基因工程技術(shù)在改進(jìn)微生物菌種方面的應(yīng)用ppt課件

1、基因工程技術(shù)在改良微生物菌種方面的運(yùn)用基因工程技術(shù)在改良微生物菌種方面的運(yùn)用主要運(yùn)用主要運(yùn)用: 1. 提高次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量提高次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量 2. 改良代謝產(chǎn)物的組分改良代謝產(chǎn)物的組分 3. 改良菌種的生理性能改良菌種的生理性能 4. 產(chǎn)生新的代謝產(chǎn)物產(chǎn)生新的代謝產(chǎn)物 (一一) 提高次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量提高次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量基因工程技術(shù)提高抗生素產(chǎn)量的主要手段基因工程技術(shù)提高抗生素產(chǎn)量的主要手段1. 添加限速酶的基因拷貝數(shù)添加限速酶的基因拷貝數(shù)2. 添加正調(diào)理基因添加正調(diào)理基因,去除負(fù)調(diào)理基因去除負(fù)調(diào)理基因3. 添加抗性基因的拷貝數(shù)添加抗性基因的拷貝數(shù)1. 1. 添加限速酶的基因拷貝數(shù)添加

2、限速酶的基因拷貝數(shù)原理： Ea Eb Ec Ed A B C D E ( 代謝產(chǎn)物 限速酶 Rate-limiting Bottleneck Ea Eb Ec 例1: 起始原料 ACV三肽 異青霉素N 青霉素 -aminoadipic acid L-cysteine Ea: ACV合成酶 Ec:異青霉素N酰基水解酶 L-valine Eb:異青霉素N合成酶 青霉素?；D(zhuǎn)移酶 異青霉素異青霉素N N合成酶對(duì)合成酶對(duì)P.chrysogenumP.chrysogenum青霉素產(chǎn)量的影響青霉素產(chǎn)量的影響 菌株 原始菌株 低產(chǎn)菌株 高產(chǎn)菌株 Wis 54-1255 AS-P-78 IPNS 的基 1 -

3、 9-14 因拷貝數(shù) mRNA量 1 - 32-64 青霉素產(chǎn)量 100% 導(dǎo)入帶IPNS 140% 的基因片段 添加添加IPNS基因提高青霉素產(chǎn)量基因提高青霉素產(chǎn)量轉(zhuǎn)化青霉素產(chǎn)生菌 Wis54-1255轉(zhuǎn)化菌株轉(zhuǎn)化菌株青霉素青霉素V產(chǎn)量產(chǎn)量提高提高40%例例2. 頭孢菌素頭孢菌素C生物合成的限速酶生物合成的限速酶 在頭孢菌素C 的工業(yè)發(fā)酵消費(fèi)中，人們發(fā)現(xiàn)發(fā)酵終了后在得到的發(fā)酵液中，除了主要產(chǎn)物是頭孢菌素C外，在發(fā)酵液中還積累另一種產(chǎn)物-青霉素N。 問題：積累中間產(chǎn)物-青霉素N 緣由：下一步反響為限速酶反響 處理：導(dǎo)入額外的擴(kuò)環(huán)酶/羥化酶基因 結(jié)果：使頭孢菌素C的產(chǎn)量提高 25-50%， 積累

4、的青霉素N消逝。 添加限速酶基因提高頭孢菌素添加限速酶基因提高頭孢菌素C產(chǎn)量產(chǎn)量轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化C.acremonium394-4 轉(zhuǎn)化后菌株轉(zhuǎn)化后菌株頭孢菌素頭孢菌素C產(chǎn)量提高產(chǎn)量提高25-50%添加限速酶的其它例子添加限速酶的其它例子-3:例3. 十一烷基靈菌紅素 產(chǎn)生菌:天藍(lán)色鏈霉菌 S.colicolorA3(2)NOHHN(CH2)10CH3HNNOCH3HN(CH2)10CH3HNacetyl CoA polyketide pathway 氧甲基轉(zhuǎn)移酶氧甲基轉(zhuǎn)移酶S-腺苷甲硫氨酸構(gòu)建重組質(zhì)粒構(gòu)建重組質(zhì)粒(帶甲氧基轉(zhuǎn)移酶帶甲氧基轉(zhuǎn)移酶)轉(zhuǎn)化到氧甲基轉(zhuǎn)移酶缺陷變株轉(zhuǎn)化到氧甲基轉(zhuǎn)移酶缺陷變株 轉(zhuǎn)

