養(yǎng)的植物組織有果實(shí)、幼嫩莖葉的愈傷組織、胚乳及接合子胚胎等。關(guān)于基質(zhì)添加物也進(jìn)行了廣泛的研究,并發(fā)表了若干專利,結(jié)果表明,基質(zhì)中加入糖或椰汁可提高紫杉醇的產(chǎn)量。中科院昆明植物研究所利用反應(yīng)器生產(chǎn)紫杉醇,含量達(dá)到.%。紫杉細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模已達(dá),呈現(xiàn)實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的可能性。等已目前已通過(guò)組織培養(yǎng)的方法成功獲得了紫杉醇、知的紫杉烷類化合物,一些新的紫杉烷類化合物也被發(fā)現(xiàn),其中已獲得專利的新型紫杉烷類成分最有代表性”。,和是中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所的研究人員首先從紅豆杉植物愈傷組織培養(yǎng)物中分離得到一類新的紫杉烷類化合物.、。雖然該類化

16、合物尚未發(fā)現(xiàn)具有明顯的生理活性,但是由于其具有與紫杉醇類似的基本母核結(jié)構(gòu),而且含量明顯高于其它的紫杉烷類化合物,所以可望通過(guò)結(jié)構(gòu)改造合成紫為底物利用化學(xué)杉醇或其它具有藥理活性的紫杉烷類化合物。如等的方法進(jìn)行合成,得到了中間體,為合成紫杉醇或其類似物提供了個(gè).。很好的前體物【.,?到目前為止,從紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)物中至少已鑒定到種以上的化學(xué)成分,其中絕大多數(shù)與天然紅豆杉的化學(xué)成分相同或相似,證明了離體培養(yǎng)的細(xì)胞具有合成與天然植物一樣的化合物的“全能性”。有些為新結(jié)構(gòu)的化學(xué)成分。進(jìn)行紅豆杉培養(yǎng)細(xì)胞中化學(xué)成分的研究,不僅可以從中篩選到一些抗癌活性與紫杉醇相似,但毒副作用更低、來(lái)源更豐富的化合物,同時(shí)可深

17、入進(jìn)行對(duì)紫杉醇等化合物生物合成途徑的探討,為最終通過(guò)基因工程手段來(lái)調(diào)控化合物的合成打下基礎(chǔ)。.紫杉烷類化合物的生物轉(zhuǎn)化生物轉(zhuǎn)化是指利用生物體系以及它們所產(chǎn)生的酶對(duì)外源化合進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾而獲得有價(jià)值產(chǎn)物的生理生化物 ,反應(yīng),其本質(zhì)是利用生物體系本身所產(chǎn)生的酶對(duì)外源化合物進(jìn)行酶促催化反應(yīng)。藥用化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)往往比較復(fù)雜,分子中通常有多個(gè)手性中。,采用化學(xué)方法對(duì)第一章文獻(xiàn)綜述:紫杉醇及其衍生物的研究概況與發(fā)展趨勢(shì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造有時(shí)會(huì)遇到各種困難,如選擇性、得率等問(wèn)題。而生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)則具有選擇性強(qiáng)、高效率等特點(diǎn),尤其是易于發(fā)生特異性羥基化反應(yīng),從而得到具有新穎取代方式的天然衍生物,與有機(jī)合成結(jié)合,可獲得

18、多種衍生物,為新藥的研究與開(kāi)發(fā)提供先導(dǎo)化合物。.利用植物細(xì)胞對(duì)紫杉烷類化合物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞內(nèi)含有催化酯化、氧化、還原、羧基化、異構(gòu)化、甲基化、環(huán)氧化、糖基化以及去甲基化等反應(yīng)的酶類,可對(duì)天然產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化。植物細(xì)胞的生物轉(zhuǎn)化可達(dá)到三個(gè)目的:解決天然藥物的來(lái)源問(wèn)題,把量大的化合物轉(zhuǎn)化為稀缺的、更有價(jià)值的化合物。對(duì)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾以滿足藥學(xué)方面的要求。探索植物次級(jí)代謝產(chǎn)物的。生物合成途徑【帕等利用植物銀杏、長(zhǎng)春花、桔梗細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物對(duì)/系列化合物進(jìn)行了生物轉(zhuǎn)化研究,得到了大量具有立體選擇性的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物,不僅提供了大量可供活性篩選的先導(dǎo)化合物,為紫杉醇的半合成提供前體,同時(shí)為最終闡明紫杉醇生物合

