動(dòng)物生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)

1、動(dòng)物生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)一、生物大分子的制備技術(shù)二、電泳技術(shù)三、層析技術(shù)四、基因重組技術(shù)與分子生物學(xué)鑒定技術(shù)一、生物大分子的制備技術(shù)l 1.材料的選擇與預(yù)處理l 2.細(xì)胞的破碎l 3.提取l 4.分離純化l 5.濃縮l 6.結(jié)晶l 7.干燥l 8.保存1.材料的選擇與預(yù)處理l 選材的原則:l 含量高、來(lái)源豐富、制備工藝簡(jiǎn)單、成本低、注意動(dòng)物的生理狀態(tài)和微生物生長(zhǎng)期之間的差異。l 預(yù)處理的方法：l 動(dòng)物組織要先剔除結(jié)締組織、脂肪組織等非活性部分，洗去血污等，微生物需將菌體和發(fā)酵液分離開。2.細(xì)胞的破碎l 1）機(jī)械法l 高速組織搗碎機(jī)、勻漿器、研磨器等l 2）物理法l 反復(fù)凍融法、冷熱交替法、超聲波處

2、理法、加壓破碎法l 3）化學(xué)及生物化學(xué)法l 自溶法、溶菌酶法、表面活性劑（十二烷基磺酸鈉、氯化十二烷基吡啶、去氧膽酸鈉）l 無(wú)論哪一種方法破碎細(xì)胞，均需在一定的稀鹽溶液或緩沖溶液中進(jìn)行3.提取l 提?。ǔ樘幔褐钢苽湮锱c細(xì)胞固體成分或其它結(jié)合成分的分離，是由固相轉(zhuǎn)入液相或從細(xì)胞內(nèi)生理狀態(tài)轉(zhuǎn)入外界特定溶液環(huán)境的過(guò)程l 1）水溶液提取l 2）有機(jī)溶劑提取1）水溶液提取l 球狀蛋白質(zhì)的提取一般以水溶液為主，以鹽溶液及緩沖液提取蛋白質(zhì)和酶時(shí)常需注意以下幾個(gè)因素：l 鹽濃度：常用等滲溶液，如mol/L磷酸鹽緩沖液、l 0.15mol/L氯化鈉溶液l pH值：保證蛋白質(zhì)在穩(wěn)定的范圍內(nèi)，選擇在偏離等電點(diǎn)的兩

3、l 側(cè)，常為pH3-6。l 溫度：0-5°Cl 其它：加入保護(hù)劑、底物、輔酶等2）有機(jī)溶劑提取l 一些與脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)和酶，常用有機(jī)溶劑提取，如丁醇提取法（pH3-10，-2 40°C）4.分離純化l 分離純化：在抽提的基礎(chǔ)上，去除多種同類或異類物質(zhì)的過(guò)程l 1）鹽析法l 2）有機(jī)溶劑沉淀法l 3）等點(diǎn)沉淀法l 4）選擇性變性法l 5）吸附法l 6）離心沉淀法l 7）透析法l 8）超濾法l 9）酶解法l 10）電泳法l 11）層析法1）鹽析法l 原理：l 鹽溶：由于少量離子的作用，減少了偶極溶質(zhì)分子之間極性基團(tuán)的靜電引力，增加了溶質(zhì)和溶劑相互

4、作用力的結(jié)果。l 鹽析：由于鹽濃度增加到一定程度，水的活度被降低，蛋白質(zhì)表面的大量電荷被中和，水化膜被破壞，蛋白質(zhì)分子相互聚集而沉淀析出。l 鹽的選擇：l 硫酸銨、氯化鈉、硫酸鈉等2）有機(jī)溶劑沉淀法l 原理：有機(jī)溶劑能降低溶液的介電常數(shù)，從而增加蛋白質(zhì)分子上不同電荷的引力，導(dǎo)致溶解度的降低；另一方面，由于溶劑與水的作用，能破壞蛋白質(zhì)的水化膜，導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀析出。l 有機(jī)溶劑沉淀法的優(yōu)缺點(diǎn)：l 優(yōu)點(diǎn)：分辨能力比鹽析法高，即一種蛋白質(zhì)或其它溶質(zhì)只有在一個(gè)比較窄的有機(jī)溶劑濃度范圍內(nèi)才會(huì)沉淀；沉淀不用脫鹽，過(guò)濾比較容易；在生化制備中的應(yīng)用比鹽析法廣。l 缺點(diǎn)：對(duì)某些具有生物活性的大分子，容易引起變性失

