EM(有效微生物)組成的分類鑒定實驗

1、EM（有效微生物）組成的分類鑒定實驗 研究思路：從 EM 原液中取出菌液，在適合不同菌種生長的固體培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)分離，分離后的純菌種接種到液體培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，從而鑒定 EM有效微生物的組成。1 實驗材料與方法1.1 實驗材料1.1.1 菌種來源 菌種來源：商品用 EM 原露，江西省天意生物技術開發(fā)有限公司產(chǎn)品。1.1.2 培養(yǎng)基 微生物的營養(yǎng)物 微生物需要的營養(yǎng)物質有水、碳素營養(yǎng)源、氮素營養(yǎng)源、無機鹽及生長因子。 水是微生物的組分，又是微生物代謝過程中必不可少的溶劑。它有助于營養(yǎng)物質的溶解和吸收，保證細胞內(nèi)、外各種生物化學反應在溶液中正常進行。 碳源和能源：凡能供給微生物碳素營養(yǎng)的物質

2、，稱為碳源。碳源的主要作用是構成微生物細胞的含碳物質（碳架）和供給微生物生長、繁殖及運動所需要的能量。從簡單的無機碳化合物到復雜的有機含碳化合物，都可作為碳源。例如，糖類、脂肪、氨基酸、蛋白質、脂肪酸、丙酮酸、檸檬酸、淀粉、纖維素、半纖維素、果膠、木質素、醇類、醛類、烷烴類、芳香族化合物、氰化物（如氰化鉀、氰氫酸和丙烯脯）、各種低濃度的染料等。少數(shù)微生物還能以 CO2 或 CO3 中的碳素為唯一的或主要的碳源?？梢娮匀唤缰刑N藏著豐富的碳源。微生物最好的碳源是糖類，尤其是葡萄糖、蔗糖，它們最易被微生物吸收和利用。許多碳源可同時作能源。 微生物細胞中的碳素含量相當高，占干物質質量的 50%左右?？?/p>

3、見，微生物對碳素的需求量最大。根據(jù)微生物對各種碳素營養(yǎng)物的同化能力的不同，可把微生物分為無機營養(yǎng)微生物和有機營養(yǎng)微生物兩種。凡是有光合色素的微生物，例如藻類、光合細菌及原生動物中的植物性鞭毛蟲，均屬于無機營養(yǎng)微生物。大部分細菌、放線菌、酵母菌、霉菌、病毒等屬于有機營養(yǎng)微生物。無機營養(yǎng)也稱無機自養(yǎng)。這一類型的微生物具有完備的酶系統(tǒng)，合成有機物的能力強，CO2、CO 或 CO3 中的碳素為其唯一的碳源，能利用光能或化學能在細胞內(nèi)合成復雜的有機物，以構成自身的細胞成分。而不需要外界供給現(xiàn)成的有機碳化合物。因此，這類微生物又稱自養(yǎng)型微生物。根據(jù)能量來源的不同，自養(yǎng)型微生物又分為光能自養(yǎng)型微生物和化能自

4、養(yǎng)型微生物。其中，光能自養(yǎng)微生物能利用陽光（或燈光）作為能源，依靠體內(nèi)的光合色素，利用 CO2 和 H2O 或 H2S 合成有機物，構成自身細胞物質。而化能自養(yǎng)型微生物不具有光合色素，不能進行光合作用。合成有機物所需要的能量來自于它們氧化 S、H2S、H2、NH3、Fe 等時，通過氧化磷酸化產(chǎn)生的 ATP。CO2 是化能自養(yǎng)微生物的唯一碳源?；茏责B(yǎng)微生物有亞硝化細菌、硝化細菌、好氧的硫細菌（硫化細菌和硫磺細菌）及鐵細菌。自養(yǎng)微生物有嚴格自養(yǎng)微生物和兼性自養(yǎng)微生物兩種。有機營養(yǎng)微生物也稱為異養(yǎng)微生物。這類微生物具有的酶系統(tǒng)不如自養(yǎng)微生物完備，它們只能利用有機碳化合物作為碳素營養(yǎng)的能量來源。糖類

5、、脂肪、蛋白質、有機酸、醇、醛、酮及碳氫化合物、芳香族化合物等都可作為異養(yǎng)微生物的碳素營養(yǎng)。異養(yǎng)微生物有腐生性和寄生性兩種，前者占大多數(shù)。異養(yǎng)微生物又分光能異養(yǎng)微生物和化能異養(yǎng)微生物。光能異養(yǎng)微生物是以光為能源，以有機物為供氫體，還原 CO2，合成有機物的一類厭氧微生物，也稱為有機光合細菌?；墚愷B(yǎng)微生物是一群依靠氧化有機物產(chǎn)生化學能而獲得能量的微生物。它們包括大多數(shù)的細菌、放線菌及全部的真菌?；旌蠣I養(yǎng)微生物是既可以利用無機碳（CO2、CO 或 CO3 等）作為碳素營養(yǎng)， 又可以利用有機碳化合物作為碳素營養(yǎng)，即為兼性自養(yǎng)微生物。例如，氫細菌屬（Hydrogenmonas）、貝日阿托氏菌屬（Be

6、ggiatoa）、發(fā)硫菌屬（Thiothrix）、亮發(fā) 菌 屬 （ Leucothrix ）、 新 型 硫 桿 菌 （ Thiobacillius ）、 反 硝 化 硫 桿 菌（Thiobacillus denitrificans）、上述細菌既可以 S、H2S 為能源，也能以低濃度的乙酸鈉、琥珀酸及葡萄糖為能源和碳源。據(jù)報導，硝化細菌的某些株能以乙酸為碳源。 氮源：凡是能夠供給微生物氮素營養(yǎng)的物質稱為氮源。氮源有 N2、NH3、尿素、硫酸銨，硝酸銨、硝酸鈉、氨基酸和蛋白質等。氮源的作用是提供微生物合成蛋白質的原料。根據(jù)對氮源要求的不同，將微生物分為 4 類。固氮微生物：這類微生物能利用空氣中的