19、成路徑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。.紫杉烷類化合物的微生物轉(zhuǎn)化研究微生物轉(zhuǎn)化 是利用微生物代謝過(guò)程中產(chǎn)生的酶對(duì)外源物質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾和改造的催化反應(yīng)。與化學(xué)催化劑相比,生物催化劑專一性更強(qiáng)、催化活性更高、條件溫和更易控制,可接受大量的外源復(fù)雜分子作為底物,化學(xué)選擇性、區(qū)域選擇性、立體選擇性或?qū)τ尺x擇性地催化底物生成相應(yīng)的產(chǎn)物。相對(duì)成本低,副產(chǎn)物少,不污染環(huán)境,可以進(jìn)行有機(jī)合成所不能或很難形成的化學(xué)反應(yīng)【。生物轉(zhuǎn)化是一項(xiàng)相對(duì)“綠色”的技術(shù)。酶促反應(yīng)能在水相、室溫和中性進(jìn)行,無(wú)需高壓和極端條件,因此節(jié)省了過(guò)程的能源。用微生物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化在某些情況下比利用植物細(xì)胞進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化有優(yōu)勢(shì)。高等植物細(xì)胞增殖速度較慢,而微生

20、物繁殖和初級(jí)代謝迅速,體內(nèi)酶體系相對(duì)簡(jiǎn)單。在極端環(huán)境下生存的微生物能提供一些在非常反應(yīng)條件下發(fā)揮作用的酶【”。美國(guó)施貴寶公司等利用微生物轉(zhuǎn)化進(jìn)行紫杉醇的半合成,他們從白色類、諾卡氏菌 、黃色類諾卡氏菌、莫拉氏菌 .三種微生物的發(fā)酵液中分離出一 、. ,分別將紅豆杉中的幾種紫杉烷, 等的、及位進(jìn)行水解,得,.到較多而單一的.,該產(chǎn)物為紫杉醇合成的前體。再利用化學(xué)反應(yīng),.。連接上位的側(cè)鏈,即可得到紫杉醇“”北京中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文,%.%. 利用微生物轉(zhuǎn)化進(jìn)行紫杉醇的半合成第一章文獻(xiàn)綜述;紫杉酵及其衍生物的研究概況與發(fā)展趨勢(shì)紫杉醇的生物合成途徑為了進(jìn)一步對(duì)紫杉醇的生產(chǎn)進(jìn)行調(diào)控,闡明紫杉醇的

21、生物合成路徑是十分必要的。紫杉醇及其位側(cè)鏈的生物合成途徑可以分為三個(gè)主要的生物合成步驟:.紫杉環(huán)系統(tǒng)的生物合成:.側(cè)鏈的生物合成;.紫杉環(huán)系統(tǒng)和側(cè)鏈的酯化反應(yīng),形成完整的紫杉烷.。分子。其可能的生物合成途徑見(jiàn)天然紫杉烷類化合物的研究進(jìn)展獨(dú)特而顯著的藥理活性促使人們對(duì)紫杉醇進(jìn)行廣泛研究,然而其發(fā)展受到了自身水溶性差./的限制。臨床上應(yīng)用的紫杉醇是溶于含有 聚乙氧基蓖麻油的乙醇中。這種賦形劑增加紫杉醇溶解性的同時(shí),也引起了一系列的副作用。由此,人們對(duì)本屬不同種紅豆杉進(jìn)行了大量的研究,許多新的紫杉烷類化合物被發(fā)現(xiàn)口”。這些研究的目的是希望從中找到新的紫杉醇類似物,了解紫杉醇的生物合成機(jī)制,進(jìn)一步開(kāi)發(fā)

22、紫杉醇的藥源或改善生物活性。等從中國(guó)紅豆杉.和云南紅豆杉的地上部分分離得到十二個(gè)紫杉烷類化合物,并且對(duì)它們進(jìn)行了細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)。結(jié)果表明,它們對(duì)多藥耐藥腫瘤細(xì)胞,.及肺腫瘤細(xì)胞都有不同程度的細(xì)胞毒性【。等從臺(tái)灣特有的紅豆杉的枝葉中先后分離得到了十個(gè)新的紫杉烷類衍生物。其中一個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)是罕見(jiàn)的一,雙重排紫杉烷類化合物,被認(rèn)為是該種植物的特征成分【。展望綜上所述,相信隨著對(duì)紫杉類化合物研究的不斷深入和經(jīng)驗(yàn)的積累以及新的生物技術(shù)的應(yīng)用,對(duì)紫杉類化合物在生物體內(nèi)的生物合成會(huì)有更多得了解,將有更多高效低毒的新型紫杉烷類物上市并進(jìn)入臨床應(yīng)用造福人類。北京中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 .第二章實(shí)驗(yàn)部分:紅