5、活，操作常在低溫下進(jìn)行，加入有機(jī)溶劑時(shí)注意攪拌以避免局部濃度過(guò)大。分離后的蛋白質(zhì)沉淀，應(yīng)立即用水或緩沖液溶解，以降低有機(jī)溶劑濃度。3）等點(diǎn)沉淀法l 利用蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)溶解度最低而各種蛋白質(zhì)又具有不同等電點(diǎn)的特點(diǎn)進(jìn)行分離，常和鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法一起使用。4）選擇性變性法l 選擇一定的條件使其它蛋白質(zhì)沉淀而又不影響所需蛋白質(zhì)的分離方法。如將提取液適當(dāng)加熱、用惰性液體氯仿震蕩、利用酸堿或加入重金屬離子等進(jìn)行選擇變性。5）吸附法l 吸附目的生物大分子或雜質(zhì)，常在微酸性條件（pH5-6）及稀鹽溶液中進(jìn)行。l 洗脫時(shí)一般多在弱堿性條件或適當(dāng)提高洗脫液離子強(qiáng)度，即可將被吸附的生物大分子洗脫下來(lái)。吸附操作

6、可用靜態(tài)吸附，也可用柱層析吸附。l 常用的吸附劑：l 硅膠、氧化鋁、活性炭、聚酰胺、聚苯乙烯、磷酸鈣等。6）離心沉淀法l 離心：利用離心機(jī)，借助離心力分離液相非均一體系的過(guò)程，即進(jìn)行固液相分離和不同比重或不同分子量大小的溶質(zhì)與液體的過(guò)程。l 離心機(jī)的分類：l 低速（<0.4萬(wàn)r/min）、高速（萬(wàn)r/min）和超速（1.5-5萬(wàn)r/min）l 大容量和小容量l 常溫和低溫使用離心機(jī)的注意事項(xiàng)l ：l 1.注意防潮、防止過(guò)冷和過(guò)熱，尤其要注意防止腐蝕性試劑的污染l 2.使用前應(yīng)先行檢查離心機(jī)的安放是否水平和穩(wěn)定，其次要檢查對(duì)稱位離心管、內(nèi)容物和套管是否平衡，即重量相差不得超過(guò)0.1克，離心

7、管及套管中如有玻璃碎片等，應(yīng)予及時(shí)清除。套管底部必須加以緩沖膠墊，以免離心時(shí)離心管破裂。l 3.離心時(shí)應(yīng)檢查轉(zhuǎn)速器是否位于起點(diǎn),經(jīng)檢查轉(zhuǎn)速無(wú)誤后打開開關(guān)。啟動(dòng)后速度應(yīng)緩慢提高。離心完畢后，將轉(zhuǎn)速器緩慢退至起點(diǎn)，關(guān)閉開關(guān)并任機(jī)器自行停轉(zhuǎn)。注意切不可用手施加l 外力助停，以免沉淀泛起。l 4.使用完畢，及時(shí)清除機(jī)內(nèi)水滴及污物7）透析法l 透析：透過(guò)薄膜除去或添加小分子溶質(zhì)的過(guò)程。可用于生物大分子脫鹽、濃縮及添加小分子溶質(zhì)。l 透析袋：透析袋的膜孔有大有小，要根據(jù)欲分離的具體情況而選擇。透析膜有動(dòng)物性膜、火棉膠膜、硫酸紙膜、蛋白質(zhì)膠膜等。目前常用的透析膜是由纖維素類物質(zhì)制成的。l 透析的操作：8）超

8、濾法l 超濾：加壓膜分離技術(shù)之一，以超濾膜為分離介質(zhì)，通過(guò)對(duì)薄膜上的溶液加壓過(guò)濾，使小分子物質(zhì)通過(guò)，大分子物質(zhì)則被截留。這種利用超濾膜分離大分子和小分子物質(zhì)溶液的方法稱為超濾。這一近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新方法最實(shí)用于生物大分子尤其是蛋白質(zhì)和酶的濃縮和脫鹽，并具有成本低、操作方便、條件溫和、回收率高、能較好地保持生物大分子的生理活性等優(yōu)點(diǎn)。超濾法還可用于生物大分子的分離純化，是目前發(fā)展較快且為人們樂(lè)于采用的生化技術(shù)之一。l 超濾膜的特點(diǎn)：微孔過(guò)濾用的膜平均直徑為50nm-14um，用于分離較大顆粒。加壓超濾用的膜平均直徑為1-10nm，用于分離大分子溶質(zhì)。反滲透作用用的膜平均孔徑最小，一般在1nm以下

