沙門氏菌的檢測鑒定ppt課件

1、沙門氏菌的檢測及鑒定1;.設(shè)備和資料 除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培育設(shè)備外，其他設(shè)備和資料如下：2.1 冰箱：2 5 。2.2 恒溫培育箱：36 1 ，42 1 。2.3 均質(zhì)器。2.4 振蕩器。2.5 電子天平：感量0.1 g。2.6 無菌錐形瓶:容量500 mL，250 mL。2.7 無菌吸管：1 mL具0.01 mL刻度、10 mL具0.1 mL刻度或微量移液器及吸頭。2.8 無菌培育皿：直徑90 mm。2.9 無菌試管：3 mm50 mm、10 mm75 mm。2.10 無菌毛細管。2.11 pH計或pH比色管或精細pH試紙。2.12 全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)。23 培育基和試劑 3.1

2、 緩沖蛋白胨水BPW。3.2 四硫磺酸鈉煌綠TTB增菌液。3.3 亞硒酸鹽胱氨酸SC增菌液。3.4 亞硫酸鉍BS瓊脂。3.5 HE瓊脂：見附錄A中A.5。3.6 木糖賴氨酸脫氧膽鹽XLD瓊脂。3.7 沙門氏菌屬顯色培育基。3.8 三糖鐵TSI瓊脂。3.9 蛋白胨水、靛基質(zhì)試劑。3.10 尿素瓊脂pH 7.2。3.11 氰化鉀 KCN 培育基。3.12 賴氨酸脫羧酶實驗培育基。3.13 糖發(fā)酵管。3.14 鄰硝基酚-D半乳糖苷ONPG培育基。3.15 半固體瓊脂。3.16 丙二酸鈉培育基。3.17 沙門氏菌O和H診斷血清。3.18 生化鑒定試劑盒。3A.1 緩沖蛋白胨水BPW A.1.1成分 蛋

3、白胨10.0 g氯化鈉5.0 g磷酸氫二鈉含12個結(jié)晶水9.0 g磷酸二氫鉀1.5 g蒸餾水1 000 mLpH 7.20.2 A.1.2 制法 將各成分參與蒸餾水中，攪混均勻，靜置約10 min，煮沸溶解，調(diào)理pH，高壓滅菌121 ，15 min。4A.2 四硫磺酸鈉煌綠TTB增菌液 A.2.1根底液 蛋白胨10.0 g、牛肉膏5.0 g、氯化鈉3.0 g、碳酸鈣45.0 g、蒸餾水1 000 mL、pH 7.00.2 除碳酸鈣外，將各成分參與蒸餾水中，煮沸溶解，再參與碳酸鈣，調(diào)理pH，高壓滅菌121 ，20 min。A.2.2硫代硫酸鈉溶液 硫代硫酸鈉含5個結(jié)晶水50.0 g，餾水 加至1

4、00 mL，高壓滅菌121 ，20 min。A.2.3碘溶液 碘 片20.0 g、碘化鉀25.0 g、蒸餾水 加至100 mL，將碘化鉀充分溶解于少量的蒸餾水中，再投入碘片，振搖玻瓶至碘片全部溶解為止，然后加蒸餾水至規(guī)定的總量，儲存于棕色瓶內(nèi)，塞緊瓶蓋備用。A.2.4 0.5煌綠水溶液煌綠0.5 g、蒸餾水100 mL溶解后，存放暗處，不少于1d，使其自然滅菌。A.2.5牛膽鹽溶液 牛膽鹽10.0 g，蒸餾水100 mL加熱煮沸至完全溶解，高壓滅菌121 ，20 min。A.2.6 制法 根底液900 mL、硫代硫酸鈉溶液100 mL、碘溶液20.0 mL、煌綠水溶液2.0 mL牛膽鹽溶液50

5、.0 mL臨用前，按上列順序，以無菌操作依次參與根底液中，每參與一種成分，均應(yīng)搖勻后再參與另一種成分。5A.3 亞硒酸鹽胱氨酸SC增菌液 A.3.1成分蛋白胨5.0 g乳糖4.0 g磷酸氫二鈉10.0 g亞硒酸氫鈉4.0 gL-胱氨酸0.01 g蒸餾水1 000 mLpH 7.00.2 A.3.2 制法 除亞硒酸氫鈉和L-胱氨酸外，將各成分參與蒸餾水中，煮沸溶解，冷至55 以下，以無菌操作參與亞硒酸氫鈉和1 g/L L-胱氨酸溶液10 mL稱取0.1 g L-胱氨酸，加1 mol/L氫氧化鈉溶液15 mL，使溶解，再加無菌蒸餾水至100 mL即成，如為DL-胱氨酸，用量應(yīng)加倍。搖勻，調(diào)理pH。