23、豆杉組織培養(yǎng)物中化學(xué)成分的提取與分離第二章實(shí)驗(yàn)部分.紅豆杉組織培養(yǎng)物中化學(xué)成分的提取與分離.前言不少來(lái)源于植物的藥物,雖然可以實(shí)現(xiàn)化學(xué)全合成,但有些化合物由于其合成路線非常繁瑣,成本過(guò)高或收率太低而無(wú)法實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn);有些化合物則由于其結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜而無(wú)法實(shí)現(xiàn)用化學(xué)方法合成。所以,這些藥物仍需要依賴生物來(lái)源,由此引發(fā)的資源爭(zhēng)奪而造成生態(tài)破壞,影響深遠(yuǎn)。由于紫杉醇的稀缺,紅豆杉的野生資源慘遭破壞,因此,紅豆杉的資源保護(hù)和可持續(xù)發(fā)展已成為首要考慮的問(wèn)題,在各種解決方案中,生物技術(shù)方法,特別是細(xì)胞培養(yǎng)方法具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),其研究也已經(jīng)達(dá)到了一定的深度和廣度,表現(xiàn)出極大的潛力。該方法能夠連續(xù)均勻生產(chǎn),受外

24、界條件影響不大,無(wú)污染,而且可以在生物反應(yīng)器中大規(guī)模培養(yǎng),易于提高產(chǎn)量和進(jìn)行產(chǎn)物的分離提取純化,是進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)的首選方法。從年等.獲得紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)的第一個(gè)專利以來(lái),已經(jīng)有多種紅豆杉植物建立了細(xì)胞懸浮培養(yǎng)系統(tǒng),培養(yǎng)技術(shù)也取得了很大的進(jìn)展【】。從紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)物中分離得到的化學(xué)成分,絕大多數(shù)與天然紅豆杉的化學(xué)成分相同或相似,證明了離體培養(yǎng)的細(xì)胞具有合成與天然植物一樣的化合物的“全能性”。進(jìn)行紅豆杉培養(yǎng)細(xì)胞中化學(xué)成分的研究,不僅可以從中篩選到一些抗癌活性與紫杉醇相似,但毒副作用更低、來(lái)源更豐富的化合物,同時(shí)可深入進(jìn)行對(duì)紫杉醇等化合物生物合成途徑的探討,為最終通過(guò)基因工程手段來(lái)調(diào)控化合物的合成打下

25、基礎(chǔ)。,是首先從紅豆杉植物愈傷組織培養(yǎng)物中分離得到一類新的紫杉烷類化合物,其結(jié)構(gòu)新穎,雖然該類化合物尚未發(fā)現(xiàn)具有明顯的生理活性,但是由于其具有與紫杉醇類似的基本母核結(jié)構(gòu),而且含量明顯高于其它的紫杉烷類化合物,具有改造成為新抗癌藥物的可能性。目前由紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇還存在兩個(gè)重要問(wèn)題尚需解決:一是獲得高紫杉醇含量的紅豆杉細(xì)胞系;二是能夠得到在大規(guī)模生物反應(yīng)器中具有良好的耐受性和高生長(zhǎng)速度的紅豆杉細(xì)胞系。目前解決這兩方面的問(wèn)題主要寄希望于通過(guò)對(duì)紫杉醇生物合成過(guò)程的充分了解和利用現(xiàn)代基因工程方法來(lái)對(duì)紅豆杉從基因水平上進(jìn)行改造,并且發(fā)展更好的細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法”。本論文所研究的紅豆杉愈傷組織

26、培養(yǎng)物為.號(hào)細(xì)胞系。以前的提取方法是用乙,醚進(jìn)行索氏提取,得到的成分主要是,和煳,用作有機(jī)合成前體或生物轉(zhuǎn)化的底物。但我們通過(guò)等手段在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn),乙醚提取過(guò)的殘?jiān)儆靡掖?提取,提取液中尚存在其它少量的紫杉烷類化合物,限于培養(yǎng)的規(guī)模不大,不能鑒定出這些化合物的結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)的目的是提取并分離得到北京中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文擴(kuò)大規(guī)模培養(yǎng)的紅豆杉愈傷組織中的微量成分。結(jié)果共得到十個(gè)單體化合物,除上述,和之外,還得到其它六個(gè)化合物,其中四個(gè)為新化合物。.實(shí)驗(yàn)材料.儀器與材料紅豆杉組織培養(yǎng)物為中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所生物合成室培養(yǎng)的.號(hào)細(xì)胞系:一型高效液相色譜儀,.型檢測(cè)器,色譜柱為.,.;美國(guó)

27、公司核磁共振譜儀:.內(nèi)標(biāo):美國(guó)尼高力公司傅立葉變換紅外光譜儀:壓片;旋光儀:質(zhì)譜儀美國(guó)公司;?上海愛(ài)朗儀器有限公司 .型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。.藥品與試劑核磁試劑:氘代氯仿北京化工廠;高效液相試劑正相:正己烷、乙酸乙酯、丙酮分析純,北京化工廠:其他:石油醚、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、氯仿、正丁醇分析純,北京化工廠柱層析和薄層硅膠等均系青島海洋化工廠生產(chǎn);薄層色譜硅膠預(yù)制板為煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所生產(chǎn);薄層層析檢測(cè)用%/溶液顯色或紫外顯色。.提取與分離本實(shí)驗(yàn)對(duì)紅豆杉愈傷組織進(jìn)行提取與分離,利用硅膠柱層析和高效液相色譜法進(jìn)行化合物的分離,純化,共得到個(gè)單體化合物。取.號(hào)紅豆杉細(xì)胞系培養(yǎng)物,在下烘干,粉碎后,采用乙