9、，用于分離小分子溶質(zhì)。超濾膜可截留不同分子量的溶質(zhì)，常用的規(guī)格有1000、5000、10000、20000、30000、50000、100000等相對(duì)分子質(zhì)量截留值。l 超濾器：工業(yè)用管式等超濾器、實(shí)驗(yàn)室用離心式超濾器9）酶解法l 酶解法的目的：l 1.通過(guò)酶的分解時(shí)雜質(zhì)大分子變?yōu)樾》肿?從而和待精制的生化產(chǎn)品分離。l 2.通過(guò)酶解法制備小分子生化產(chǎn)品l 酶解法的優(yōu)越性：l 1.酶的催化效率高,專一性強(qiáng),不發(fā)生副反應(yīng)。產(chǎn)率高，質(zhì)量好，便于產(chǎn)品的提純，簡(jiǎn)化工藝步驟。l 2.酶的作用條件溫和。生產(chǎn)時(shí)要求設(shè)備簡(jiǎn)單。l 3.酶及其反應(yīng)產(chǎn)物大多無(wú)毒，適合于生化制藥工業(yè)、食品工業(yè)應(yīng)用。l 影響酶解的因素：

10、l 1. 溫度的影響。l 2. pH的影響。l 3. 酶的用量。l 4.激活劑或抑制劑的影響5.濃縮l 1）蒸發(fā)法l 薄膜蒸發(fā)濃縮、減壓加溫蒸發(fā)濃縮、空氣流動(dòng)蒸發(fā)濃縮l 2）冰凍法l 生物大分子溶液冰凍時(shí)，水分子結(jié)成冰，鹽類及生物大分子不進(jìn)入冰內(nèi)而留在液相中。l 3）吸收法l 通過(guò)吸收劑直接除去溶液中溶劑分子而使溶液濃縮的方法。實(shí)驗(yàn)室常用的吸收劑有聚乙二醇、聚乙烯吡咯酮、蔗糖、凝膠等。l 4）超濾法6.結(jié)晶l 1）生物大分子結(jié)晶的條件l a.純度:>50%l b.濃度:較高l c.pH值:近等電點(diǎn)處l d.溫度:0-5 °Cl e.晶種:加入微量的要結(jié)晶的蛋白質(zhì)或酶；有時(shí)用玻璃

11、棒輕輕刮擦器壁也可。l f.金屬離子：l g.結(jié)晶時(shí)間：由幾小時(shí)、幾天、幾月不等7.干燥l 1）真空干燥l 適用于不耐高溫、易氧化物質(zhì)的干燥與保存l 2）冷凍真空干燥l 凍干：一般先將干燥的液體冷至冰點(diǎn)以下變成固體，然后在低溫低壓下將溶劑升華變成氣體而除去。產(chǎn)品具有疏松、溶解度好、保持天然結(jié)構(gòu)等優(yōu)點(diǎn)，適用于各類生物大分子的保存。l 3）噴霧干燥l 是一種快速干燥的方法，噴霧后，液體分散為液滴，直徑通常只有1-120um大小，與熱空氣接觸面大，水分蒸發(fā)很快。在100°C的熱空氣中，只需不到1秒的時(shí)間即可干燥。8.保存l 1）干態(tài)保存l 0-4°C，內(nèi)裝干燥劑密封，幾月至數(shù)年。

12、l 2）液態(tài)保存l 需要較嚴(yán)格的防腐措施，保存時(shí)間不能太長(zhǎng)。l a.樣品不能太?。?gt;1mg/ml），必須濃縮至一定濃度后才能分裝保存。樣品太稀時(shí)容易引起生物大分子的變性。l b.一般需加入防腐劑和穩(wěn)定劑l 常用防腐劑有：甲苯、氯仿、百里酚等l 穩(wěn)定劑：蛋白質(zhì)和酶常用蔗糖、甘油，其中酶也可加入底物或附酶以提高穩(wěn)定性；核酸大分子一般保存在氯化鈉或檸檬酸與氯化鈉的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中。l c.低溫保存: 0-4°C二、電泳技術(shù)l 電泳技術(shù)的原理：l 常用電泳技術(shù)：l 垂直電泳：蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳l 水平電泳：DNA瓊脂糖凝膠電泳l 影響電泳遷移率的因素：l 1.樣品l 2.電場(chǎng)l 3.