7、氮分子（N2）合成自身的氨基酸和蛋白質。如固氮菌、根瘤菌和固氮藍藻。利用無機氮作為氮源的微生物：能利用氨（NH3）、銨鹽（NH4 ）、亞硝酸鹽（NO2 ）、硝酸鹽（NO3 ）的微生物有亞硝化細菌、硝化細菌、大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌、枯草桿菌、銅綠色假單胞菌 、放線菌、霉菌、酵母菌及藻類等。需要某種氨基酸作為氮源的微生物：這類微生物叫氨基酸異養(yǎng)微生物。如乳酸細菌、丙酸細菌等。它們不能利用簡單的無機氮化合物合成蛋白質，而必須供給某些現(xiàn)成的氨基酸才能生長繁殖。從分解蛋白質中取得銨鹽或氨基酸的微生物：這類微生物如氨化細菌、霉菌、酵母菌及一些腐敗細菌，它們都有分解蛋白質的能力，產(chǎn)生 NH3、氨基酸和肽，進而合

8、成細胞蛋白質。 無機鹽：無機鹽的生理功能包括構成細胞組分；構成酶的組分和維持酶的活性；調(diào)節(jié)滲透壓、氫離子濃度、氧化還原電位等；供給自養(yǎng)微生物能源。微生物需要的無機鹽有磷酸鹽、硫酸鹽、氯化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽。這類無機鹽中含有鉀、鈉、鈣、鎂、鐵等元素。其中，微生物對磷和硫的需求量最大。此外，微生物還需要鋅、錳、鈷、鉬、銅、硼、釩、鎳等微量元素。微量元素是微生物維持正常生長發(fā)育所必需的，包括鋅、錳、鈷、鉬、銅、硼、釩、鎳等。它們極微量就可刺激微生物的生命活動。許多微量元素是酶的組分，或是酶的激活劑。微生物對微量元素的需求量極小，一般培養(yǎng)基中微量元素的質量濃度達到 0.1mg/L 就夠了。天然有機物

9、一般都含上述微量元素，當用它們配培養(yǎng)基時，不需再添加另外的微量元素。過量的微量元素會引起微生物中毒。單獨一種微量元素過量，其毒性更大。 生長因子：微生物在具有上述各種營養(yǎng)物質后仍生長不好，則需供給生長因子。微生物需要的生長因子有 B 族維生素、維生素 C、氨基酸、嘌呤、嘧啶、生物素及煙酸等。氨基酸被吸收后參與合成蛋白質。嘌呤和嘧啶進入細胞后，先轉變?yōu)楹塑蘸秃塑账?，進而參與合成核酸和輔酶。多數(shù)異養(yǎng)微生物及自養(yǎng)微生物有合成生長因子的能力。例如，酵母菌能合成核黃素，鏈霉菌和丙酸桿菌能合成維生素 B12。酵母浸出液、動物肝浸出液和麥芽浸出液含各種生長因子。 微生物的培養(yǎng)基根據(jù)各種微生物的營養(yǎng)要求，將水

10、、碳源、氮源、無機鹽及生長因子等物質按一定的比例配制而成的，用以培養(yǎng)微生物的基質，即培養(yǎng)基。按培養(yǎng)基組成物質的性質可以把培養(yǎng)基分為 3 類： 用無機化合物配制而成的培養(yǎng)基叫合成培養(yǎng)基。合成培養(yǎng)基中的各成分是已知結構的純化學物質（化學制劑）。 用天然有機物配制而成的培養(yǎng)基叫天然培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基中各成分是動物、植物或微生物的提取物。例如麥芽汁來自大麥芽、肉膏來自牛肉、酵母膏來自胰胨（tryptone）和酪胨（Casitone）。蛋白胨是土壤浸出液、豆芽汁、玉米粉、麩皮、牛奶、血清等天然物均可為微生物提供有機的和無機的營養(yǎng)。馬鈴薯、胡蘿卜是天然的固體培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)異養(yǎng)微生物。用天然有機物和無機化

11、合物配制而成的培養(yǎng)基叫復合培養(yǎng)基。硅膠可用于培養(yǎng)自養(yǎng)微生物。根據(jù)實驗目的和用途的不同，培養(yǎng)基可分為 4 類：基礎培養(yǎng)基；由牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉按一定比例配制而成。pH 堿性，大多數(shù)微生物均可在其上生長。選擇培養(yǎng)基；利用微生物對化學物質敏感程度的差異，在培養(yǎng)基中加入染料、膽汁酸鹽、金屬鹽類、酸、堿或抗生素等其中的一種，用以抑制非目的微生物的生長并使所要分離的微生物繁殖的培養(yǎng)基。例如，在培養(yǎng)基中加入膽汁酸鹽，可以抑制革蘭氏陽性菌，有利于革蘭氏陰性菌的生長。麥康蓋培養(yǎng)基為含膽汁酸鹽的糖發(fā)酵培養(yǎng)基，用于大腸菌群（革蘭氏陰性桿菌）的培養(yǎng)，可使腸道中革蘭氏陽性的腸球菌和產(chǎn)氣莢膜桿菌受抑制不能生長，從而，

12、大腸桿菌被選擇出來。乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基也是適于大腸菌群生長的選擇培養(yǎng)基。鑒別培養(yǎng)基；幾種細菌由于對培養(yǎng)基中某一成分的分解能力不同，其菌落通過指示劑顯示出不同的顏色而被區(qū)分開，這種起鑒別和區(qū)分不同細菌作用的培養(yǎng)基，叫鑒別培養(yǎng)基。例如，大腸菌群中的大腸埃希氏菌、枸櫞酸鹽桿菌、產(chǎn)氣桿菌、副大腸桿菌等均能在遠藤氏培養(yǎng)基上生長，但它們對乳糖的分解能力不同：前三者能分解乳糖，但分解能力有強有弱，大腸埃希氏菌分解能力最強，菌落呈紫紅色或深紅色；產(chǎn)氣桿菌第三，菌落呈淡紅色。副大腸桿菌不能分解乳糖，菌落無色透明。這樣，這四種菌被鑒別區(qū)分開來。常用的鑒別培養(yǎng)基還有醋酸鉛培養(yǎng)基、伊紅-藍美（EMB）培養(yǎng)基等。加富（富集