28、醚進(jìn)行索氏提取,小時(shí),至提取液基本無(wú)色,得到乙醚部分浸膏左右,其主要成分為, ,和,用作有機(jī)合成前體或生物轉(zhuǎn)化的底物備用。再將乙醚提取后的殘?jiān)?乙醇冷浸提取一個(gè)月,將提取液減壓濃縮,得到總的浸膏量為左右。加水懸浮后,以乙酸乙酯萃取,得到乙酸乙酯部分浸膏。如圖.上述乙酸乙酯部分以丙酮溶解,用兩倍量.目硅膠拌樣,以三十倍于樣品量的柱層析硅膠.目進(jìn)行柱層析分離,以石油醚一丙酮系統(tǒng)梯度洗脫,共得到四部分:?:.; :.; ?:.;一:.如圖第二章實(shí)驗(yàn)部分:紅豆杉組織培養(yǎng)物中化學(xué)成分的提取與分離.。號(hào)紅豆杉細(xì)胞系培養(yǎng)物上,烘干干燥培養(yǎng)物上乙醚,索氏提取,小時(shí)殘?jiān)颐巡糠纸嗌?乙醇冷浸一個(gè)月山柱層析、

29、 提取液山減壓濃縮山浸膏收率%上加水懸浮有機(jī)合成或生物轉(zhuǎn)化備用水懸浮液山乙酸乙酯萃取乙酸乙酯部分浸膏收率.%圖.紅豆杉愈傷組織提取物的分離流程圖圖. 紅豆杉培養(yǎng)物乙酸乙酷部分提取物的分離流程圖北京中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文將以丙酮溶解,兩倍量硅膠拌樣,以三十倍于樣品量的硅膠.目進(jìn)行柱層析分離,流動(dòng)相為石油醚一丙酮系統(tǒng)梯度洗脫:一純丙酮,共得到三個(gè)化合物:,和如圖這三個(gè)化合物均為無(wú)色棱晶,易溶于丙酮,%溶液犀棕褐色斑點(diǎn)。圖. 紅豆杉愈傷組織提取物部分的分離流程圖將以丙酮溶解,兩倍量硅膠拌樣,以三十倍于樣品量的硅膠.目進(jìn)行柱層析分離,石油醚一丙酮系統(tǒng)梯度洗脫:一純丙酮,共得到五部分. 。再分別將

30、.以丙酮溶解,兩倍量硅膠拌樣,以三十倍于樣品量的硅膠目進(jìn)行柱層析分離,石油醚一丙酮系統(tǒng)梯度洗脫,利用高效液相色譜進(jìn)行反復(fù)分離附圖.。共得到七個(gè)化合物,其中三個(gè)為已知化合物,即. ,;另外四個(gè)為新化合物,為 、,.、腳和 圖.。這四個(gè)新化合物均易溶于丙酮,以下是它們的質(zhì)譜和紅外光譜的數(shù)據(jù)。化合物和的在/:處給出準(zhǔn)分予離子峰【】,并給出碎片離子峰在/:、;紅外光譜數(shù)據(jù)為:.、 、?；衔锏脑?處給出準(zhǔn)分子離子峰【】,并給出碎片離子峰在/:、;紅外、 、 、 、光譜數(shù)據(jù)為: ?；衔锏?在/:處給出準(zhǔn)分子離子峰口】,并給出碎片離子峰在/:、第二章實(shí)驗(yàn)部分:紅豆杉組織培養(yǎng)物中化學(xué)成分的提取與分離、;紅

31、外光譜數(shù)據(jù)為: 、 、 、 。圖.紅豆杉愈傷組織提取物部分的分離流程圖.結(jié)構(gòu)鑒定化合物,無(wú)色菱形結(jié)晶,展開(kāi)后,以%/溶液顯色,呈棕褐色斑點(diǎn)。.譜附圖 .中,.,.,.,.為紫杉烷骨架上的四個(gè)甲基信號(hào),分別為,和甲基;.,.和.的三個(gè)單峰為個(gè)乙酰氧基質(zhì)子的信號(hào):.和.處的兩個(gè)寬單峰是環(huán)外雙鍵的末端烯氫,這是一雙鍵型紫杉北京中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文圈.類化舍韻的結(jié)構(gòu)式“化合物和第二章實(shí)驗(yàn)部分:紅豆杉組織培葬物中化學(xué)成分的提取與分離烷類成分的特征信號(hào);.和.分別是側(cè)鏈上位和位甲基信號(hào),其信號(hào)數(shù)據(jù)均與文獻(xiàn)報(bào)道,一一.,.的數(shù)據(jù)一致【。經(jīng)檢驗(yàn),其斑點(diǎn)與 標(biāo)準(zhǔn)品位置相同顏色一致。由此推定化合物為 結(jié)構(gòu)

