基因組學(xué)第5章轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的組裝

1、第五章第五章 轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的組裝轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的組裝第一節(jié) DNA結(jié)合蛋白及其結(jié)合位點DNA結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)特征轉(zhuǎn)錄因子的三個結(jié)構(gòu)組成部分1）DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（分類依據(jù)）2）連接域3）轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域常見類型 螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋基序(helix-turn-helix motif, HTH, 圖A) 鋅指基序(zinc finger motif, 圖B,) 亮氨酸拉鏈基序(Leucine zipper motif，圖C) 螺旋-環(huán)-螺旋基序(heliex-loop-helix motif, 圖D)螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋（Helix-turn-helix,HTH）基序 兩段螺旋被一短的轉(zhuǎn)角結(jié)

2、構(gòu)分開，其中一段螺旋為 DNA 識別螺旋。 同源異形結(jié)構(gòu)域(Homeodomain，由同源異形盒編碼)中含有HTH 基序。具有Homeodomain的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白在胚胎發(fā)育和正常細胞分化的基因表達調(diào)節(jié)中有重要作用。鋅指(Zinc finger)基序 由肽鏈的保守序列中的一對組氨酸加一對半胱氨酸(His2Cys2)或2 對半胱氨酸(cys2cys2)與一個鋅離子形成配位鍵，這些氨基酸對之間的多膚鏈成環(huán)狀突出并折迭成指形結(jié)構(gòu)，多個指結(jié)構(gòu)常串聯(lián)重復(fù)。 鋅指族轉(zhuǎn)錄因子以二聚體形式同 DNA 上的順式調(diào)控元件結(jié)合。 含鋅指基序的轉(zhuǎn)錄因子：與 GC 盒結(jié)合的SPl、類固醇激素受體家族，抑癌蛋白WT1 等。

3、亮氨酸拉鏈(Leucine-Zipper)基序 由一段每隔 6 個a a就有一個Leu 的伸展肽鏈組成，這些周期性出現(xiàn)的Leu 都位于螺旋的同側(cè)面，因此兩條均含Leu 拉鏈基序的蛋白質(zhì)通過亮氨酸側(cè)鏈的相互作用形成二聚體。 具有亮氨酸拉鏈基序的轉(zhuǎn)錄因子：原癌基因 C-Jun/C-fos(APl 家族)螺旋-環(huán)-螺旋(Helix-loop-Helix，HLHt)基序由 2 個螺旋間隔一個非螺旋的環(huán)(loop)組成如原癌基因產(chǎn)物 C-myc 及其結(jié)合蛋白Max含 HLH 和Leu-拉鏈基序的轉(zhuǎn)錄因子的相似性： 均至少含有一個螺旋，其中都有一側(cè)親水面和一側(cè)疏水面，因此這兩種基序又稱為兩親螺旋基序 兩類

4、轉(zhuǎn)錄因子均依靠螺旋氨基端附近的堿性區(qū)（帶正電荷 aa 區(qū)）與DNA 結(jié)合，因此又分別稱為bzip 和bHLH（b=basic，堿性) 兩類轉(zhuǎn)錄因子活性都依賴于二聚體化凝膠阻滯分析凝膠阻滯實驗可鑒定出與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA片段第二節(jié) 轉(zhuǎn)錄起始中DNA與蛋白質(zhì)相互作用DNA-蛋白質(zhì)相互作用是轉(zhuǎn)錄調(diào)控的方式 DNA: 順式調(diào)控元件(cis-regulating element),是指對基因表達有調(diào)控活性的DNA 序列，其活性只影響與其自身同處于一個DNA分子上的基因 蛋白質(zhì)：反式作用因子(trans-acting factor)是通過識別和結(jié)合順式調(diào)控元件的核心序列而調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄效率的一組蛋白質(zhì)DN

5、A-蛋白質(zhì)相互作用順式調(diào)控元件 啟動子(promoter) 增強子(enhancer) 負調(diào)控元件沉默子(silencer) 絕緣子 其它順式調(diào)控元件： 1）應(yīng)答元件(responsive elements) 真核細胞中對某些特定的環(huán)境作出應(yīng)答的基因，常具有相同的順式元件應(yīng)答元件 應(yīng)答元件能被在一些特定情況下表達的調(diào)控因子識別(又稱為可誘導(dǎo)的順式調(diào)控元件反式作用因子)。 2）轉(zhuǎn)座元件RNA聚合酶與啟動子的結(jié)合方式直接結(jié)合，細菌直接結(jié)合，細菌通過通過DNADNA結(jié)合蛋白間接結(jié)合，結(jié)合蛋白間接結(jié)合，真核生物真核生物細菌RNA聚合酶結(jié)合于啟動子序列 細菌中RNA聚合酶結(jié)合的靶序列叫做啟動子。大腸桿菌

