酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的影響因素ppt課件

1、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)的影響要素影響要素 檢驗(yàn)科檢驗(yàn)科 實(shí)驗(yàn)過程中的影響要素終止與讀數(shù)終止與讀數(shù)結(jié)果的判讀結(jié)果的判讀試試 劑劑加加 樣樣溫溫 育育樣樣 本本洗洗 板板顯顯 色色 一、標(biāo) 本 排泄物排泄物血血 清清唾唾 液液尿液、糞便尿液、糞便分泌物分泌物體體 液液血清標(biāo)本血清標(biāo)本脂血標(biāo)本脂血標(biāo)本溶血標(biāo)本溶血標(biāo)本標(biāo)本的保管標(biāo)本的保管標(biāo)本的離心標(biāo)本的離心采血試管采血試管 采血試管 1. 1.運(yùn)用非抗凝標(biāo)本血清；運(yùn)用非抗凝標(biāo)本血清； 肝素抗凝血漿會添加肝素抗凝血漿會添加ODOD值值;EDTA;EDTA、酶抑制劑、酶抑制劑( (如如NaN3)NaN3)可抑制可抑制ELISAELISA檢測系

2、統(tǒng)中辣根過檢測系統(tǒng)中辣根過氧化物酶活性氧化物酶活性; ; 2. 2.最好運(yùn)用一次性玻璃試管或真空采血管最好運(yùn)用一次性玻璃試管或真空采血管. . 標(biāo)本采集后，應(yīng)先將標(biāo)本標(biāo)本采集后，應(yīng)先將標(biāo)本3737放置放置 30-60 30-60分鐘后采用分鐘后采用3000r3000r /min /min離心離心15-2015-20分鐘，取分鐘，取 上清液加樣。上清液加樣。標(biāo)本的離心標(biāo)本的離心 標(biāo)本的離心 強(qiáng)行離心分別血清，會使血清中仍殘強(qiáng)行離心分別血清，會使血清中仍殘留部分纖維蛋白原，在留部分纖維蛋白原，在ELISAELISA測定過程中可測定過程中可以構(gòu)成肉眼可見的纖維蛋白塊或附著在酶以構(gòu)成肉眼可見的纖維蛋白

3、塊或附著在酶標(biāo)板孔壁內(nèi)使酶標(biāo)志物不易洗掉，易呵斥標(biāo)板孔壁內(nèi)使酶標(biāo)志物不易洗掉，易呵斥假陽陰性結(jié)果。假陽陰性結(jié)果。 標(biāo)本的保管 1. 1. 一周一周 - 2 - 24 4 保管；保管； 2. 2. 超越一周超越一周 - - 建議建議-20-20保管。保管。 3. 3. 冰凍血清融解后，蛋白質(zhì)會出現(xiàn)部分濃冰凍血清融解后，蛋白質(zhì)會出現(xiàn)部分濃 縮而分布不均，加樣前應(yīng)充分混勻?？s而分布不均，加樣前應(yīng)充分混勻。 標(biāo)本的保管 4. 混濁或有沉淀的血清標(biāo)本應(yīng)先離心或 過濾，廓清后再檢測。 5. 作多次檢測，宜少量分裝冰存; 6. 血清標(biāo)本宜在新穎時(shí)檢測盡量防止細(xì) 菌污染。 防止細(xì)菌污染防止細(xì)菌污染 A. A.

4、如有細(xì)菌污染，菌體中能夠含有內(nèi)如有細(xì)菌污染，菌體中能夠含有內(nèi)源性的源性的 HRP HRP會產(chǎn)生假陽性；會產(chǎn)生假陽性； B. B.細(xì)菌的生長，其所分泌的一些酶能細(xì)菌的生長，其所分泌的一些酶能夠會對夠會對 抗原抗體等蛋白產(chǎn)生分解作用如抗原抗體等蛋白產(chǎn)生分解作用如明膠酶明膠酶 等蛋白水解酶；等蛋白水解酶； C. C.一些細(xì)菌的內(nèi)源性酶如大腸桿菌的一些細(xì)菌的內(nèi)源性酶如大腸桿菌的-半半 乳糖苷酶本身會對用相應(yīng)酶作標(biāo)志乳糖苷酶本身會對用相應(yīng)酶作標(biāo)志的測定的測定 方法產(chǎn)生非特異性干擾。方法產(chǎn)生非特異性干擾。 溶血標(biāo)本 1. ELISA以辣根過氧化物酶標(biāo)志抗原或 抗體； 2. 紅細(xì)胞破壞后可釋放出大量的具有過