32、式見(jiàn)圖.。.,;.,. .,. .,.,.,.,.,. .,.,.,. .,.,.,.,. .,. .,. .,. .,.,.,.,. . .,.,. .,.,. .,.,. .,.,. .,.,. .,.,.,.,. .,. .,.,. .曲. . . . . .,.,. .化.,. .。.,. .,.,. . . . .化合物,無(wú)色菱形結(jié)晶,展開(kāi)后,以%/溶液顯色,呈棕褐色斑點(diǎn)。譜附圖.中,.,.,.,.:為紫杉烷骨架上的四個(gè)甲基信號(hào),分別為,和甲基;.,.和.的蘭個(gè)單峰為個(gè)乙酰氧基質(zhì)子的信號(hào);.采.處的兩個(gè)寬單峰是環(huán)外雙鍵的末端烯氫,是.雙鍵型紫杉烷類成分的特征信號(hào);.處的三重峰是側(cè)鏈上

33、位的甲基信號(hào),.處的四重峰是側(cè)鏈上位上的亞甲基信號(hào)。信號(hào)數(shù)據(jù)均與文獻(xiàn)報(bào)道剛的北京中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文,一一,的數(shù)據(jù)一致。圣檢驗(yàn),斑點(diǎn)與標(biāo)準(zhǔn)品位置相同顏色一致。由此推定化合物為 結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖.?；衔?無(wú)色菱形結(jié)晶,展開(kāi)后,以%溶液顯色,呈棕褐色斑點(diǎn)。?譜附圖.,.,.,.為紫杉烷骨架上的四個(gè)甲基信號(hào),分別為,和甲基;.,.和.的三個(gè)單峰為個(gè)乙酰氧基質(zhì)子的信號(hào);.和.處的兩個(gè)寬單峰是環(huán)外雙鍵的末端烯氫,這是.雙鍵型紫杉烷類成分的特征信號(hào):.處的單峰是側(cè)鏈上位上的甲基信號(hào)。其信號(hào)數(shù)據(jù)均與文獻(xiàn)報(bào)道【】的,.,的數(shù)據(jù)一致。經(jīng)檢驗(yàn),斑點(diǎn)與標(biāo)準(zhǔn)品位置相同顏色一致。由此推定化合物為結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖.。化合物

34、為無(wú)色粉末。經(jīng)展開(kāi)后,以%/溶液顯色,呈棕褐色斑點(diǎn)。譜附圖 .中,.,.,.,.為紫杉烷骨架上的四個(gè)甲基信號(hào),分別為,和甲基;.的單峰為側(cè)鏈位上甲基;.和.的兩個(gè)單峰為個(gè)乙酰氧基質(zhì)子的信號(hào),比少了一個(gè)乙酰氧基質(zhì)子信號(hào);.的質(zhì)子信號(hào)從的.向高場(chǎng)移動(dòng)至.,鄰位氫.從的.向高場(chǎng)移動(dòng)至.,間位氫.,.質(zhì)子信號(hào)均向低場(chǎng)移動(dòng);其信號(hào)數(shù)據(jù)均與文獻(xiàn)報(bào)道【的,?結(jié)構(gòu)式見(jiàn).,的數(shù)據(jù)一致。由此推定化合物為圖.?；衔?無(wú)色菱形結(jié)晶,展開(kāi)后,以%溶液顯色,呈棕褐色斑點(diǎn)。譜附圖 .中,.,.,.為紫杉烷骨架上的四個(gè)甲基信號(hào),分別為,和甲基;.,.和.的三個(gè)單峰為個(gè)乙酰氧基質(zhì)子的信號(hào):.和.處的兩個(gè)寬單峰是環(huán)外雙鍵的末端