5、化菌株轉(zhuǎn)化菌株十一烷基靈菌紅素產(chǎn)量提高十一烷基靈菌紅素產(chǎn)量提高5倍倍添加限速酶的其它例子添加限速酶的其它例子-4:例4. 泰洛星 (Tylosin) 產(chǎn)生菌:弗氏鏈霉菌 (S.fradiae)acetyl CoA + malonyl CoA polyketide pathway大菌素大菌素macrocin) 甲氧基轉(zhuǎn)移酶甲氧基轉(zhuǎn)移酶 Tylosin構(gòu)建重組質(zhì)粒構(gòu)建重組質(zhì)粒(帶甲氧基轉(zhuǎn)移酶帶甲氧基轉(zhuǎn)移酶)轉(zhuǎn)化到弗氏鏈霉菌轉(zhuǎn)化到弗氏鏈霉菌 (S.fradiae) 轉(zhuǎn)化菌株轉(zhuǎn)化菌株泰洛星泰洛星 (Tylosin) 產(chǎn)量顯著提高產(chǎn)量顯著提高2.添加正調(diào)理基因添加正調(diào)理基因, 去除負(fù)調(diào)理基因去除負(fù)調(diào)理基

6、因 調(diào)理基因根據(jù)其作用的不同分為正調(diào)理和負(fù)調(diào)理。正調(diào)理促進(jìn)生物合成構(gòu)造基因的轉(zhuǎn)錄，負(fù)調(diào)理阻扼構(gòu)造基因的轉(zhuǎn)錄。 將帶有正調(diào)理基因片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到消費(fèi)菌株中，由于轉(zhuǎn)錄功能的加強(qiáng)，使生物合成構(gòu)造基因得以高程度的表達(dá)，提高了代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。 反之，對(duì)于負(fù)調(diào)理基因，經(jīng)過(guò)基因工程的手段，將其祛除或失活，就能解除阻扼作用，同樣導(dǎo)致使生物合成構(gòu)造基因高程度的表達(dá)，提高代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。調(diào)理基因在次級(jí)代謝產(chǎn)物合成中的作用調(diào)理基因在次級(jí)代謝產(chǎn)物合成中的作用 次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因簇內(nèi)的正負(fù)調(diào)理基因次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因簇內(nèi)的正負(fù)調(diào)理基因 基因基因 效應(yīng)效應(yīng) 菌株菌株 次級(jí)代謝產(chǎn)物次級(jí)代謝產(chǎn)物 功功 能能 b

7、rpA 正 吸水鏈霉菌 Bialaphos 激活 bar ( Bialaphos 抗性)基因和 6 個(gè) bap (生物合成)基因的轉(zhuǎn)錄 tylG 正 弗氏鏈霉菌 泰洛星 激活 tyl F( 編碼 MOMT) 和其它 tyl 生物合成基因的表達(dá) actII 正 天藍(lán)色鏈霉菌 放線紫紅素 能使 act 菌株放線紫紅素的產(chǎn) 量添加30 40 倍 mmy 負(fù) 天藍(lán)色鏈霉菌 次甲霉素 該基因的插入失活導(dǎo)致次甲霉 素過(guò)量消費(fèi) strR 正 灰色鏈霉菌 鏈霉素 調(diào)理鏈霉素的生物合成 . 去除負(fù)調(diào)理基因使構(gòu)造基因超量表達(dá)去除負(fù)調(diào)理基因使構(gòu)造基因超量表達(dá)CH2H3CH3COCOOHOMethylenomycin