5、 氧化物酶活性的血紅蛋白； 3. 殘留的過氧化物酶催化底物產(chǎn)生非特 性顯色導(dǎo)致結(jié)果假陽性。 脂血標(biāo)本 1. 1. 脂質(zhì)小粒粘附在反響孔內(nèi)壁；脂質(zhì)小粒粘附在反響孔內(nèi)壁； 2. 2. 非離子型洗滌劑很難洗掉反響板上干非離子型洗滌劑很難洗掉反響板上干 擾性物質(zhì)的非特異性吸附，引起吸光擾性物質(zhì)的非特異性吸附，引起吸光 度度A A值升高，易呵斥假陽性結(jié)果。值升高，易呵斥假陽性結(jié)果。 餐后抽血、高甘油三脂血癥患者、標(biāo)本餐后抽血、高甘油三脂血癥患者、標(biāo)本離心時(shí)間、離心速度不適宜等，都可使分離心時(shí)間、離心速度不適宜等，都可使分別的血清標(biāo)本中殘留著大量的脂質(zhì)小粒。別的血清標(biāo)本中殘留著大量的脂質(zhì)小粒。 二、二、

6、試試 劑劑1.試劑盒保管于試劑盒保管于2-82.運(yùn)用前應(yīng)先將檢測試劑運(yùn)用前應(yīng)先將檢測試劑 盒放置室溫平衡盒放置室溫平衡15-30 分鐘，保證酶等液體的初始反響溫度及分鐘，保證酶等液體的初始反響溫度及 活性劑的溶解。活性劑的溶解。3.察看外包裝和內(nèi)組份有無漏液。察看外包裝和內(nèi)組份有無漏液。三、加 樣仔細(xì)留意加樣全部過程仔細(xì)留意加樣全部過程移液器的運(yùn)用移液器的運(yùn)用及時(shí)放入孵育箱及時(shí)放入孵育箱標(biāo)本較多時(shí)，請分批操作標(biāo)本較多時(shí)，請分批操作試劑的滴加試劑的滴加 加樣過程應(yīng)留意： A. A. 加樣不可太快；加樣不可太快； B. B. 要防止加在孔壁上部；要防止加在孔壁上部； C. C. 不可濺出；不可濺出

7、； D. D. 防止產(chǎn)生氣泡；防止產(chǎn)生氣泡； E. E. 盡能夠運(yùn)用同一加樣器，裝緊槍盡能夠運(yùn)用同一加樣器，裝緊槍 頭，加樣后充分混勻。頭，加樣后充分混勻。 試劑的滴加 從滴瓶中滴加，應(yīng)留意滴加的角度和從滴瓶中滴加，應(yīng)留意滴加的角度和速度。速度。 滴加太快，很容易出現(xiàn)反復(fù)滴加或加滴加太快，很容易出現(xiàn)反復(fù)滴加或加在兩孔之間的景象，這樣就會在孔內(nèi)的非在兩孔之間的景象，這樣就會在孔內(nèi)的非包被區(qū)出現(xiàn)非特異吸附，從而引起非特異包被區(qū)出現(xiàn)非特異吸附，從而引起非特異顯色。顯色。移液器的運(yùn)用移液的方法及本卷須知移液的方法及本卷須知槍頭的裝配槍頭的裝配量程的調(diào)理量程的調(diào)理量程的調(diào)理量程的調(diào)理 1. 1.從大體積