13、）培養(yǎng)基；由于樣品中細菌數(shù)量少，或是對營養(yǎng)要求比較苛刻不易培養(yǎng)出來，故用特別的物質或成分促使微生物快速生長。這種用特別物質或成分配制而成的培養(yǎng)基，稱為富集培養(yǎng)基。所用的物質有植物（青草或干草）提取液、動物組織提取液、血和血清等。 任何一種培養(yǎng)基均可配制成液體、半固體（凝膠）、固體三種。某種培養(yǎng)基按配方配好后不加凝固劑（如瓊脂、明膠、硅膠），即成液體培養(yǎng)基；如果每升培養(yǎng)基中加入 15-30g 瓊脂，即成為固體培養(yǎng)基；如果每升培養(yǎng)基中加入 3-5g瓊脂即成為半固體培養(yǎng)基。 分離所用的固體培養(yǎng)基組成： 肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(培養(yǎng)細菌)牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，氯化鈉 5g，瓊脂 15-20g，水 1

14、000mL，pH7.0-7.2， 1.05kg/cm2、121.3滅菌 20 分鐘。 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（培養(yǎng)酵母菌）馬鈴薯 40g，葡萄糖 4g，瓊脂 3-4g，水 200mL，自然 pH，0.1MPa 滅菌 20分鐘。 豆芽汁葡萄糖培養(yǎng)基（培養(yǎng)酵母菌）黃豆芽 10g，葡萄糖 5g，瓊脂 1.5-2g，水 100mL，自然 pH，0.1MPa 滅菌 20分鐘。 乳酸菌番茄汁培養(yǎng)基（培養(yǎng)乳酸菌）牛肉膏 1g，蛋白胨 1g，酵母膏 1g，葡萄糖 1g，番茄汁 20%，吐溫 80 0.05%，碳酸鈣 2g，溴甲酚綠 0.01%，瓊脂 1.5g，蒸餾水 100mL，pH6.5, 121.3滅菌20

15、分鐘。 光合細菌基本培養(yǎng)基 (培養(yǎng)光合細菌）氯化銨 0.1%，碳酸氫鈉 0.1%，醋酸鈉 0.3%，磷酸二氫鉀 0.03%，硫酸鎂 0.01%，酵母膏 0.05%，蛋白胨 0.05%，微量元素母液 0.1%，瓊脂 1.5-2g，自然 pH，121.3滅菌 20 分鐘115。 微量元素母液：七水合硫酸鎂 0.3g，磷酸二氫鉀 0.3g，七水合硫酸亞鐵0.005g，氯化鈣 0.005g，以上藥品溶于 100mL 水中，用自來水代替。 光合細菌富集培養(yǎng)基（培養(yǎng)光合細菌）七水合硫酸鎂 0.2g，氯化銨 1g，碳酸氫鈉 5g，磷酸氫二鉀 0.5g，氯化鈉2g，蛋白胨 1.5g，蒸餾水 1000mL，pH

16、7.2，121.3滅菌 20 分鐘。 光合細菌酵母膏培養(yǎng)基（培養(yǎng)光合細菌）酵母膏 3g，蛋白胨 3g，碳酸鈣 0.3g，硫酸鎂 0.5g，蒸餾水 1000mL，瓊脂20g，121.3滅菌 20 分鐘。 光合細菌生長因子培養(yǎng)基（培養(yǎng)光合細菌）酵母膏 3.0g，氯化鈣 0.3g，硫酸鎂 0.5g，瓊脂 20g，生長因子 5mL，加蒸餾水溶解并定容至 1000mL，pH7.0-8.0，115高壓滅菌 30 分鐘。 生長因子：維生素 B10.001mg，尼克丁酸 0.1mg，對氨基苯甲酸 0.1mg，生物素 0.001mg，以上藥品溶于蒸餾水中，定容至 10mL，然后過濾除菌。 馬丁培養(yǎng)基（培養(yǎng)絲狀菌

17、） 葡萄糖 1g，蛋白胨 0.5g，三水合磷酸二氫鉀 0.1g，七水合硫酸鎂 0.05g，孟加拉紅（1mg/mL）0.33mL，瓊脂 1.5-2g，水 100mL，自然 pH，0.056MPa 滅菌30 分鐘，加入 2%去氧膽酸鈉溶液 2mL，鏈霉素溶液 10000u/mL0.33mL。 高氏合成一號培養(yǎng)基（培養(yǎng)放線菌） 可溶性淀粉 2g，硝酸鉀 0.1g，三水合磷酸氫二鉀 0.05g，氯化鈉 0.05g，七水合硫酸鎂 0.05g，七水合硫酸亞鐵 0.001g，瓊脂 1.5-2g，蒸餾水 100mL，pH7.2-7.4，0.1MPa 滅菌 20 分鐘。 淀粉瓊脂培養(yǎng)基（培養(yǎng)放線菌） 淀粉 10

18、g/L，硝酸鉀 2g/L，磷酸氫二鉀 2g/L，氯化鈉 2g/L，瓊脂 15g/L，抑制劑重鉻酸鉀 50mg/L，0.1MPa 滅菌 20 分鐘。 土豆-胡蘿卜培養(yǎng)基（培養(yǎng)放線菌） 土豆 30g/L，胡蘿卜 2.5g/L，瓊脂 15g/L，抑制劑重鉻酸鉀 50mg/L，0.1MPa滅菌 20 分鐘。 乙醇培養(yǎng)基（培養(yǎng)乙酸菌） 乙醇 20mL，乙酸鈉 5g，酵母膏 1g，磷酸氫二鉀 0.4g，硫酸銨 0.5g，硫酸鎂 0.2g，碳酸鈣 10g，瓊脂 20g，水 1000mL，pH 為 7，0.1MPa 滅菌 20 分鐘。1.2 實驗方法1.2.1 固體培養(yǎng)基上 EM 菌種的分離培養(yǎng)1.2.1.1

19、 配制固體培養(yǎng)基 配制培養(yǎng)基有一定的原則和順序。燒杯中加一定量的蒸餾水（或去離子水或自來水，視實驗要求而定），按配方稱取營養(yǎng)成分，然后將各營養(yǎng)成分逐一加入（按配方順序加入），待每一種成分溶解后方可加入下一成分，否則會引起沉淀物形成。為了避免形成沉淀物，可加入螯合劑，使金屬與之絡合并保持溶解狀態(tài)。螯合劑有 EDTA（乙二胺四乙酸）和 NTA（氮川三乙酸）。EDTA 常用質量濃度為0.1g/L。各成分加入的順序是：緩沖化合物；無機元素；微量元素；維生素及其他生長因子。待全部營養(yǎng)成分配齊后，用質量濃度為 100g/L 的 NaOH或質量濃度為 100g/L 的 HCl 調(diào)節(jié) pH。由于在培養(yǎng)微生物的