8、次甲霉素次甲霉素是由天藍(lán)色鏈霉菌產(chǎn)生的抗生素，研討結(jié)果闡明，次甲霉素是由天藍(lán)色鏈霉菌攜帶的質(zhì)粒SCP I 編碼的。在其生物合成構(gòu)造基因的上游，存在一個(gè)負(fù)調(diào)理基因-mmy。 克隆到質(zhì)粒上 轉(zhuǎn)化變青鏈霉菌 轉(zhuǎn)化子 次甲霉素高產(chǎn)表達(dá)mmy3.添加抗性基因的拷貝數(shù)添加抗性基因的拷貝數(shù) 抗性基因的作用是防止抗生素產(chǎn)生菌被本身產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物所殺滅。其作用可經(jīng)過(guò)三條途徑實(shí)現(xiàn)：1.抗性基因產(chǎn)物(酶)將抗生素作用的底物加以修飾; 2.將抗生素的分子構(gòu)造加以修飾,使其失活; 3.將抗生素分子排出細(xì)胞外。 提高菌種耐受本身產(chǎn)生抗生素的才干是獲得高產(chǎn)的前提，此外，將胞內(nèi)的抗生素排出胞外，還可以解除高濃度代謝產(chǎn)物對(duì)其生

9、物合成的反響調(diào)理，使產(chǎn)物大量合成。 將抗生素抗性基因片段銜接到適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒上，用得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化抗生素消費(fèi)菌株，就能夠使抗生素的產(chǎn)量得以提高。 添加抗性基因拷貝提高抗生素添加抗性基因拷貝提高抗生素的產(chǎn)量的產(chǎn)量例例1. Davies J. 利用鏈霉菌質(zhì)粒利用鏈霉菌質(zhì)粒pIJ702 從卡那霉素產(chǎn)生菌克隆了從卡那霉素產(chǎn)生菌克隆了6-N-氨基糖氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶苷乙酰轉(zhuǎn)移酶AAC6的基因的基因(aacA),該基因產(chǎn)物在乙酰輔酶該基因產(chǎn)物在乙酰輔酶A的存在下的存在下,可將氨可將氨基糖苷類抗生素的氨基糖基糖苷類抗生素的氨基糖6乙?；?。乙?；?。. 將將aacA基因轉(zhuǎn)入新霉素和卡那霉素的基因轉(zhuǎn)入新霉素和卡那霉

10、素的產(chǎn)生菌中產(chǎn)生菌中, 結(jié)果顯著提高了抗生素的產(chǎn)量結(jié)果顯著提高了抗生素的產(chǎn)量. 轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化子- 鏈霉菌細(xì)胞 氨基糖苷類抗生素產(chǎn)量提高卡那霉素卡那霉素6-乙酰轉(zhuǎn)移酶乙酰轉(zhuǎn)移酶AAC6 的作用的作用OR2OHOHOR1-H2CNHNH2OCH2OHOHNH2HOHOR3AAC(6)AAC(3)AAC(4)APH(3)AAC(2)APH(2)ANT(2)R1R2R3卡那霉素 A NH2NH2NH2NH2NH2NH2OHOHHHHH卡那霉素 B卡那霉素 C妥布霉素AACAminoglycoside acetyltransferases APH A minoglycoside phosphotrasfe

11、rasesANT Aminoglycoside necleotide transferases添加抗性基因拷貝提高抗生素的產(chǎn)量添加抗性基因拷貝提高抗生素的產(chǎn)量-2例例2. 螺旋霉素抗性基因螺旋霉素抗性基因srmB 重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 S.ambofaciens生二素鏈霉菌生二素鏈霉菌 轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化子 使螺旋霉素產(chǎn)量提高。使螺旋霉素產(chǎn)量提高。 (二二) 改良代謝產(chǎn)物的組分改良代謝產(chǎn)物的組分 鏈霉菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物經(jīng)常是一組構(gòu)造類似的混合物。每個(gè)化合物稱為它的一個(gè)組分。多組分產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)是由于次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成酶對(duì)底物的選擇性不強(qiáng)以及合成途徑中分支途徑的存在。 經(jīng)過(guò)基因工程手段，滅活某分