8、調(diào)為小體積從大體積調(diào)為小體積 2. 2.從小體積調(diào)為大體積從小體積調(diào)為大體積 在該過程中，千萬不要將按鈕旋出量在該過程中，千萬不要將按鈕旋出量程，否那么會卡住內(nèi)部機(jī)械安裝而損壞了程，否那么會卡住內(nèi)部機(jī)械安裝而損壞了移液槍移液槍 槍頭吸液嘴的裝配 用力地在槍頭盒子上敲幾下 錯誤 將移液槍器垂直插入槍頭中，略微用力左右悄然轉(zhuǎn)動即可使其嚴(yán)密結(jié)合 正確 槍頭卡緊的標(biāo)志是略為超越O型環(huán)，并可以看到銜接部分構(gòu)成明晰的密封圈。 移液的方法移液的方法 前進(jìn)移液法前進(jìn)移液法 反向移液法反向移液法 普通用于轉(zhuǎn)移高粘液體、生普通用于轉(zhuǎn)移高粘液體、生物活性液體、易起泡液體或極微量的液體，物活性液體、易起泡液體或極微量

9、的液體，其原理就是先吸入多于設(shè)置量程的液體，其原理就是先吸入多于設(shè)置量程的液體，轉(zhuǎn)移液體的時(shí)候不用吹出剩余的液體。轉(zhuǎn)移液體的時(shí)候不用吹出剩余的液體。 反復(fù)操作移液法反復(fù)操作移液法 適用于快速、簡便地反復(fù)轉(zhuǎn)適用于快速、簡便地反復(fù)轉(zhuǎn)移等量的同種液體。移等量的同種液體。 全血移液法全血移液法 移液的本卷須知 1.汲取液體時(shí)，移液器堅(jiān)持豎直形狀，將 槍頭插入液面下1厘米。 留意吸液體時(shí)，一定要緩慢平穩(wěn)的松開拇指，絕不允許忽然松開，以防將溶液吸入過快而沖入移液器內(nèi)腐蝕柱塞而呵斥漏氣。 移液的本卷須知 2.設(shè)定加樣體積，不能大于加樣槍標(biāo)定的 移液范圍 3.加樣吸嘴的干凈和裝配 4.汲取液體和排出液體動作都

10、一定要慢。 移液的本卷須知移液的本卷須知 5. 5.加樣槍嚴(yán)禁汲取有強(qiáng)揮發(fā)性、強(qiáng)腐蝕性加樣槍嚴(yán)禁汲取有強(qiáng)揮發(fā)性、強(qiáng)腐蝕性 的液體如濃酸、濃堿、有機(jī)物等的液體如濃酸、濃堿、有機(jī)物等 6. 6.不要用大量程的加樣槍移取小體積的液不要用大量程的加樣槍移取小體積的液 體，以免影響準(zhǔn)確度。體，以免影響準(zhǔn)確度。 移液的本卷須知 7.如不運(yùn)用，要把移液槍的量程調(diào)至最大值的刻度，使彈簧處于松弛形狀以維護(hù)彈簧，并將其豎直掛在移液槍架上。 8.外表清潔：用10%的次氯酸鈉溶液或70%的酒精溶液清潔后，自然晾干。 9.微量加樣槍必需按要求定期進(jìn)展校準(zhǔn)。四、溫四、溫 育育 1. 1. 抗原抗體反響必需在一定的抗原抗體

11、反響必需在一定的溫度條件溫度條件 下反響一定的時(shí)間。下反響一定的時(shí)間。2. 2. 溫育所需時(shí)間與溫度成反比。溫育所需時(shí)間與溫度成反比。3. 3. 最為常用的溫育溫度有最為常用的溫育溫度有3737和室溫，和室溫， 其次是其次是4343和和2 288。 實(shí)踐操作中應(yīng)留意： 溫育溫度的選擇溫育溫度的選擇足夠的反響時(shí)間足夠的反響時(shí)間“邊緣效應(yīng)的排除邊緣效應(yīng)的排除 溫育溫度的選擇 1. 1.微孔板從室溫拿至水浴箱或溫箱中微孔板從室溫拿至水浴箱或溫箱中 時(shí)，孔內(nèi)溫度從室溫升至?xí)r，孔內(nèi)溫度從室溫升至3737，需求，需求 一定的時(shí)間；一定的時(shí)間； 2. 2.在臨床實(shí)驗(yàn)室中，通常是將微孔板一在臨床實(shí)驗(yàn)室中，通常