6、6A.4 亞硫酸鉍BS瓊脂 A.4.1成分 蛋白胨10.0 g牛肉膏5.0 g葡萄糖5.0 g硫酸亞鐵0.3 g磷酸氫二鈉4.0 g煌 綠0.025 g或5.0gL水溶液5.0mL檸檬酸鉍銨2.0 g亞硫酸鈉6.0 g瓊 脂18.0 g20 g蒸餾水1 000 mLpH 7.50.2 A.4.2 制法 將前三種成分參與300 mL蒸餾水制造根底液，硫酸亞鐵和磷酸氫二鈉分別參與20 mL和30 mL蒸餾水中，檸檬酸鉍銨和亞硫酸鈉分別參與另一20 mL和30 mL蒸餾水中，瓊脂參與600 mL蒸餾水中。然后分別攪拌均勻，煮沸溶解。冷至80 左右時，先將硫酸亞鐵和磷酸氫二鈉混勻，倒入根底液中，混勻。

7、將檸檬酸鉍銨和亞硫酸鈉混勻，倒入根底液中，再混勻。調(diào)理pH，隨即傾入瓊脂液中，混合均勻，冷至50 55 。參與煌綠溶液，充分混勻后立刻傾注平皿。注：本培育基不需求高壓滅菌，在制備過程中不宜過分加熱，防止降低其選擇性，貯于室溫暗處，超越48 h會降低其選擇性，本培育基宜于當天制備，第二天運用。7注：本培育基不需求高壓滅菌，在制備過程中不宜過分加熱，防止降低其選擇性，貯于室溫暗處，超越48 h會降低其選擇性，本培育基宜于當天制備，第二天運用。A.5 HE 瓊脂Hektoen Enteric AgarA.5.1成分 蛋白胨 12.0 g 牛肉膏3.0 g乳糖12.0 g蔗糖12.0 g水楊素 2 .

8、0 g 膽鹽20.0 g氯化鈉5.0 g瓊脂18.0 g20.0 g蒸餾水1 000 mL0.4溴麝香草酚藍溶液16.0 mLAndrade指示劑20.0 mL甲液20.0 mL乙液20.0 mLpH 7.50.2 8A.5.2 制法 將前面七種成分溶解于400 mL蒸餾水內(nèi)作為根底液;將瓊脂參與于600 mL蒸餾水內(nèi)。然后分別攪拌均勻，煮沸溶解。參與甲液和乙液于根底液內(nèi),調(diào)理pH。再參與指示劑,并與瓊脂液合并,待冷至50 55 傾注平皿。注:本培育基不需求高壓滅菌，在制備過程中不宜過分加熱，防止降低其選擇性。甲液的配制硫代硫酸鈉34.0 g檸檬酸鐵銨4.0 g蒸餾水100 mL乙液的配制去氧

9、膽酸鈉 10.0 g 蒸餾水 100 mL Andrade 指示劑酸性復紅 0.5 g 1mol/L氫氧化鈉溶液 16.0 mL 蒸餾水 100 mL 將復紅溶解于蒸餾水中,參與氫氧化鈉溶液。數(shù)小時后如復紅褪色不全,再加氫氧化鈉溶液1 mL2 mL。96、木糖賴氨酸脫氧膽鹽XLD瓊脂 A.6.1成分 酵母膏3.0 gL-賴氨酸5.0 g木糖3.75 g乳糖7.5 g蔗糖7.5 g去氧膽酸鈉2.5 g檸檬酸鐵銨0.8 g硫代硫酸鈉6.8 g氯化鈉5.0 g瓊脂15.0 g酚紅0.08 g蒸餾水1 000 mLpH 7.40.2 A.6.2制法 除酚紅和瓊脂外，將其他成分參與400 mL蒸餾水中，

10、煮沸溶解，調(diào)理pH。另將瓊脂參與600 mL蒸餾水中，煮沸溶解。將上述兩溶液混合均勻后，再參與指示劑，待冷至50 55 傾注平皿。注:本培育基不需求高壓滅菌，在制備過程中不宜過分加熱，防止降低其選擇性，貯于室溫暗處。本培育基宜于當天制備，第二天運用。10A.7 三糖鐵TSI瓊脂 A.7.1成分 蛋白胨20.0 g牛肉膏5.0 g乳 糖10.0 g蔗 糖10.0 g葡萄糖1.0 g硫酸亞鐵銨含6個結(jié)晶水0.2 g酚 紅0.025 g或5.0 g/L溶液5.0 mL氯化鈉5.0 g硫代硫酸鈉0.2 g瓊 脂12.0 g蒸餾水1 000 mL pH 7.40.2 A.7.2 制法 除酚紅和瓊脂外，將