12、支途徑的酶，就可以去除該分之支途徑的產(chǎn)物。此戰(zhàn)略常用來(lái)去除發(fā)酵產(chǎn)物中的無(wú)用組分，提高有用組分的含量。例一例一: 阿維菌素產(chǎn)生菌的基因改造阿維菌素產(chǎn)生菌的基因改造OYCH3R2HCH3HOHOCH3CH3OOHCH3OHCH3CH3OOOHHCH3OR1OHCH3OXA1a CH3C2H5CHCH A1b CH3CH3R1R2X-Y A2a CH3C2H5A2b CH3CH3CH2CH OHHCHCH CH2CH OHC2H5CH3C2H5CH3B1a B1b B2a B2b HHH阿維菌素阿維菌素“B組分轉(zhuǎn)化成組分轉(zhuǎn)化成“A組分的分子根組分的分子根底底OYCH3R2HCH3HOHOCH3CH3

13、OOHCH3OHCH3CH3OOOHHCH3OHCH3OXOHOYCH3R2HCH3HOHOCH3CH3OOHCH3OHCH3CH3OOOHHCH3OHCH3OXOCH3阿維菌素“B組分阿維菌素“A組分aveDC5-氧甲基轉(zhuǎn)移酶阿維菌素阿維菌素C5位的甲基化位的甲基化CCOOHH2NHCH2CH2SCH3CH2HOHHOH OHHNNNH2NHCNS-腺苷甲硫氨酸+CCOOHH2NHCH2CH2SCH2HOHHOH OHHNNNH2NHCNS-腺苷高半胱氨酸 ATP 轉(zhuǎn)甲基酶 aveD“B 組分組分HCH3OHOH53HCH3OHOCH353“A 組組分分OCH3 0 10 20 30 40

14、50 60 70 80 kb BamHI map AveA1 aveA2 aveA3 aveA4 aveR aveB aveB aveB aveB aveF aveD aveC aveE orf1 aveB aveB aveB aveB 圖 3 阿弗菌素生物合成基因簇的物理基因圖譜 阿維菌素生物合成基因簇1.用基因工程手段滅活用基因工程手段滅活C5-氧甲基轉(zhuǎn)移酶基氧甲基轉(zhuǎn)移酶基因因主要過(guò)程：克隆阿維菌素生物合成的aveD基因構(gòu)建 gene disruption 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化阿維菌素產(chǎn)生菌(S.avermitilis)挑選雙交換菌株陽(yáng)性菌株的發(fā)酵發(fā)酵產(chǎn)物的組分分析(HPLC, 質(zhì)譜)Disrupti

15、on plasmid of aveD gene雙交換菌株阻斷變株的挑選雙交換菌株阻斷變株的挑選 2 雙雙交交換換菌菌株株（阻阻斷斷變變株株）的的挑挑選選 轉(zhuǎn)入 28 3-5 天 MS MYM+Am 單孢子懸液 涂布 28 轉(zhuǎn)入 3-5 天 MYM （1-3 代） MYM+Am MYM+Am MYM+Am+Tsr 黑色為雙交換菌落代表 圖 2-2 雙交換菌株的篩選 Fig. 2-2 Selection of double cross-over Strepomyces avermitilis colonies 發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC分析分析 control AveD24 A2a B1a A1

16、a B2a D24-1 B1a D24-2 B2a D24-1組分的質(zhì)譜分析組分的質(zhì)譜分析cheng024_1 #96 RT: 1.70 AV: 1 NL: 8.70E7T: + c Full ms 150.00-2000.00200400600800100012001400160018002000m/z05101520253035404550556065707580859095100Relative Abundance813.6829.6432.2808.3529.3845.8415.21282.8437.31516.6847.7959.31377.61879.01572.8404.2465