12、是將微孔板一 放入溫箱即開場計(jì)時(shí)，這樣就很容易放入溫箱即開場計(jì)時(shí)，這樣就很容易 呵斥實(shí)踐測定中溫育時(shí)間不夠，弱陽呵斥實(shí)踐測定中溫育時(shí)間不夠，弱陽 性樣本測不出來的問題。性樣本測不出來的問題。 “邊緣效應(yīng)的排除邊緣效應(yīng)的排除1.1.“邊緣效應(yīng)，即外周孔顯色較邊緣效應(yīng)，即外周孔顯色較中心孔深中心孔深; ;2.2.有研討證明在溫育中的熱力學(xué)梯有研討證明在溫育中的熱力學(xué)梯度能夠是度能夠是 根本緣由。根本緣由。3.3.聚苯乙烯本身為不良熱導(dǎo)體，板聚苯乙烯本身為不良熱導(dǎo)體，板從室通從室通 常在常在2525左右置于左右置于3737溫箱，溫箱，板升溫板升溫 時(shí)，在外周孔與中心孔之間能夠時(shí)，在外周孔與中心孔之間

13、能夠存在一熱存在一熱 力學(xué)梯度。力學(xué)梯度。 總而言之，在臨床總而言之，在臨床ELISAELISA測定中，要測定中，要保證好的測定效果，應(yīng)盡量采用水浴。保證好的測定效果，應(yīng)盡量采用水浴。 溫育中讓微孔板浮于水面上浸入溫育中讓微孔板浮于水面上浸入1/31/3，或?qū)⒔杆纳巢挤湃胍淮箫埡校驅(qū)⒔杆纳巢挤湃胍淮箫埡兄袠?gòu)成濕盒，然后放于溫箱中，這樣可使中構(gòu)成濕盒，然后放于溫箱中，這樣可使微孔板板孔底部直接與微孔板板孔底部直接與3737水或濕布接觸，水或濕布接觸，而且水浴箱或濕盒內(nèi)溫度較高，可使反響而且水浴箱或濕盒內(nèi)溫度較高，可使反響溶液的溫度迅速與溫室平衡。溶液的溫度迅速與溫室平衡。 五、洗五、洗

14、 板板 血清中殘留的纖維蛋白絲或血清中殘留的纖維蛋白絲或洗滌液析出的結(jié)晶易使洗板機(jī)針洗滌液析出的結(jié)晶易使洗板機(jī)針孔全阻塞或半阻塞，呵斥未結(jié)合孔全阻塞或半阻塞，呵斥未結(jié)合標(biāo)志酶洗脫不徹底，導(dǎo)致標(biāo)志酶洗脫不徹底，導(dǎo)致“花板花板呵斥假陽性或假陰性。呵斥假陽性或假陰性。 洗板的本卷須知1. 要有適當(dāng)?shù)慕輹r(shí)間30-60秒。2. 洗板機(jī)吸液要徹底，剩余量低于5ul。3. 洗液應(yīng)調(diào)至適當(dāng)?shù)淖⒊隽浚靠讘?yīng)在 350ul-450ul之間，但不要溢出孔外。4.4.洗板次數(shù)應(yīng)與闡明書要求一致，盡量不洗板次數(shù)應(yīng)與闡明書要求一致，盡量不 要私自添加或減少洗板次數(shù)。要私自添加或減少洗板次數(shù)。5.5.稀釋洗液應(yīng)運(yùn)用蒸餾水

15、或去離子水，稀釋洗液應(yīng)運(yùn)用蒸餾水或去離子水，pH pH 值不宜過酸或過堿，保證配出的洗液值不宜過酸或過堿，保證配出的洗液pH pH 值為值為7.47.40.20.2，水質(zhì)宜新穎，長菌或有，水質(zhì)宜新穎，長菌或有 沉淀不宜運(yùn)用，且用非金屬容器保管。沉淀不宜運(yùn)用，且用非金屬容器保管。6. 6. 由于洗滌液系高濃度磷酸鹽，會構(gòu)成由于洗滌液系高濃度磷酸鹽，會構(gòu)成 結(jié)晶，配制洗液時(shí)應(yīng)完全溶解。結(jié)晶，配制洗液時(shí)應(yīng)完全溶解。7. 7. 稀釋好的洗液稀釋好的洗液44下可保管下可保管3535天。天。8. 8. 洗板后，拍干包被板，應(yīng)垂直扣在備好洗板后，拍干包被板，應(yīng)垂直扣在備好 的干凈吸水紙或毛巾上，且每次點(diǎn)頭應(yīng)