20、過程中會產(chǎn)生有機酸、CO2 和 NH3，前兩者為酸性物質，后者為堿性物質，它們會改變培養(yǎng)基的 pH。所以，在連續(xù)培養(yǎng)中需加入緩沖劑，如 K2HPO4、KH2PO4、Na2CO3、NaHCO3、NaOH 等，它們既起調(diào)節(jié) pH 的作用，又可在培養(yǎng)過程中調(diào)整 pH 的改變。pH 調(diào)好后，分裝，置高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)滅菌，冷卻備用。 許多培養(yǎng)基成分具有雙重或三重功能。例如，K2HPO4及 KH2PO4 既可作緩沖劑又可作磷源和鉀源；硫酸銨可作氮源和硫源；葡萄糖同時作碳源和能源。 一般培養(yǎng)基的配制 稱量及溶化：在燒杯中加入所需水量的 2/3，加入稱量好的易溶物質，難溶物質加入小燒杯中進行稱量，然后加入少量

21、蒸餾水加熱溶化再倒入上述燒杯中，將燒杯置于石棉網(wǎng)上加熱，用玻棒攪拌，使藥品全部溶化。調(diào) pH：待溶液冷卻至室溫時，用 1mol/LNaOH 溶液調(diào) pH 至規(guī)定值。定容：將溶液導入量筒中，補充水量至所需體積。 加瓊脂：加入所需量的瓊脂，加熱融化，補充失水。分裝、加塞、包扎。高壓蒸汽滅菌：0.1MPa 滅菌 20 分鐘。 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基的配制 配制 20%馬鈴薯浸汁：取去皮馬鈴薯 200g，切成小塊，加水 1000mL，80浸泡 1 小時，用紗布過濾，然后補足失水至所需體積，即成 20%馬鈴薯浸汁，貯存?zhèn)溆谩?配制時，按每 100mL 馬鈴薯浸汁加入 2g 葡萄糖，加熱煮沸后加入 2g 瓊脂

22、，繼續(xù)加熱融化并補足失水。分裝、加塞、包扎，高壓蒸汽滅菌。 馬丁培養(yǎng)基配制 稱量：稱取培養(yǎng)基各成分的所需量。溶化：在燒杯中加入約 2/3 所需水量，然后依次逐一溶化培養(yǎng)基各成分。按每 100mL 培養(yǎng)基加入 0.33mL 的 0.1%孟加拉紅溶液。 定容、加瓊脂、分裝、加塞、包扎、高壓蒸汽滅菌。 臨用前，加熱溶化培養(yǎng)基，冷卻至 60左右，無菌操作，按每 100mL 加入2mL2%去氧膽酸鈉溶液及 0.33mL 鏈霉素溶液（10 000u/mL），迅速混勻。1.2.1.2 菌種分離培養(yǎng) 用 10 倍稀釋法制作 EM 菌稀釋液 取無菌 1mL 移液管，將吸液端伸進振蕩混勻的 EM 原液底部，反復吹

23、吸三次，然后準確吸取 0.5mLEM 原液，注入裝有 4.5mL 無菌水試管里，制成 10-1的 EM 稀釋液，蓋上試管帽，混勻菌液。再從 10-1的 EM 稀釋液中用移液管吸取出 0.5mL菌液，注入另一只 4.5mL 無菌水試管里，制成 10-2的 EM 稀釋液。如此操作，可依次制成 10-1-10-4的稀釋液。 注意：操作時管尖不能接觸液面，每一個稀釋度換用一支移液管，每次吸入菌液后，要將移液管插入液面，吹吸 3 次，每次吸上的液面要高于前一次，以減少稀釋中的誤差。 傾注法分離 稀釋完畢后，用滅菌的移液管從 EM 原液中吸取 1mL 菌液，按無菌操作技術加到相應編號原液的培養(yǎng)皿內(nèi)。再以相

24、同的方法分別依次吸取 1mL10-1至 10-4稀釋液，加到相應編號為 10-1至 10-4稀釋液的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)。將已滅菌的培養(yǎng)基融化，待冷卻到 45-50左右，分別傾倒入已盛有原液及 10-1至 10-4 稀釋液的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)。 注意：溫度過高容易將 EM 菌燙死，培養(yǎng)皿蓋上冷凝水太多，也會影響分離效果；低于 45培養(yǎng)基容易凝固，平板易出現(xiàn)凝塊、高低不平；傾倒培養(yǎng)基時注意無菌操作，要在火焰旁進行。傾入培養(yǎng)基約 12-15mL，將培養(yǎng)皿在桌面上輕輕前后左右轉動，使稀釋的菌懸液與融化的瓊脂培養(yǎng)基混合均勻，混勻后靜置桌上。 培養(yǎng) 待平板完全冷凝后，將平板倒置于 30恒溫箱中，培養(yǎng) 24-48h 觀

25、察結果。1.2.2 平板劃線分離，菌種純化 細菌在固體培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征就是菌落特征。所謂菌落是由一個細菌繁殖起來的，由無數(shù)細菌組成具有一定形態(tài)特征的細菌集團。 用稀釋平板法、平板劃線分離法或涂布法均可進行純種分離。把仍保持原有典型優(yōu)良性狀的單細胞分離出來，經(jīng)擴大培養(yǎng)可恢復原菌株的典型優(yōu)良性狀，若經(jīng)性能測定更好。還可應用顯微鏡操縱器將生長良好的單細胞或單孢子分離出來，經(jīng)培養(yǎng)恢復原菌株性狀。 用稀釋平板法和平板劃線法將呈單個細胞的細菌接種在固體培養(yǎng)基上，給予一定的培養(yǎng)條件培養(yǎng)，細菌就可在固體培養(yǎng)基上迅速生長繁殖形成一個由無數(shù)細菌組成的群落，即菌落。不同種的細菌菌落特征是不同的。包括其形態(tài)、大小、