17、.11276.51781.4691.01159.6717.61025.5608.81390.0369.31265.41638.4 1723.21129.81990.2361.3303.3m/z813M+Na +, D24-1的分子質(zhì)量為790。與107#菌株發(fā)酵液主組分oligmycinA的分子量一致。將兩菌株發(fā)酵液提取物混合后進(jìn)樣，根據(jù)在HPLC分析中D24-1組分和菌株Ave107#的主峰相重合，可以推測(cè)D24-1組分為oligmycinA。2. 只產(chǎn)只產(chǎn)Avermectin “2組分基因工程菌的構(gòu)建組分基因工程菌的構(gòu)建 OHOCH3CH3OOHCH3OHCH3CH323222512345

18、12761089111315192117OOOHHCH3OHCH3OOR1OCH3R2HCH3HOHCH3R2HCH3HOOOHHCH3OHCH3OHOOR1OHOCH3CH3OOHCH3OHCH3CH32322251234512761089111315192117aveC 脫水酶阿維菌素“2組分阿維菌素“1組分aveC基因基因在染在染色體色體上的上的位置位置 圖 1-7 aveC,aveE 基因在阿維鏈霉菌生物合成基因簇中的位置32 Fig.1-7 The location of aveC,aveE genes in AVM biosynthesis gene cluster 重重組組質(zhì)質(zhì)粒

19、粒的的構(gòu)構(gòu)建建 pC04 Bgl II pC05 圖 1-8 質(zhì)粒 pC05 的構(gòu)建過(guò)程 Fig .1-8 The procedures in the construction of plasmid pC05 pC03 Ligase 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化阿維菌素產(chǎn)生菌 tsrR amRtsrR amRGene replacement (基因置換基因置換 DBB C am CaveCaveCam tsrR amR aveC+ tsrS amR aveC遺傳型的改動(dòng)遺傳型的改動(dòng) B amaveCamaveC tsrR amR aveC tsrS amR aveC 傳幾代后，丟掉質(zhì)粒

20、基因工程菌AveC9基因工程菌基因工程菌AveC-9發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC分析分析 control 基因工程菌AveC9 圖 3-8 阿維鏈霉菌 aveC 基因阻斷變株產(chǎn)物的 HPLC 分析 B2a A2a B1a A1a B2a A2a 例二例二. 黑暗鏈霉菌的基因改造黑暗鏈霉菌的基因改造 黑暗鏈霉菌首先是從墨西哥土壤中分別得到的， 1967由美國(guó)禮萊公司Eli Lilly Co.最初報(bào)道了黑暗鏈霉菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物-尼拉霉素復(fù)合物，它包括1、1、2、3、4、5、5、6、7等15個(gè)組分。其中組分2、4、5為尼拉霉素的主組分，其他組分為小組分。組分2為安普霉素Apramycin，組分4為6

21、-O-氨甲酰卡那霉素B6-O-Carbamoylkanamycin B，CKB，組分5為6-O-氨甲酰托普霉素6-O-Carbamoyltobramycin，CTB3 七八十年代，我國(guó)中科院微生物所與四川抗生素工業(yè)研討所先后分別到黑暗鏈霉菌的新菌株：黑暗鏈霉菌4107與黑暗鏈霉菌83-1050B8，它們的組分中含有尼拉霉素組分2、4、5。經(jīng)過(guò)“七五攻關(guān)中挑選到了只產(chǎn)組分2Apramycin、5 6-O-Carbamoyltobramycin，CTB的菌株U-9。黑暗鏈霉菌黑暗鏈霉菌S.tenebrarius菌株菌株U-產(chǎn)生的兩種主要抗生素產(chǎn)生的兩種主要抗生素HCOHNNH2OHOONH2HONH2OOHONH2OHCH2OHOH2NCH2OHOHOHOONHCH3OHONH2OHOOHNH2H2N妥布霉素妥布霉素(Tobramycin) 妥布霉素是氨基糖苷類抗生素，它是黑暗鏈霉菌S.tenebrarius產(chǎn)生的尼拉霉素復(fù)合物的組份5 。它對(duì)革蘭式陰性菌有很高的抗菌活性。特別是對(duì)綠膿桿菌有獨(dú)特的抗菌作用，因此常用來(lái)治療燒傷后的綠膿桿菌感染。 臨