11、其他成分參與400 mL蒸餾水中，煮沸溶解，調(diào)理pH。另將瓊脂參與600 mL蒸餾水中，煮沸溶解。將上述兩溶液混合均勻后，再參與指示劑，混勻，分裝試管，每管約2 mL4 mL，高壓滅菌121 10 min或115 15 min，滅菌后置成高層斜面，呈桔紅色。11A.8 蛋白胨水、靛基質(zhì)試劑 A.8.1 蛋白胨水 蛋白胨或胰蛋白胨 20.0 g 氯化鈉 5.0 g 蒸餾水1 000 mLpH 7.40.2 將上述成分參與蒸餾水中，煮沸溶解，調(diào)理pH，分裝小試管,121 高壓滅菌15 min。A.8.2 靛基質(zhì)試劑A.8.2.1 柯凡克試劑：將5 g對二甲氨基甲醛溶解于75 mL戊醇中,然后緩慢參

12、與濃鹽酸25 mL。A.8.2.2 歐-波試劑：將1 g對二甲氨基苯甲醛溶解于95 mL95乙醇內(nèi)。然后緩慢參與濃鹽酸20 mL。A.8.3 實驗方法挑取小量培育物接種,在36 1 培育1 d2 d，必要時可培育4 d5 d。參與柯凡克試劑約0.5 mL，輕搖試管,陽性者于試劑層呈深紅色；或參與歐-波試劑約0.5 mL，沿管壁流下，覆蓋于培育液外表,陽性者于液面接觸處呈玫瑰紅色。注：蛋白胨中應(yīng)含有豐富的色氯酸。每批蛋白胨買來后，應(yīng)先用知菌種鑒定后方可運用。129 尿素瓊脂pH 7.2 A.9.1成分 蛋白胨1.0 g氯化鈉5.0 g葡萄糖1.0 g磷酸二氫鉀2.0 g0.4酚 紅3.0 mL瓊

13、 脂20.0 g蒸餾水1 000 mL20%尿素溶液 100 mL pH7.20.2 A.9.2制法 除尿素、瓊脂和酚紅外，將其他成分參與400 mL蒸餾水中，煮沸溶解，調(diào)理pH。另將瓊脂參與600 mL蒸餾水中，煮沸溶解。將上述兩溶液混合均勻后，再參與指示劑后分裝，121 高壓滅菌15 min。冷至50 55 ,參與經(jīng)除菌過濾的尿素溶液。尿素的最終濃度為2。分裝于無菌試管內(nèi)，放成斜面?zhèn)溆?。A.9.3實驗方法 挑取瓊脂培育物接種,在36 1 培育24 h，察看結(jié)果。尿素酶陽性者由于產(chǎn)堿而使培育基變?yōu)榧t色。13.10 氰化鉀 KCN 培育基 A.10.1成分 蛋白胨10.0 g氯化鈉5.0 g磷

14、酸二氫鉀0.225 g磷酸氫二鈉5.64 g蒸餾水1 000 mL0.5氰化鉀20.0 mLA.10.2 制法 將除氰化鉀以外的成分參與蒸餾水中，煮沸溶解，分裝后121 高壓滅菌15 min。放在冰箱內(nèi)使其充分冷卻。每100 mL培育基參與0.5氰化鉀溶液2.0 mL最后濃度為1:10 000，分裝于無菌試管內(nèi),每管約4 mL,立刻用無菌橡皮塞塞緊,放在4 冰箱內(nèi),至少可保管兩個月。同時，將不加氰化鉀的培育基作為對照培育基,分裝試管備用。A.10.3 實驗方法 將瓊脂培育物接種于蛋白胨水內(nèi)成為稀釋菌液，挑取1環(huán)接種于氰化鉀KCN培育基。并另挑取1環(huán)接種于對照培育基。在36 1 培育1 d2 d

15、，察看結(jié)果。如有細菌生長即為陽性不抑制，經(jīng)2 d細菌不生長為陰性抑制。注:氰化鉀是劇毒藥,運用時應(yīng)小心，切勿沾染，以免中毒。夏天分裝培育基應(yīng)在冰箱內(nèi)進展。實驗失敗的主要緣由是封口不嚴,氰化鉀逐漸分解，產(chǎn)生氫氰酸氣體逸出，以致藥物濃度降低，細菌生長，因此呵斥假陽性反響。實驗時對每一環(huán)節(jié)都要特別留意。14A.11 賴氨酸脫羧酶實驗培育基 A.11.1成分 蛋白胨5.0 g酵母浸膏3.0 g葡萄糖1.0 g蒸餾水1 000 mL 1.6溴甲酚紫-乙醇溶液1.0 mLL-賴氨酸或DL-賴氨酸 0.5 g/100 mL或1.0 g/100 mLpH 6.80.2 A.11.2制法 除賴氨酸以外的成分加熱