26、光澤、顏色、質地柔軟程度、透明度等。菌落的特征是分類鑒定的依據(jù)。從三個方面看菌落的特征：菌落表面的特征：光滑還是粗糙，干燥還是濕潤等；菌落的邊緣特征：有圓形，邊緣整齊，呈鋸齒狀，邊緣伸出卷曲呈毛發(fā)狀，邊緣呈花瓣狀等；縱剖面的特征：平坦、扁平、隆起、凸起、草帽狀、臍狀、乳頭狀等。 本實驗采用平板劃線分離法進行純種分離，平板劃線分離法是借助將蘸有混合菌懸液的接種環(huán)在平板表面多方向連續(xù)劃線，使混合的微生物細胞在平板表面分散，經(jīng)培養(yǎng)得到分散成單個微生物細胞形成的菌落，從而達到純化目的。 傾倒平板 劃線分離的培養(yǎng)基必須事先傾倒好，需充分冷凝后待平板稍干后方可使用；為便于劃線，一般培養(yǎng)基不宜太薄，每個培養(yǎng)

27、皿大約傾倒 20mL 培養(yǎng)基，培養(yǎng)基應厚薄均勻，平板表面光滑。 四分區(qū)劃線分離 以無菌操作用接種環(huán)直接取平板上待分離純化的菌落，將菌種點種在平板邊緣一處，取出接種環(huán)，燒去多余菌體。先在平板邊緣空白處接觸一下使接種環(huán)冷卻，然后從接種有菌的部位在平板上自左向右輕輕劃線，劃線時平板面與接種環(huán)面成 30-40°夾角，以手腕力量在平板表面輕巧滑動劃線，接種環(huán)不要嵌入培養(yǎng)基內(nèi)劃破培養(yǎng)基，線條要平行密集，劃線完畢，蓋上培養(yǎng)皿蓋。培養(yǎng)皿倒置于恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)（以免培養(yǎng)過程中培養(yǎng)皿蓋冷凝水滴下，沖散已分離的菌落）。第四區(qū)是單菌落的主要分布區(qū)，故其劃線面積應最大。區(qū)與區(qū)間線條夾角最好保持120°左

28、右。 培養(yǎng) 劃線接種后的平板，倒置于 30恒溫箱中培養(yǎng) 24h 后觀察結果。1.2.3 革蘭氏染色，菌種鑒定 1884 年丹麥細菌學家，Christain Gram 創(chuàng)造了革蘭氏染色法。將一大類細菌染上色，而另一類染不上色，以便將兩大類細菌分開，作為分類鑒定重要的第一步。其染色步驟如下： 在無菌操作條件下，用接種環(huán)挑取少量細菌于干凈的載玻片上涂布均勻，固定。 用草酸銨結晶紫染色 1min，水洗去掉浮色。 用碘碘化鉀溶液媒染 1min，傾去多余溶液。 用中性脫色劑如乙醇或丙酮酸脫色，革蘭氏陽性菌不被褪色而呈紫色，革蘭氏陰性菌被褪色而呈無色。 用番紅染液復染 1min，革蘭氏陽性菌仍呈紫色，革蘭氏

29、陰性菌則呈現(xiàn)紅色。革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌即被區(qū)別開。 某些細菌在它的生活史中的某個階段或某些細菌在它遇到外界不良環(huán)境時，在其細胞內(nèi)形成一個內(nèi)生孢子叫芽孢。所有的芽孢都可抵抗外界不良環(huán)境。例如，無芽胞桿菌在 80-1000C 時幾分鐘之內(nèi)幾乎全部死亡；有芽胞的桿菌在 1000C 時營養(yǎng)細胞先死亡，其芽胞在 1000C 煮 2h 也難以死亡。所以芽孢是抵抗外界不良環(huán)境的休眠體。芽孢是分類鑒定的依據(jù)之一。芽孢著生位置依細菌種的不同而不同。 菌種鑒定：根據(jù)革蘭氏染色結果（紅色為革蘭氏陰性菌，紫色為革蘭氏陽性菌）分別進行鑒定。見表 3.1。 表 3.1 微生物鑒定所用培養(yǎng)基 Table 3.1 Cu

30、lture mediums use in appraisal microorganism 菌種 有無芽孢 所用培養(yǎng)基 培養(yǎng)條件革蘭氏陽性 有 50mL 水+2.8gBUG+0.125Mdt 30革蘭氏陽性 無 100mL 水+5.7gBUG 35-37革蘭氏陰性 100mL 水+5.7gBUG 35-37 酵母菌 50mL 水+3gBUY pH5.2-6.0，26 BUG,BUY 均為黃色粉末，稱量后，做成培養(yǎng)基滅菌，將菌種分別劃線接種到對應培養(yǎng)基中培養(yǎng) 24h 后進行鑒定。3124 菌種分離培養(yǎng)條件實驗 微生物除了需要營養(yǎng)外，還需要合適的環(huán)境生存因子，例如溫度、pH、氧氣、滲透壓、氧化還原電

31、位、陽光等。如果環(huán)境條件不正常，會影響微生物的生命活動，甚至發(fā)生變異或死亡。 溫度 溫度是微生物的重要生存因子。在適宜的溫度范圍內(nèi)，溫度每升高 100C，酶促反應速度將提高 1-2 倍，微生物的代謝速率和生長速率均可相應提高。適宜的的培養(yǎng)溫度使微生物以最快的生長速率生長。過高或過低的溫度均會降低代謝速率及生長速率。超高溫或超低溫的極端溫度對微生物的不利影響主要表現(xiàn)在破壞微生物機體的基本組成物質蛋白質、酶蛋白和脂肪。蛋白質被高溫嚴重破壞而發(fā)生凝固，為不可逆變性，猶如雞蛋煮熟后不能再孵化出小雞一樣。因此，微生物經(jīng)超高溫處理后必然死亡。超高溫導致微生物死亡的原因除蛋白質凝固變性外，還可能是由于細胞質

32、膜含有受熱易溶解的脂類，當用超高溫處理時，細胞質膜的脂肪受熱溶解使膜產(chǎn)生小孔，引起細胞內(nèi)含物泄漏而致死。超高溫的殺菌效果與微生物的種類，數(shù)量，生理狀態(tài)，芽胞有、無及 pH 都有關系。 在適宜的溫度范圍內(nèi)微生物能大量生長繁殖。根據(jù)一般微生物對溫度的最適生長需求，可將微生物分為四大類。以細菌為例，分為 4 類：嗜冷菌、嗜中溫菌、嗜熱菌及嗜超熱菌。大多數(shù)細菌是嗜中溫菌，嗜冷菌和嗜熱菌占少數(shù)。低溫對嗜中溫和高溫的微生物生長不利。在低溫條件下，微生物的代謝極微弱，基本處于休眠狀態(tài)，但不致死。嗜中溫微生物在低于 100C 的溫度下不生長，因為蛋白質合成的啟動受阻，不能合成蛋白質。又由于許多酶對反饋抑制異常