35、烯氫,這是雙鍵型紫杉烷類成分的特征信號(hào);.和.分別是側(cè)鏈上位和位甲基信號(hào),其.信號(hào)數(shù)據(jù)均與文獻(xiàn)報(bào)道】的,?一一?.,.的數(shù)據(jù)一致又稱云南紅豆杉甲素。經(jīng)檢驗(yàn),斑點(diǎn)與/標(biāo)準(zhǔn)品位置相同顏色一致。由此推定化合物為結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖.。化合物為無(wú)色粉末。經(jīng)展開(kāi)后,以%溶液顯色,呈棕褐色斑點(diǎn)。譜附圖.中,.,.,.,.為紫杉烷骨架上的四個(gè)甲基比較,側(cè)鏈上甲基質(zhì)子信號(hào)消失:信號(hào),分別為,和甲基;與.和.的三個(gè)單峰為個(gè)乙酰氧基質(zhì)子的信號(hào)皿一的質(zhì)子信號(hào)從的.向高場(chǎng)移動(dòng)至.,鄰位氫從的.向高場(chǎng)移動(dòng)至.,其余的信號(hào)數(shù)據(jù)均與文獻(xiàn)報(bào)道四的.,.,.的數(shù)據(jù)一致。由此推定化合第二章實(shí)驗(yàn)部分:紅豆杉組織培養(yǎng)物中化學(xué)成分的提取與分離物

36、為 結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖.。.,化臺(tái)物為無(wú)色粉末。經(jīng)展開(kāi)后,以%溶液顯色,呈棕褐色斑點(diǎn)。其在/處顯示準(zhǔn)分子離子峰【】十,提示分子量為,比的分子量小,與分予式一致,同時(shí)給出/:,等碎片離子峰附圖;其和”譜與相似;“譜附圖,中只有三個(gè)乙酰氧基的羰基信號(hào),推測(cè)化合物是少了一個(gè)乙酰氧基;譜附圖.中,.,.,.,.為紫杉烷骨架上的四個(gè)甲基信號(hào),分別為,和甲基;和.的兩個(gè)單峰為個(gè)乙酰氧基質(zhì)子的信號(hào);與比較,少了一個(gè)乙酰氧基質(zhì)子信號(hào);.是.的質(zhì)子信號(hào),與的.相比,位于相對(duì)高場(chǎng);鄰位氫一北京中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文.與的。相比也處于相對(duì)高場(chǎng)間位氫.,.質(zhì)子化學(xué)位移均處于相對(duì)低場(chǎng),表明可能是.位為羥基取代;而譜中一位

37、的碳信號(hào)與相比向高場(chǎng)移動(dòng)了.,進(jìn)一步表明.位為羥基取代;因此推定其結(jié)構(gòu)為?,?一?一。由此推定化合物為 ,為一新化合物結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖.。. . .化合物為無(wú)色針狀結(jié)晶。展開(kāi)后,以%.溶液顯色,呈棕褐色斑點(diǎn)。其在/處顯示準(zhǔn)分子離子峰【,提示分子量為,比 的分子量大,與分子式一致,同時(shí)給出:第二章實(shí)驗(yàn)部分:紅豆杉組織培養(yǎng)物中化學(xué)成分的提取與分離,等碎片離子峰附圖。光譜可見(jiàn)明顯的羥基峰和雙鍵 。其 .譜與,酯羰基相似;譜附圖.中,.,.,.,.為紫杉烷骨架上的四個(gè)甲基信號(hào),分別為,和甲基;.,.和.的三個(gè)單峰為個(gè)乙酰. . ¨. . . ,.,.,., .,.,. ,.,. .,.。,.,.

38、.,.,.,.,.,.,. .,. .,.,.氧基質(zhì)子的信號(hào);.和.處的兩個(gè)寬單峰是環(huán)外雙鍵的末端烯氫,是一雙相比,鍵型紫杉烷類成分的特征信號(hào);.是側(cè)鏈上位的甲基信號(hào),與位的甲基信號(hào),與化學(xué)位移值低了,而且氫的數(shù)目少了一個(gè);.是相比,也處于相對(duì)低場(chǎng),且為二重峰;其余的信號(hào)數(shù)據(jù)與 基本一致,這說(shuō)明位的一個(gè)氫可能被羥基取代;譜附圖, .的.位的碳信號(hào)北京中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文.的.相比處于相對(duì)低場(chǎng),位的碳信號(hào).,與 與的.相比處于相對(duì)低場(chǎng),進(jìn)一步說(shuō)明位的一個(gè)氫被羥基取代;因此推定其結(jié)構(gòu)為伍,一.一,。由此推定化合物為 ,是一個(gè)新化合物結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖.。.; 化合物和為無(wú)色粉末。展開(kāi)后,以%/溶液

39、顯色,為兩個(gè)值不同的棕褐色斑點(diǎn)。二化合物的.在/處顯示準(zhǔn)分子離予峰第二章實(shí)驗(yàn)部分:紅豆杉組織培養(yǎng)物中化學(xué)成分的提取與分離,提示分子量為,與的分子量相同,與分子式一致,并給出/:,等碎片離子峰【附圖;附圖】。二者的.和”?譜幾乎完全一致,并與相似。譜附圖;附圖 .】,.,.,.,.為紫杉烷骨架上的四個(gè)甲基信號(hào);.,.和.的三個(gè)單峰為個(gè)乙酰氧基質(zhì)子的信號(hào);.和.處的兩個(gè)寬單峰是環(huán)外雙鍵的末端烯氫;側(cè)鏈一,.的質(zhì)子信號(hào)分別為.,.;側(cè)鏈一質(zhì)子信號(hào). 與的.相比處于相對(duì)低場(chǎng),.的質(zhì)子信號(hào).與的.相比處于相對(duì)高場(chǎng):說(shuō)明 位氫很可能被羥基取代,而位沒(méi)有羥基取代;而”.譜附圖.沖.位的碳信號(hào).與的.相比處于