16、的干凈吸水紙或毛巾上，且每次點(diǎn)頭應(yīng) 換掉前次拍過的毛巾或吸水紙，防止交換掉前次拍過的毛巾或吸水紙，防止交 叉污染。叉污染。9. 9. 操作洗板機(jī)過程中要不時(shí)察看洗板操作洗板機(jī)過程中要不時(shí)察看洗板 機(jī)針孔內(nèi)洗液的通暢情況，及時(shí)糾機(jī)針孔內(nèi)洗液的通暢情況，及時(shí)糾 正，洗板機(jī)不用時(shí)運(yùn)用去離子水清正，洗板機(jī)不用時(shí)運(yùn)用去離子水清 洗幾遍后關(guān)機(jī)。洗幾遍后關(guān)機(jī)。10.10.每周要進(jìn)展保養(yǎng)清洗。每周要進(jìn)展保養(yǎng)清洗。 六、顯 色 本卷須知：1. 檢查底物溶液的有效性；2. 試劑顯色時(shí)先加A液，后加B液，二者 不要顛倒。3. 前后參與的間隔時(shí)間不超越10分鐘。4. 4. 假設(shè)把假設(shè)把A A液和液和B B液先混合，再

17、加樣顯色，液先混合，再加樣顯色， 需求求二者等體積混合。需求求二者等體積混合。5. A5. A、B B液應(yīng)防止接觸污染物。液應(yīng)防止接觸污染物。6. 6. 不同廠家顯色液不得混用。不同廠家顯色液不得混用。 七、終止和讀數(shù) 肉眼判別結(jié)果時(shí)，顯色淺不易察看，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，必需運(yùn)用酶標(biāo)儀檢測結(jié)果，以保證結(jié)果一致性。 本卷須知本卷須知1 1、酶標(biāo)儀的波長能否適宜或?yàn)V光片能否正確。、酶標(biāo)儀的波長能否適宜或?yàn)V光片能否正確。2 2、單波長或雙波長比色選擇的問題。、單波長或雙波長比色選擇的問題。 ELISA ELISA測定比色時(shí)，最好是運(yùn)用雙波長比色測定比色時(shí)，最好是運(yùn)用雙波長比色 3 3、加完終止液后、加

18、完終止液后3030分鐘內(nèi)讀取數(shù)據(jù)。分鐘內(nèi)讀取數(shù)據(jù)。4 4、保證酶標(biāo)板的底部是清潔枯燥的。、保證酶標(biāo)板的底部是清潔枯燥的。雙波長比色？雙波長比色？ 雙波長比色測定能排除由微滴板本身、板雙波長比色測定能排除由微滴板本身、板孔內(nèi)標(biāo)本的非特異吸收、指紋、刮痕、灰塵等孔內(nèi)標(biāo)本的非特異吸收、指紋、刮痕、灰塵等對特異顯色測定吸光度的影響，普通不用設(shè)空對特異顯色測定吸光度的影響，普通不用設(shè)空白孔。白孔。 ELISA ELISA測定中單個空白孔的非特異吸收上測定中單個空白孔的非特異吸收上有一定程度的不確定性；有一定程度的不確定性；在在ELISAELISA測定比色時(shí)，最好是運(yùn)用雙波長比色。測定比色時(shí)，最好是運(yùn)用雙波長比色。 八、結(jié)果的判讀八、結(jié)果的判讀灰區(qū)的定義灰區(qū)的定義 灰區(qū)又稱灰色帶反響。就是灰區(qū)又稱灰色帶反響。就是把把ODOD值在值在Cut offCut off值正負(fù)值正負(fù)20%20%這個這個范圍內(nèi)的標(biāo)本稱為灰區(qū)標(biāo)本。這范圍內(nèi)的標(biāo)本稱為灰區(qū)標(biāo)本。這個范圍稱為