33、敏感，很易和反饋抑制異劑緊密結合，從而影響微生物的生長。處于低溫下的微生物一旦獲得適宜溫度，即可恢復活性，以原來的生長速率生長繁殖。 pH 值 微生物的生活活動、物質代謝與 pH 密切關系。不同的微生物要求不同的 pH，過高或過低的 pH 對微生物的生長繁殖不利，表現(xiàn)在以下幾個方面。pH 過低（pH=1.5），會引起微生物體表面由帶負電變?yōu)閹д?，進而影響微生物對營養(yǎng)的吸收。過高或過低的 pH 還可影響培養(yǎng)基中有機化合物的離子化作用，從而間接影響微生物。因為細菌表面帶負電荷，非離子狀態(tài)化合物比離子狀態(tài)化合物更容易滲入細胞。酶只有在最適宜的 pH 時才能發(fā)揮其最大活性，極端的 pH使酶的活性降低

34、，進而影響微生物細胞內(nèi)的生物化學過程，甚至直接破壞微生物細胞。過高或過低的 pH 均降低微生物對高溫的抵抗能力。 大多數(shù)細菌、藻類和原生動物的最適 pH 為 6.5-7.5，它們的 pH 適應范圍在4-10 之間。細菌一般要求中性和偏堿性。某些細菌，例如氧化硫硫桿菌和極端嗜酸菌，需在酸性環(huán)境中生活，其最適 pH 為 3，在 pH 為 1.5 時仍可生活。放線菌在中性和偏堿性環(huán)境中生長，pH 以 7.5-8.0 最適宜。酵母菌和霉菌要求在酸性或偏堿性的環(huán)境中生活，最適 pH 范圍在 3-6，有的在 5-6，其生長極限在 1.5-10之間。凡對 pH 變化適應性強的微生物，對 pH 要求不甚嚴格；

35、而對 pH 變化適應性不強的微生物，則對 pH 要求嚴格。 有機固體廢物的 pH 為 5-8。堆肥初期 pH 下降至 5 以下，以后上升至 8.5，成熟堆肥的 pH 在 7-8 之間。 在培養(yǎng)微生物的過程中，隨著微生物的生長繁殖和代謝活動的進行，培養(yǎng)基的 pH 會發(fā)生變化，有的由堿性變成酸性，有的由酸性變成堿性。其原因有多方面。微生物在含蛋白質、蛋白胨及氨基酸等中性物質培養(yǎng)基中生長，這些物質可經(jīng)微生物分解，產(chǎn)生 NH3 和胺類等堿性物質，使培養(yǎng)基 pH 上升。另外，由于細胞選擇性地吸收陽離子或陰離子，也會改變培養(yǎng)基的 pH。如，用（NH4）2SO4 作無機氮源，當 NH4 被菌體吸收用于合成氨

36、基酸和蛋白質后，剩下 SO4 會使 pH 下降；用 NaNO3作氮源時，NO3 被吸收后，培養(yǎng)基的 pH 會上升。因此，在考慮培養(yǎng)基成分時，要加入緩沖物質。 溶解氧 根據(jù)微生物與分子氧的關系，將微生物分為好氧微生物（包括專性好氧微生物和微量好氧微生物）和兼性厭氧（也叫兼性好氧）微生物及厭氧微生物。專性好氧微生物是指在氧分壓為 0.2×101kPa 的條件下生長繁殖良好的微生物。微量好氧微生物是指在氧分壓為（0.003-0.2）×101kPa 的條件下生長繁殖良好的微生物。厭氧微生物包括專性厭氧微生物和耐氧厭氧微生物。專性厭氧微生物是指只能在氧分壓小于 0.005×

37、101kPa 的瓊脂表面生長的微生物。這三類微生物對氧的反應不同。 在有氧條件下才能生長的微生物叫好氧微生物。大多數(shù)細菌（如芽胞桿菌屬、假單胞菌屬、動膠菌屬、黃桿菌屬、微球菌屬、無色桿菌屬、球衣菌屬、根瘤菌、固氮菌、硝化細菌、硫化細菌、無色硫磺細菌）、大多數(shù)放線菌、霉菌、原生動物、微型后生動物等都屬于好氧性微生物。氧對好氧微生物有兩個作用：作為微生物好氧呼吸的最終電子受體；參與甾醇類和不飽和脂肪酸的生物合成。 好氧微生物中有一些是微量好氧的，它們在溶解氧的濃度為 0.5mg/L 左右時生長最好。微量好氧微生物有貝日阿托氏菌、發(fā)硫菌、浮游球衣菌（在充足氧和缺氧條件下均可生長良好）、游動性纖毛蟲（

38、如扭頭蟲、棘尾蟲、草履蟲）及微型后生動物（如線蟲）等。 好氧微生物和微量好氧微生物在有氧的條件下能正常生長繁殖，是因為它們需要氧作為呼吸的最終電子受體，并參與部分物質合成。同時又能抵抗在利用氧的過程中所產(chǎn)生的有毒物質，如過氧化氫（H2O2）、過氧化物和羥自由基。好氧微生物和微量好氧微生物體內(nèi)有相應的過氧化氫酶、過氧化物酶和超氧化物岐化酶分解上述物質，從而使自身不致中毒。好氧微生物需要的是溶于水的氧，即溶解氧，好氧微生物需要供給充足的溶解氧。 兼性厭氧微生物既具有脫氫酶也具有氧化酶，所以，既能在無氧條件下，又能在有氧條件下生存。然而，微生物在這兩種不同條件下所表現(xiàn)出的生理狀態(tài)是很不同的。在好氧條

39、件生長時，氧化酶活性強，細胞色素及電子傳遞體系的其他組分正常存在。在無氧條件下，細胞色素和電子傳遞體系的其他組分減少或全部喪失，氧化酶無活性；一旦通入氧氣，這些組分的合成很快恢復。例如：酵母菌在有氧條件下迅速生長繁殖，進行好氧呼吸，將有機物徹底氧化成 CO2 和 H2O，并產(chǎn)生大量菌體；在無氧條件下，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生乙醇和 CO2。如果將氧通入正在發(fā)酵的酵母菌懸液中，發(fā)酵速度迅速下降，葡萄糖的消耗速度也顯著下降。 兼性厭氧微生物除酵母菌外，還有腸道細菌、硝酸鹽還原菌、人和動物的致病菌、某些原生動物、微型后生動物及個別真菌等。兼性厭氧微生物在許多方面起積極作用。專性厭氧微生物在絕對無氧的條件下才能