40、相對(duì)低場(chǎng),.位的碳信號(hào).與的.相比處于相對(duì)高場(chǎng),進(jìn)一步說(shuō)明位的一個(gè)氫被羥基取代,而位沒(méi)有羥基取代了;化合物和是一對(duì)異構(gòu)體,位上羥基的絕對(duì)構(gòu)型尚需其它分析方法進(jìn)行確認(rèn)。二者都是新化合物,結(jié)構(gòu)為旺,?,。結(jié)構(gòu)式。見(jiàn)圖.。命名為 和北京中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文云南紅豆杉甲素的微生物轉(zhuǎn)化.前言微生物轉(zhuǎn)化 是利用微生物代謝過(guò)程中產(chǎn)生的酶對(duì)外源物質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾和改造的催化反應(yīng)。微生物轉(zhuǎn)化的研究?jī)?nèi)容包括轉(zhuǎn)化反應(yīng)的篩選,擴(kuò)大培養(yǎng),轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的提取分離,結(jié)構(gòu)鑒定及活性篩選。藥用化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)往往比較復(fù)雜,分子中通常有多個(gè)手性中心,采用化學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造有時(shí)會(huì)遇到各種困難,如選擇性、得率等問(wèn)題。與化學(xué)催化

41、劑相比,生物催化劑專一性更強(qiáng)、活性高、條件溫和,化學(xué)選擇性、區(qū)域選擇性、立體選擇性或?qū)τ尺x擇性地催化底物生成相應(yīng)的產(chǎn)物,可以進(jìn)行有機(jī)合成所不能或很難形成的化學(xué)反應(yīng)。該法相對(duì)成本低,副產(chǎn)物少,不污染環(huán)境,是一項(xiàng)相對(duì)“綠色”的技術(shù)。由于微生物的多樣性和微生物體內(nèi)酶的多樣性,微生物可以對(duì)各種化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行不同形式的結(jié)構(gòu)修飾,因此微生物轉(zhuǎn)化具有生產(chǎn)一些有用的已知或未知產(chǎn)物的巨大潛力。再通過(guò)活性篩選,可以找到新的高效低毒的天然活性先導(dǎo)化合物,或通過(guò)對(duì)活性組分中不同成分結(jié)構(gòu)變化或活性強(qiáng)度消長(zhǎng)關(guān)系的分析發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵活性成分?；蚺c有機(jī)合成結(jié)合,可獲得多種衍生物,為新藥的研究與開(kāi)發(fā)提供先導(dǎo)化合物。微生物的倍增時(shí)間短,

42、生物量積累快,從而產(chǎn)生的酶量相應(yīng)增多,轉(zhuǎn)化時(shí)間短,這些特點(diǎn),便于微生物轉(zhuǎn)化的規(guī)模化應(yīng)用。同時(shí)微生物的基因工程研究工作成熟,使轉(zhuǎn)化酶的高表達(dá)成為可能,且微生物的發(fā)酵工藝成熟,便于擴(kuò)大。.實(shí)驗(yàn)材料.儀器與材料.型高效液相色譜儀,.型檢測(cè)器,色譜柱:×.,;美國(guó)公司核磁共振譜儀:.內(nèi)標(biāo);美國(guó)尼高力公司傅立葉變換紅外光譜儀:壓片;旋光儀:質(zhì)譜儀美國(guó)公司;型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀.上海愛(ài)朗儀器有限公司.藥品與試劑云南紅豆杉甲素,由.號(hào)紅豆杉細(xì)胞系培養(yǎng)物中分離得到。核磁試劑:氘代氯仿北京化工廠:流動(dòng)相:正己烷、乙酸乙酯、丙酮分析純,北京化工廠;其他:石油醚、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、氯仿、正丁醇分析純,北京化工