16、溶解后,分裝每瓶100 mL，分別參與賴氨酸。L-賴氨酸按0.5參與，DL-賴氨酸按1參與。調(diào)理pH。對照培育基不加賴氨酸。分裝于無菌的小試管內(nèi)，每管0.5 mL，上面滴加一層液體石蠟，115 高壓滅菌10 min。A.11.3實驗方法 從瓊脂斜面上挑取培育物接種，于36 1 培育18 h24 h，察看結(jié)果。氨基酸脫羧酶陽性者由于產(chǎn)堿，培育基應(yīng)呈紫色。陰性者無堿性產(chǎn)物，但因葡萄糖產(chǎn)酸而使培育基變?yōu)辄S色。對看管應(yīng)為黃色。15A.12 糖發(fā)酵管 A.12.1成分 牛肉膏5.0 g蛋白胨10.0 g氯化鈉3.0 g磷酸氫二鈉含12個結(jié)晶水2.0 g0.2溴麝香草酚藍溶液12.0 mL蒸餾水1 000

17、 mLpH 7.40.2 A.12.2 制法 A.12.2.1葡萄糖發(fā)酵管按上述成分配好后，調(diào)理pH。按0.5參與葡萄糖，分裝于有一個倒置小管的小試管內(nèi)，121 高壓滅菌15 min。A.12.2.2 其他各種糖發(fā)酵管可按上述成分配好后,分裝每瓶100 mL，121 高壓滅菌15 min。另將各種糖類分別配好10溶液，同時高壓滅菌。將5 mL糖溶液參與于100 mL培育基內(nèi)，以無菌操作分裝小試管。注：蔗糖不純,加熱后會自行水解者，應(yīng)采用過濾法除菌。A.12.3 實驗方法:從瓊脂斜面上挑取小量培育物接種，于36 1 培育,普通2 d3 d。緩慢反響需察看14 d30 d。16A.13 ONPG

18、培育基 A.13.1 成分 鄰硝基酚-D半乳糖苷ONPGO-Nitrophenyl-D-galactopyranoside60.0 mg0.01mol/L磷酸鈉緩沖液pH7.5 10.0 mL 1蛋白胨水pH7.5 30.0 mL A.13.2制法 將ONPG溶于緩沖液內(nèi)，參與蛋白胨水，以過濾法除菌，分裝于無菌的小試管內(nèi)，每管0.5 mL，用橡皮塞塞緊。A.13.3實驗方法 自瓊脂斜面上挑取培育物1滿環(huán)接種于36 1 培育1 h3 h和24 h察看結(jié)果。假設(shè)-半乳糖苷酶產(chǎn)生，那么于1 h3 h變黃色，如無此酶那么24 h不變色。17A.14 半固體瓊脂 A.14.1成分 牛肉膏0.3 g蛋白胨

19、1.0 g氯化鈉0.5 g瓊脂0.35g0.4 g蒸餾水100 mLpH 7.40.2 A.14.2 制法 按以上成分配好,煮沸溶解,調(diào)理pH。分裝小試管。121 高壓滅菌15 min。直立凝固備用。注:供動力察看、菌種保管、H抗原位相變異實驗等用。18A.15 丙二酸鈉培育基 A.15.1成分 酵母浸膏1.0 g 硫酸銨 2.0 g 磷酸氫二鉀 0.6 g 磷酸二氫鉀 0.4 g 氯化鈉 2.0 g 丙二酸鈉 3.0 g 0.2溴麝香草酚藍溶液12.0 mL 蒸餾水1 000 mL pH 6.80.2 A.15.2制法 除指示劑以外的成分溶解于水，調(diào)理pH，再參與指示劑，分裝試管，121 高

20、壓滅菌15 min。A.15.3實驗方法 用新穎的瓊脂培育物接種，于36 1 培育48 h，察看結(jié)果。陽性者由綠色變?yōu)樗{色。 194 檢驗程序 205 操作步驟 5.1 前增菌 稱取25 gmL樣品放入盛有225 mL BPW的無菌均質(zhì)杯中，以8 000 r/min10 000 r/min均質(zhì)1 min2 min，或置于盛有225 mL BPW的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1 min2 min。假設(shè)樣品為液態(tài)，不需求均質(zhì)，振蕩混勻。如需測定pH值，用1 mol/mL無菌NaOH或HCl調(diào)pH 至6.80.2。無菌操作將樣品轉(zhuǎn)至500 mL錐形瓶中，如運用均質(zhì)袋，可直接進展培育，于36 1