40、生存，一旦遇氧就會死亡，如梭菌屬（Clostridium）、梭桿菌屬（Bacteriodes）、脫硫弧菌屬（Fusobacterium）、所有產(chǎn)甲烷菌及甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）等。EM 有效微生物的生長受培養(yǎng)條件的影響：培養(yǎng)溫度、時間、營養(yǎng)源、培養(yǎng)基初始 pH 值、厭氧好氧環(huán)境等，進行定性實驗，尋找出 EM（有效微生物）中各菌種最佳培養(yǎng)條件118。1.2.5 液體培養(yǎng)基中純菌種的增殖培養(yǎng) 將用固體培養(yǎng)基劃線分離培養(yǎng)出的純菌種接種至液體培養(yǎng)基內(nèi)進行振蕩培養(yǎng)。在液體培養(yǎng)基中，細菌整個個體與培養(yǎng)基接觸，可以自由擴散生長。它的生長狀態(tài)隨細菌屬、種的特征而異。細菌在液體培養(yǎng)基中的培

41、養(yǎng)特征是分類依據(jù)之一。1.2.5.1 配制液體培養(yǎng)基： 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（培養(yǎng)酵母菌） 馬鈴薯 40g，葡萄糖 4g，水 200mL，自然 pH，0.1MPa 滅菌 20 分鐘。 乳酸菌番茄汁培養(yǎng)基（培養(yǎng)乳酸菌） 牛肉膏 1g，蛋白胨 1g，酵母膏 1g，葡萄糖 1g，番茄汁 20%，吐溫 80 0.05%，碳酸鈣 2g，溴甲酚綠 0.01%，蒸餾水 100mL，pH6.5, 121.3滅菌 20 分鐘。光合細菌生長因子培養(yǎng)基（培養(yǎng)光合細菌） 酵母膏 3.0g，氯化鈣 0.3g，硫酸鎂 0.5g，生長因子 5mL，加蒸餾水溶解并定容至 1000mL，pH7.0-8.0，115高壓滅菌 30

42、分鐘。 生長因子：維生素 B10.001mg，尼克丁酸 0.1mg，對氨基苯甲酸 0.1mg，生物素 0.001mg，以上藥品溶于蒸餾水中，定容至 10mL，然后過濾除菌。 乙醇培養(yǎng)基（培養(yǎng)乙酸菌） 乙醇 20mL，乙酸鈉 5g，酵母膏 1g，磷酸氫二鉀 0.4g，硫酸銨 0.5g，硫酸鎂 0.2g，碳酸鈣 10g，水 1000mL，pH 為 7，0.1MPa 滅菌 20 分鐘。1.2.5.2 接種純菌種 用灼燒過的接種環(huán)取菌種，先將接種環(huán)接觸一下沒長菌的培養(yǎng)基部分，使其冷卻以免燙死菌種。然后用接種環(huán)輕輕取菌少許，將取有菌種的接種環(huán)送入液體培養(yǎng)基中，并使接種環(huán)在液體與瓶壁接觸的部位輕輕摩擦，使

43、菌體分散于液體中。接種后塞上棉塞，使液體培養(yǎng)基輕輕搖動，使菌體均勻分布于培養(yǎng)基中，以利生長。1.2.5.3 菌種的培養(yǎng) 將液體培養(yǎng)基放入旋轉式搖床進行微生物振蕩培養(yǎng)。固定在搖床上的錐形瓶隨搖床以 200-250r/min 的速度運動，由此帶動培養(yǎng)物圍繞著錐形瓶內(nèi)壁平穩(wěn)轉動。搖床恒溫 30，培養(yǎng) 24-48h 后置于冰箱中保存，用于垃圾堆肥實驗。2 實驗結果與與討論 將 EM 有效微生物原液及 10-1-10-4 的稀釋液在各種適合于不同菌(乳酸菌、酵母菌、光合細菌、乙酸菌、放線菌、絲狀菌)生長的培養(yǎng)基中培養(yǎng)分離，得出 EM有效微生物的組成菌種。2.1 細菌總數(shù)的測定 基礎培養(yǎng)基即牛肉膏蛋白胨培

44、養(yǎng)基，由牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉按一定比例配制而成；pH 呈堿性，除乳酸菌及光合細菌不生長外，其它大多數(shù)微生物均可在其上生長。因此，進行細菌分離前先用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基大致測定 EM 原液所含細菌種類及數(shù)量?；罴毦鷶?shù)的測定方法有：載玻片薄瓊脂層培養(yǎng)計數(shù)；平板菌落（CFU）計數(shù)；液體稀釋培養(yǎng)計數(shù)；比濁法測定細菌懸液濃度。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的細菌情況見表 3.2，原液培養(yǎng)基菌落總數(shù)為 6 498 個/mL。 結論：由表 3.2 可知 EM 有效微生物由多種菌構成，且原液濃度較大?？紤]到菌種相互間的生長抑制作用，選用原液到 10-4稀釋液來進行培養(yǎng)分離。2.2 光合細菌的生長分離2.2.1通過在不同配

45、方的培養(yǎng)基上培養(yǎng)光合細菌，挑選出最適合光合細菌生長的培養(yǎng)基，見表 3.3。2.2.2 各種培養(yǎng)基上光合細菌的生長狀況 各種培養(yǎng)基上光合細菌的生長情況不同，見表 3.4-表 3.6。 基本培養(yǎng)基上光合細菌的生長情況，見表 3.4。培養(yǎng)基上菌落數(shù)：原液 4 800 個；10-1 稀釋液 166 個；10-2 稀釋液 1 個，基本成比例關系。在現(xiàn)有培養(yǎng)條件下，基本培養(yǎng)基適合光合細菌的生長，原液的菌落數(shù)較多，有 4 800 個，但種類不多，只有 3 種。 富集培養(yǎng)基中只有原液培養(yǎng)基上長出 10 個菌落。由實驗可知，在現(xiàn)有條件下，富集培養(yǎng)基不適合光合細菌的生長。 培養(yǎng)基上菌落數(shù)：原液 969 個；10-