43、廠。柱層析和薄層硅膠等均系青島海洋化工廠生產(chǎn);北京中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文養(yǎng)天后停止培養(yǎng),分別將培養(yǎng)液用布氏漏斗抽濾,過(guò)濾得到的菌液則用等體積乙酸乙酯分別萃取次。合并萃取液,蒸千;過(guò)濾得到的菌絲體,分別用乙酸乙酯超聲提取,蒸干。將菌液與菌絲部分分別以少量丙酮溶解,以薄層層析對(duì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè),與底物對(duì)照點(diǎn)樣。薄層層析展開(kāi)荊為石油醚:丙酮:。實(shí)驗(yàn)流程如圖.。利用二十八種菌株對(duì)/.進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的預(yù)試驗(yàn),比較各菌株的轉(zhuǎn)化結(jié)果后,選擇“方”號(hào)菌對(duì)】進(jìn)行放大微生物轉(zhuǎn)化,并得到一個(gè)主要轉(zhuǎn)化產(chǎn)物:化含物見(jiàn)表.。.擴(kuò)大培養(yǎng)將檢測(cè)有轉(zhuǎn)化跡象的方號(hào)菌株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。從試管斜面將微生物接入兩個(gè)三角瓶?jī)?nèi)裝液,懸浮

44、培養(yǎng)小時(shí),溫度恒定,轉(zhuǎn)速恒定/,再以瓶的接種量轉(zhuǎn)入三角瓶?jī)?nèi)裝液,懸浮培養(yǎng)小時(shí),溫度恒定室溫,轉(zhuǎn)速恒定/,長(zhǎng)勢(shì)旺盛,加入底物.。底物以丙酮溶解,配制濃度為/,每瓶投放底物的量為即。相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)天后停止,將培養(yǎng)液合并,用布氏漏斗抽濾,過(guò)濾得到的菌液用等體積乙酸乙酯萃取次,合并萃取液,減壓蒸干;菌絲體用乙酸乙酯超聲提取三次,每次更換新溶劑,每次,合并蒸干。.提取與分離將菌液與菌絲部分各自以少量丙酮溶解,用兩倍量的柱層析硅膠.目拌樣,以三十倍于樣品量的硅膠目進(jìn)行柱層析分離,流動(dòng)相為石油醚.丙酮系統(tǒng):%酮梯度洗脫,收集流份。得到轉(zhuǎn)化產(chǎn)物,經(jīng)光譜技術(shù)鑒定為去乙酰云南紅豆杉甲素 ,共結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖.。圖.

45、 .去乙酰云南紅豆杉甲素的結(jié)構(gòu)式第二章實(shí)驗(yàn)部分:云南紅豆杉甲素的微生物轉(zhuǎn)化表.三十五種菌株對(duì)進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化的初篩結(jié)果篩選結(jié)果菌種名及代號(hào).小刺青霉如.蘋果木層孔菌. .尖孢鐮孢 .刺孢小克銀漢霉. .木賊鐮孢 如.亞麻刺盤孢 .鏈格孢 .釀酒酵母.梨葉點(diǎn)霉一.立枯絲核菌。.雅致小克銀漢霉 .灰葡萄孢.&珊瑚諾卡氏菌 口. .絳紅諾卡氏菌.北京棒桿菌.食油假單胞菌.鈍齒棒桿菌 .谷氨酸棒桿菌 .恥垢分枝桿菌 灰綠犁頭霉.藍(lán)色犁頭霉方十方方”方方。方十方方方菌菌菌菌.表示無(wú)轉(zhuǎn)化跡象表示有轉(zhuǎn)化跡象表示轉(zhuǎn)化跡象明顯北京中醫(yī)藥丈學(xué)碩士研究生學(xué)位論文.轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定化合物,無(wú)色粉末狀。展開(kāi)后,

46、以%/溶液顯色,呈棕褐色斑點(diǎn)。.譜附圖 .中,.,.,.,.為紫杉烷骨架上的四個(gè)甲基信號(hào),分別為,和甲基;.和.的兩個(gè)單峰為個(gè)乙酰氧基質(zhì)子的信. .”.?的質(zhì)子信號(hào)從號(hào),比肌少了一個(gè);說(shuō)明少了一個(gè)乙酰氧基的取代;的.向高場(chǎng)移動(dòng)到.:說(shuō)明位的乙酰氧基被羥基代替了。其余的信號(hào)數(shù)據(jù)均與文獻(xiàn)報(bào)道【】的.,的數(shù)據(jù)一致。由此推.一,第二章實(shí)驗(yàn)部分:云南紅豆杉甲素的微生物轉(zhuǎn)化定化合物為? 結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖.。其生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)過(guò)程如圖.。?翌:蘭竺竺苧蘭蘭蘭蘭蘭蘭轉(zhuǎn)化率%圖.利用“方”號(hào)菌對(duì)進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化的反應(yīng)過(guò)程從底物和上述產(chǎn)物結(jié)構(gòu)來(lái)看,該菌能特異性的水解.上的乙酰氧基,而且轉(zhuǎn)化產(chǎn)率在%以上,該反應(yīng)具有高度的位置選擇性,這是化學(xué)合成不容易做到的,為進(jìn)一步將衍生化成其他活性化合物奠定基礎(chǔ)。北京中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文第三章 論文總結(jié)與創(chuàng)新點(diǎn).全文總結(jié)