6、乳糖操縱子的啟動子大腸桿菌乳糖操縱子的啟動子真核細胞啟動子更加復(fù)雜 真核生物中，啟動子一詞用于指所有對基因轉(zhuǎn)錄起始有重要作用的序列。 這些序列可能有多個，各具有不同的功能，不僅包括作為起始復(fù)合物組裝位點的核心啟動子（有時也叫做基本啟動子），還包括一個或多個位于核心啟動子上游的上游啟動子元件。轉(zhuǎn)錄起始事件 RNA 聚合酶結(jié)合核心啟動子 封閉的啟動子復(fù)合物轉(zhuǎn)換為開放的啟動子復(fù)合物 RNA合成的起始 啟動子清除：聚合酶向啟動子下游移動第三節(jié) 細菌轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控細菌的轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始 1）組成型控制：依賴于啟動子結(jié)構(gòu) 2）調(diào)節(jié)型控制：操縱子學(xué)說，依賴于調(diào)解蛋白水平啟動子(promoter) 與基因轉(zhuǎn)

7、錄啟動有關(guān)的一組DNA 序列，一般位于轉(zhuǎn)錄起始點上游100-200bp 以內(nèi)，其功能是決定轉(zhuǎn)錄的起始點和調(diào)控轉(zhuǎn)錄頻率 原核啟動子： 1）-35框： 5-TTGACA-3 2）-10框 5-TATAAT-3細菌啟動子結(jié)構(gòu)決定轉(zhuǎn)錄的基礎(chǔ)水平 細菌啟動子共有序列是可變的 1）-10框：T80A95T45A60A50T96 影響啟動子復(fù)合物從封閉向開放的轉(zhuǎn)換 2）-35框：T82T84G78A65C54A45 影響亞基識別，從而影響RNA聚合酶結(jié)合 轉(zhuǎn)錄起始點附近及轉(zhuǎn)錄單位前50個核苷酸序列影響轉(zhuǎn)錄起始后的延伸 不同的基因可能有不同的最有效啟動子 啟動子序列突變可能改變轉(zhuǎn)錄起始的基礎(chǔ)水平大腸桿菌轉(zhuǎn)錄起

8、始細菌RNA聚合酶結(jié)構(gòu)：核心酶+亞基 1）核心酶：2 2）亞基：啟動子特異性結(jié)合不同的亞基識別不同的啟動子 70：標準亞基，指導(dǎo)大多數(shù)基因轉(zhuǎn)錄 特定條件下其它亞基被激活 例：熱休克基因的識別非標準的亞基和其識別序列操縱子及其相關(guān)概念 操縱子(operon)，指一組在基因組中彼此相鄰的基因，兩基因頭尾間可能僅隔一兩個核苷酸。操縱子的所有基因都作為一個單位表達。 結(jié)構(gòu)基因(structural gene)，編碼非調(diào)控因子的基因。 調(diào)控基因(regulator gene)，編碼調(diào)控蛋白（阻抑物）的基因。 阻抑物(repressor)，能阻止基因表達的蛋白質(zhì)，可與操縱基因結(jié)合來阻止轉(zhuǎn)錄。 操縱基因(o

9、perator)，位于啟動子下游可與阻抑物結(jié)合的DNA元件，當(dāng)與阻抑物結(jié)合后調(diào)節(jié)啟動子抑制轉(zhuǎn)錄，常為回文序列。 誘導(dǎo)物(inducer)，通過與阻抑物結(jié)合激活基因轉(zhuǎn)錄的小分子物質(zhì)。乳糖操縱子乳糖操縱子的調(diào)控乳糖阻抑物操縱基因的結(jié)合乳糖阻抑物以四聚體形式結(jié)合到兩個操縱基乳糖阻抑物以四聚體形式結(jié)合到兩個操縱基因上因上另外的兩個操縱基因，一個位于初級操縱基另外的兩個操縱基因，一個位于初級操縱基因的上游因的上游90bp，另一個位于初級操縱基因，另一個位于初級操縱基因的下游的下游400bp。輔阻抑物與色氨酸操縱子輔阻抑物(co-repressor)，結(jié)合到阻抑物上來抑制轉(zhuǎn)錄的小分子。色氨酸阻抑物存在多個

10、靶點：可控制多個基因啟動子 aroH,編碼合成色氨酸的生化通路中早期步驟的特異酶 trpR,色氨酸阻抑物自身基因，調(diào)控色氨酸合成的晚期步驟抑郁癥患者究竟有多危險？第四節(jié) 真核生物轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控真核生物轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控 真核轉(zhuǎn)錄起始比原核生物更復(fù)雜 真核轉(zhuǎn)錄起始順式元件的復(fù)雜性 1) 核心啟動子 2) 基本啟動子元件 3) 特異性表達元件 4) 遠端調(diào)控元件 真核轉(zhuǎn)錄起始反式因子的復(fù)雜性 1) RNA聚合酶 2) 激活蛋白和輔激活蛋白 3) 阻抑物 4) 轉(zhuǎn)錄因子的修飾核心與基本啟動子元件真核啟動子區(qū)域包括核心啟動子和啟動子上游近側(cè)序列： 1、核心啟動子(core promoter) 是決定轉(zhuǎn)錄起始位