46、1稀釋液 75 個；10-2稀釋液 14 個，基本成比例關系。由實驗可知，在現(xiàn)有培養(yǎng)條件下，酵母膏培養(yǎng)基適合光合細菌的生長，種類較多，且菌落較大。生長因子培養(yǎng)基上光合細菌生長情況，見表 3.6。由實驗可知，在現(xiàn)有條件下，生長因子培養(yǎng)基適合光合細菌的生長，菌落數(shù)多且種類也較多。結論：通過比較得出，富集培養(yǎng)基在現(xiàn)有培養(yǎng)條件下不適合光合細菌的生長；基本培養(yǎng)基、酵母膏培養(yǎng)基、生長因子培養(yǎng)基均適合光合細菌的生長。其中酵母膏培養(yǎng)基和生長因子培養(yǎng)基上培養(yǎng)出的光合細菌種類較多且菌落數(shù)量較大，更適合光合細菌的生長。EM 有效微生物原液中光合細菌的種類和數(shù)量都較大，為優(yōu)勢菌種。223 光合細菌的劃線分離 用生長因

47、子培養(yǎng)基作光合細菌的劃線分離，共劃線分離出 4 種光合細菌。見表 3.7。 結論：通過比較得出，1 號菌長得最好，2 號菌種長得較好，且由前面的實驗可知，這兩種菌在基本培養(yǎng)基、酵母膏培養(yǎng)基、生長因子培養(yǎng)基上均可生長，菌落數(shù)較多。說明在 EM 有效微生物原液中，1、2 號菌數(shù)量較多，是優(yōu)勢菌種。224 革蘭氏染色對 1、2 號菌種進行革蘭氏染色，結果呈紫色，為革蘭氏陽性菌；進行芽孢染色，有芽孢。2.3 乳酸菌的生長分離231 選擇適合乳酸菌生長的固體培養(yǎng)基乳酸菌的分離培養(yǎng)選用了番茄汁培養(yǎng)基，乳酸菌生長效果良好且有濃郁的乳酸香味。232 番茄汁培養(yǎng)基上乳酸菌的生長情況番茄汁培養(yǎng)基呈深綠色，培養(yǎng)基上

48、長出乳白色菌落，且由于乳酸菌的代謝作用產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，使培養(yǎng)基變?yōu)辄S色。乳酸菌菌落開始表面較光滑，隨后表面出現(xiàn)緊密分布的小顆粒。乳酸菌在番茄汁培養(yǎng)基上共長出 4 種乳酸菌，每種菌落數(shù)量都較多。培養(yǎng)基上菌落數(shù)：原液 4 200 個；10-1 稀釋液 2 330 個；10-2稀釋液 960 個； 10-3稀釋液 124 個。通過培養(yǎng)基顏色變化范圍、菌落多少及大小，可基本得出菌落數(shù)與菌液濃度成正比。見圖 3.2。 分別從番茄汁培養(yǎng)基上挑取四種形態(tài)不同的菌落進行劃線接種分離119，見表 3.9；乳酸菌劃線分離生長情況見圖 3.3。從圖 3.3 可以看出，四種菌落劃線分離后生長情況均較好。 結論：乳酸菌在

49、番茄汁培養(yǎng)基劃線分離的 4 種乳酸菌，每種菌落數(shù)量都較多，說明 EM 有效微生物原液中乳酸菌的種類和數(shù)量都較大，為優(yōu)勢菌種。2.3.4 革蘭氏染色對乳酸菌番茄汁培養(yǎng)基劃線分離出的四種乳酸菌進行革蘭氏染色及芽孢染色，結果見表 3.10。通過在三種不同配方的培養(yǎng)基上培養(yǎng)放線菌，挑選出最適合放線菌生長的培養(yǎng)基。見表 3.11。實驗結果顯示，在三種培養(yǎng)基上，放線菌的菌落數(shù)都很少，說明 EM 有效微生物原液中放線菌的種類和數(shù)量都較少，不是優(yōu)勢菌種。2.5 酵母菌的生長分離2.5.1 選擇適合酵母菌生長的固體培養(yǎng)基通過在不同的培養(yǎng)基上培養(yǎng)酵母菌，從而選擇在現(xiàn)有條件下最適合酵母菌生長的培養(yǎng)基120。見表 3

50、.12。馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基呈淺土黃色，與馬鈴薯顏色相同，培養(yǎng)基上菌落與培養(yǎng)基同色略淺，菌落表面光滑但不亮，有較濃的酒香。培養(yǎng)基上菌落數(shù)：原液，無法計數(shù)；10-1 稀釋液 2 400 個；10-2 稀釋液 600個；10-3稀釋液 48 個，基本成比例關系。見圖 3.4。豆芽汁葡萄糖培養(yǎng)基呈淺黃色，培養(yǎng) 48 小時后，培養(yǎng)基上菌落數(shù)仍較少，僅原液培養(yǎng)基上長出 15 個菌落，菌落淺黃色，表面光滑但不亮。結論：在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中酵母菌長勢較好，菌落數(shù)量很多。說明在EM 有效微生物原液中酵母菌的數(shù)量較多；現(xiàn)有條件下馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基更適合酵母菌的生長，而豆芽汁葡萄糖培養(yǎng)基不適合酵母菌的生長。2.5

51、.2 劃線分離從馬鈴薯葡萄糖原液培養(yǎng)基上挑取三種形態(tài)有差異的菌落，用馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基進行劃線接種分離，見3.13和3.5。酵母菌劃線分離培養(yǎng) 24h 后，三個培養(yǎng)基上長出的菌落從形態(tài)上看形狀、顏色、大小、表面光滑度均相同：淺黃色透明，圓形菌落，直徑 3-5mm，2.5.3 革蘭氏染色將劃線分離的三種菌落進行革蘭氏染色及芽孢染色，結果均為紫色，即為革蘭氏陽性菌且均無芽孢，進一步證實了劃線分離的實際上是一種菌。2.6 絲狀菌的生長分離絲狀菌是一些不同類的有絲狀結構的菌種的總 稱，典型的代表是霉菌。馬丁培養(yǎng)基是用于絲狀菌特別是霉菌培養(yǎng)的典型培養(yǎng)基，因此選用馬丁培養(yǎng)基來培養(yǎng)絲狀菌。馬丁培養(yǎng)基：葡萄糖 1g，蛋白胨 0