21、培育8 h18h。如為冷凍產(chǎn)品,應(yīng)在45 以下不超越15 min,或2 5 不超越18 h解凍5.2 增菌 悄然搖動培育過的樣品混合物，移取1 mL，轉(zhuǎn)種于10 mL TTB 內(nèi)，于421 培育18 h24 h。同時，另取1 mL，轉(zhuǎn)種于10 mL SC內(nèi)，于36 1 培育18 h24 h。215.3 分別 22232425265.5 血清學鑒定 5.5.1 抗原的預備 普通采用1.21.5瓊脂培育物作為玻片凝集實驗用的抗原。O血清不凝集時，將菌株接種在瓊脂量較高的 如23 培育基上再檢查；假設(shè)是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反響時，可挑取菌苔于1 mL生理鹽水中做成濃菌液，于酒精燈火焰上煮

22、沸后再檢查。H抗原發(fā)育不良時，將菌株接種在0.550.65半固體瓊脂平板的中央，俟菌落蔓延生長時，在其邊緣部分取菌檢查；或?qū)⒕杲?jīng)過裝有0.30.4半固體瓊脂的小玻管1次2次，自遠端取菌培育后再檢查。5.5.2 多價菌體抗原O鑒定 在玻片上劃出2個約1 cm2 cm的區(qū)域，挑取1環(huán)待測菌，各放1/2環(huán)于玻片上的每一區(qū)域上部，在其中一個區(qū)域下部加1滴多價菌體O抗血清，在另一區(qū)域下部參與1滴生理鹽水，作為對照。再用無菌的接種環(huán)或針分別將兩個區(qū)域內(nèi)的菌落研成乳狀液。將玻片傾斜搖動混合1 min，并對著黑暗背景進展察看，任何程度的凝集景象皆為陽性反響。5.5.3 多價鞭毛抗原H鑒定 同5.5.2。27

23、5.5.4 血清學分型選做工程 5.5.4.1 O 抗原的鑒定 用AF多價O血清做玻片凝集實驗，同時用生理鹽水做對照。在生理鹽水中自凝者為粗糙形菌株，不能分型。被AF多價O血清凝集者，依次用O4；O3、O10；O7；O8；O9；O2和O11因子血清做凝集實驗。根據(jù)實驗結(jié)果，斷定O群。被O3、O10血清凝集的菌株，再用O10、O15、O34、O19單因子血清做凝集實驗，斷定E1、E2、E3、E4各亞群，每一個O抗原成分的最后確定均應(yīng)根據(jù)O單因子血清的檢查結(jié)果，沒有O單因子血清的要用兩個O復合因子血清進展核對。不被AF多價O血清凝集者，先用9種多價O血清檢查，如有其中一種血清凝集，那么用這種血清所

24、包括的O群血清逐一檢查，以確定O群。每種多價O血清所包括的O因子如下：O多價1 A，B，C，D，E，F(xiàn)，群 并包括6,14群O多價2 13，16，17，18，21群O多價3 28，30，35，38，39群O多價4 40，41，42，43群O多價5 44，45，47，48群O多價6 50，51，52，53群O多價7 55，56，57，58群O多價8 59，60，61，62群O多價9 63，65，66，67群2829不常見的菌型，先用8種多價H血清檢查，如有其中一種或兩種血清凝集，那么再用這一種或兩種血清所包括的各種H因子血清逐一檢查，以第1相和第2項的H抗原。8種多價H血清所包括的H因子如下：H

25、多價1 a，b，c，d，i H多價2 eh，enx，enz15，fg，gms，gpu，gp，gq，mt，gz51H多價3 k，r，y，z，z10，lv，lw，lz13，lz28，lz40H多價4 1,2；1,5；1,6；1,7；z6H多價5 z4z23，z4z24，z4z32，z29，z35，z36，z38H多價6 z39，z41，z42，z44H多價7 z52，z53，z54，z55H多價8 z56，z57，z60，z61，z62每一個H抗原成分的最后確定均應(yīng)根據(jù)H單因子血清的檢查結(jié)果，沒有H單因子血清的要用兩個H復合因子血清進展核對。檢出第1相H抗原而未檢出第2相H抗原的或檢出第2相H抗原而未檢出第1相H抗原的,可在瓊脂斜面上移種12代后