13、緩沖液l 4.支持介質(zhì)l 5.其它影響電泳遷移率的因素：1.樣品l 1）電荷l 2）大小l 3）形狀2.電場(chǎng)l 1）電流l 2）電壓l 3）電阻3.緩沖液l 1）成分l 甲酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、巴比妥鹽、磷酸鹽、Tris、EDTA、吡啶l 2）濃度l 緩沖液離子強(qiáng)度的增加，緩沖液承載的電流也隨之增加，但樣品的電動(dòng)勢(shì)卻隨之減少，因此降低了樣品的遷移率。一般最適離子強(qiáng)度在之間。l 3）pHl 生物大分子的遷移率由緩沖液的pH值決定，可根據(jù)分離的需要選用pH=111范圍的緩沖液。兩個(gè)電極槽中的緩沖液一般是相同的，用來(lái)飽和支持介質(zhì)。但在凝膠電泳中，緩沖液是支持介質(zhì)的一部分，常使用一種與電極緩沖液不同

14、的緩沖液。4.支持介質(zhì)l 1.吸附: l 支持介質(zhì)對(duì)樣品分子的滯留作用，導(dǎo)致樣品分子的拖尾，降低了樣品分子的遷移率。l 2.電滲：l 由于支持介質(zhì)在緩沖液中或多或少帶有一定的電荷，導(dǎo)致與支持介質(zhì)相接觸的水溶液帶有相反的電荷。在電泳時(shí)，液體相對(duì)支持介質(zhì)呈現(xiàn)相對(duì)移動(dòng)，稱為電滲。在電泳時(shí)，顆粒泳動(dòng)的表觀速度是顆粒本身真實(shí)速度與電滲攜帶移動(dòng)速度的加和。l 3.分子篩:l 這是凝膠電泳的一個(gè)特性。在凝膠電泳中，半剛性支持介質(zhì)（凝膠）的分子篩特性不但有助于蛋白質(zhì)和核酸在電泳遷移率方面的區(qū)別，而且有助于在大小、形態(tài)上也有所不同的生物大分子的分離。瓊脂、淀粉和聚丙烯酰胺凝膠的分子篩原理是，大分子的移動(dòng)隨凝膠交

15、聯(lián)度的增加，孔徑的減少，而阻力逐漸增加，如果使用Sephadex型的凝膠則情況正好相反。電泳的一般技術(shù)l 一、裝置l 1.電源裝置l 2.電泳裝置l 二、支持介質(zhì)l 1.紙l 2.醋酸纖維素薄膜l 3.薄層l 4.凝膠l （1）瓊脂l （2）聚丙烯酰胺l 三、操作過(guò)程l 1.支持介質(zhì)的飽和l 2.加樣l 3.樣品的分離l 4.取出支持介質(zhì)l 5.染色和物質(zhì)的回收一、裝置l 1.電源裝置:l 穩(wěn)定的直流電，0500伏特、0150毫安l 2.電泳裝置：l 電極：常用白金電極l 緩沖液槽：有兩個(gè)緩沖液槽，電泳時(shí)通過(guò)緩沖液飽和的支持介質(zhì)相連。二、支持介質(zhì)l 1.紙：已落后、過(guò)時(shí)l 2.醋酸纖維素薄膜：

16、l 吸附小、分辨率較高、分離較快，可用于臨床研究，如血清蛋白的分析、免疫電泳、放射性核素應(yīng)用的電泳。l 3.薄層：l 硅膠、氧化鋁、纖維素均可在玻璃板上制成薄層用于電泳。l “指紋圖譜”：對(duì)薄層，可在一個(gè)方向上電泳（薄層），然后在另一個(gè)方向上進(jìn)行薄層（電泳）分離，應(yīng)用此法分離鑒別蛋白質(zhì)和核酸水解產(chǎn)物的方法。4.凝膠l 瓊脂、聚丙烯酰胺等凝膠在使用前用緩沖液配制，這個(gè)過(guò)程常常較費(fèi)時(shí)間。因?yàn)槟z的吸附、電滲和由于擴(kuò)散形成的區(qū)帶彌散現(xiàn)象均很輕微，所以凝膠電泳不但用于制備，而且更多地用于分析。尤其是對(duì)于分離具有相同電荷、但質(zhì)量相差很小的混合物應(yīng)用效果更好。l （1）瓊脂l 瓊脂糖是從瓊脂中提取出來(lái)的，