11、置的關(guān)鍵序列，也是普通轉(zhuǎn)錄因子TFD 的結(jié)合位點， TATA 盒(TATA box) 位于轉(zhuǎn)錄起始點上游-25-30bp 起始子(initiator，Inr) Inr 是與轉(zhuǎn)錄起始位點重疊的短的較保守序列 注：不是所有基因都含有 TATA 盒或Inr 序列有的只有其中之一，有的兩者都無 這些核心啟動子的序列和它們之間的間隔多變2、上游/基本啟動子元件(Upstream/basal Promoter element，UPE) 位于較上游(-30 一-110bp)，能較強影響轉(zhuǎn)錄起始的頻率，如CAAT 盒和GC 盒其中GC盒是轉(zhuǎn)錄因子SPl 的結(jié)合位點。特異性表達元件 應(yīng)答模塊(response

12、module)，使轉(zhuǎn)錄起始能響應(yīng)細胞外一般信號元件。如，cAMP應(yīng)答模塊CRE(5-A/TCGTCA-3) 細胞特異性模塊(cell-specific module), 僅在一種組織細胞中特異表達的基因啟動子。如，垂體細胞模塊、脂肪細胞模塊等。 發(fā)育調(diào)節(jié)因子模塊（developmental regulator），介導(dǎo)特定發(fā)育階段的基因表達的元件。真核順式元件和反式因子的多層次順式元件： 1）啟動子(promoter) 2）增強子(enhancer) 3）負調(diào)控元件沉默子 (silencer) 4）絕緣子反式因子 1）激活物: 特異結(jié)合DNA 2）輔激活物：不特異結(jié)合DNA，通過蛋白質(zhì)間相互作用

13、 3）中介子（mediator）: 激活蛋白與RNA聚合酶II間 4）阻抑物增強子(enhancer)能顯著提高基因轉(zhuǎn)錄效率的一類順式調(diào)控元件（其核心序列常為8-12bp)增強子的作用特點： 1）能(通過啟動子)提高同一條鏈上的靶基因轉(zhuǎn)錄速率； 2）增強子對同源基因或異源基因同樣有效； 3）增強子的位置可在基因5-上游、基因內(nèi)或3下游序列中； 4）自身沒有5-或3-方向性； 5）增強子可遠離轉(zhuǎn)錄起始點(最多30Kb)； 6）增強子一般具有組織或細胞特異性RNA聚合酶 RNA 聚合酶I, 轉(zhuǎn)錄28S, 5. 8S 和18S 核糖體 RNA (rRNA) RNA 聚合酶聚合酶，負責(zé)真核生物蛋白編碼

14、基因和大部分小核RNA（snRNA)的轉(zhuǎn)錄，有7-10 個亞基，最大亞基的羧基末端結(jié)構(gòu)域(CTD)具有7 個氨基酸(Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Set)的重復(fù)序列，其中有多個磷酸化位點CTD 磷酸化對調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄有重要作用 RNA 聚合酶III,轉(zhuǎn)錄tRNA, 5S rRNA, U6-snRNA, 小核仁RNA (snoRNA), 小細胞質(zhì) RNA (seRNA) 基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子(basal transcription factor)n真核基因轉(zhuǎn)錄除 RNA 聚合酶外，還需要許多蛋白因子轉(zhuǎn)錄因子參加，其中一些轉(zhuǎn)錄因子是RNA 聚合酶轉(zhuǎn)錄起始必需的，并且可以維持基礎(chǔ)水平的轉(zhuǎn)錄，

15、因此稱為基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子或普通轉(zhuǎn)錄因子(general transcription factor)nRNA 聚合酶 II 的普通轉(zhuǎn)錄因子(TF II)包括TFIID,TFB,TFIIF，TFIIE，TFIIH，TFIIA 等nTFIID 是最先結(jié)合到DNA上的轉(zhuǎn)錄因子，由TATA結(jié)合蛋白（TATA-binding protein, TBP)和12個TBP相關(guān)因子（TAF, TBP-associated factor)組成RNA聚合酶II的轉(zhuǎn)錄起始(1)RNA聚合酶II的轉(zhuǎn)錄起始（2） 三個關(guān)鍵事件： TBP的結(jié)合誘導(dǎo)TATA框區(qū)段DNA形成彎曲 DNA彎曲提供了TFIIB識別的結(jié)構(gòu)，從而保證了RNA聚合酶II在轉(zhuǎn)錄起始位點上的正確定位 TFIIH破環(huán)堿基配對，這是形成開放啟動子所必需的激活物(activator) 激活轉(zhuǎn)錄起始的蛋白質(zhì) 可能結(jié)合于啟動子區(qū)域，影響單個基因的轉(zhuǎn)錄，也可能結(jié)合于增強子區(qū)域，影響多個基因的轉(zhuǎn)錄 可與前起始復(fù)合物相互作用，作用的部位稱為激活域(activatio