17、是由D-半乳糖和3,6-脫水-L-半乳糖結(jié)合的鏈狀多糖,含硫酸根比瓊脂少,因而分離效果明顯提高。l 瓊脂糖電泳具有以下優(yōu)點(diǎn)：瓊脂糖含液體量大，可達(dá)98-99%，近似自由電泳，但樣品的擴(kuò)散度比自由電泳小，對(duì)蛋白質(zhì)的吸附極微；瓊脂糖作為支持介質(zhì)，均勻、區(qū)帶整齊、分辨率高、重復(fù)性好；電泳速度快；透明而不吸收紫外線可以直接用紫外檢測(cè)儀做定量測(cè)定；區(qū)帶可染色，樣品易回收，有利于制備。l 緩沖液的選用：pH=69，離子強(qiáng)度為0.020.05，常用緩沖夜有硼酸鹽緩沖液、巴比妥緩沖液、Tris緩沖液。l 瓊脂糖電泳的主要應(yīng)用：核酸電泳、免疫電泳、同工酶電泳等。（2）聚丙烯酰胺凝膠l 特點(diǎn)：l 可以隨需要制備各

18、種孔徑的凝膠，制備的重復(fù)性好；可以在各種緩沖液中使用；分離時(shí)間短；吸附和電滲作用低；在280nm處不吸收紫外線，因此經(jīng)分離的蛋白質(zhì)可通過(guò)對(duì)波長(zhǎng)的吸收來(lái)確定；在一定濃度范圍內(nèi)，對(duì)熱穩(wěn)定，無(wú)色透明，便于對(duì)分離物進(jìn)行染色和觀察，并可用掃描儀直接進(jìn)行測(cè)定。l 凝膠的制備：l 單體：丙烯酰胺l 交聯(lián)劑：甲叉雙丙烯酰胺l 催化劑：引發(fā)劑：過(guò)硫酸銨，在形成中提供自由基，通過(guò)自由基l 傳遞，使丙烯酰胺成為自由基，發(fā)動(dòng)聚合反應(yīng)。l 加速劑：四甲基乙二胺，加快引發(fā)劑釋放自由基的速度l 凝膠孔徑和用途：l 凝膠孔徑由丙烯酰胺單體和甲叉雙丙烯酰胺交l 聯(lián)劑的相對(duì)比例決定?？讖脚c丙烯酰胺的總濃度有關(guān)，l 總濃度約大，孔

19、徑相應(yīng)變小，機(jī)械強(qiáng)度增加。l 含丙烯酰胺77.5%的凝膠，適用于分子量為1100萬(wàn)的生l 物大分子。含丙烯酰胺1530%的凝膠，適用于分子量為1萬(wàn)以l 下的生物大分子。 7.5%的凝膠應(yīng)用最廣，被稱為“標(biāo)準(zhǔn)凝膠”。三、操作過(guò)程l 1）支持介質(zhì)的飽和或凝膠的制備l 2）加樣：微量加樣器加樣l 3）樣品的分離：穩(wěn)壓穩(wěn)流，110小時(shí)l 4）取出支持介質(zhì)或凝膠l 5）染色和物質(zhì)的回收l(shuí) 常見的染色劑：l 氨基黑10B或考馬斯亮藍(lán)用于蛋白染色；l 蘇丹黑用于脂蛋白染色；l 碘用于多聚糖染色；l 甲基氯-焦寧用于核酸染色，溴化乙錠用于核酸熒光染色；l 甲苯胺藍(lán)用于酸性粘多糖染色；l 酶可以用底物生成有色產(chǎn)

20、物的方法染色；l 放射性化合物可用放射性自顯影、放射性層析圖譜掃描儀觀察或用液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定放射性。三、層析技術(shù)l 層析技術(shù)：l 利用混合物中各組分在兩相中分配系數(shù)不同而達(dá)到分離目的的一種生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)。是分離生物大分子研究中必不可少的工具，是當(dāng)前分離生化樣品最有效的手段。不管是哪種層洗方法，其最基本的特征是具有一個(gè)固定相和一個(gè)流動(dòng)相，各種物質(zhì)得以分離的最基本原因就在于它們?cè)谶@兩個(gè)相中具有不同的分配系數(shù)。當(dāng)兩相作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，這些物質(zhì)在兩相間進(jìn)行反復(fù)多次的分配，從而得到分離。l 分類：按動(dòng)相-定相分：氣相層析、液相層析l 按實(shí)驗(yàn)技術(shù)分：柱層析、薄層層析l 按分離機(jī)制分：吸附層析、l 離子交換

21、層析、l 凝膠過(guò)濾、l 親和層析常用的層析技術(shù)l 一、吸附層析l 二、凝膠過(guò)濾（分子篩層析）l 三、離子交換層析l 四、親和層析一、吸附層析l 吸附層析的原理：l 當(dāng)樣品的組分被吸附劑（固定相）吸附后，用適當(dāng)?shù)南疵撘海鲃?dòng)相）沖洗，就能改變洗脫劑的吸附能力，使被洗脫組分解脫下來(lái)，隨洗脫液向前移動(dòng)。當(dāng)這些洗脫下來(lái)的組分向前移動(dòng)時(shí)，又將遇到新的吸附劑而再被吸附，然后又被后來(lái)的洗脫液洗脫下來(lái)。經(jīng)過(guò)反復(fù)的吸附-脫吸附-再吸附-再脫吸附，樣品組分就可不斷向前移動(dòng)。由于吸附劑對(duì)樣品中各組分的吸附能力不同，它們?cè)谙疵撘旱臎_洗下移動(dòng)的速度也不同，因而可逐漸得到分離。吸附劑與展層液或洗脫液l 吸附劑的要求：l

22、具有較大的吸附表面和一定的吸附能力；與展層液或洗脫液及樣品中各組分不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，在展層液或洗脫液中不溶解；吸附劑的顆粒應(yīng)有一定粒度并且均勻一致。l 常見的吸附劑：氧化鋁、硅膠、聚酰胺l 展層液或洗脫液的要求：l 被分離物質(zhì)的極性：l 極性較大的化合物可從溶液中較強(qiáng)地被吸附劑吸附，需要極性較大的溶劑才能被置換。l 吸附劑的性能：l 分離極性小的物質(zhì)，一般選用吸附活性較大的吸附劑，否則反之。l 流動(dòng)相的極性：l 通常極性小的溶劑對(duì)被分離混合物中極性小的物質(zhì)親和力強(qiáng)，在層析中移動(dòng)較快，從而與一些極性大的物質(zhì)分離，反之亦然。l 常見流動(dòng)相極性遞增的次序是：石油醚<環(huán)己烷<四氯化碳<

23、苯<甲苯<乙醚<氯仿<乙酸乙酯<正丁醇<丙酮<乙醇<甲醇<水吸附柱層析法l 層析柱：在玻璃管的底部墊以尼龍網(wǎng)、l 玻璃棉或燒結(jié)玻璃濾板等。l 裝柱：填裝一定量的吸附劑l 加樣：在吸附劑的上面加樣l 洗脫：l 收集：l 測(cè)定：吸附薄層層析法l 吸附薄層層析法是發(fā)展較快的一種微量、快速層析方法。吸附薄層層析是把吸附劑均勻地在玻璃板上鋪成薄層，然后將樣品加在薄層一端，在密閉的容器中用適當(dāng)?shù)娜軇┱箤?，即可達(dá)到分離鑒定的目的。l 制板：吸附劑鋪于玻璃板l 點(diǎn)樣：幾微克l 展層：在被溶劑蒸汽飽和的密閉容器中進(jìn)行。l 顯色：在紫外燈下觀察、自顯顏色、加顯

24、色劑顯色等l Rf值計(jì)算：l Rf =原點(diǎn)到樣品斑點(diǎn)中心的垂直距離/原點(diǎn)到容積l 前沿的垂直距離二、凝膠過(guò)濾（分子篩層析）l 基本原理：l 利用網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的分子篩作用，根據(jù)被分離物質(zhì)的分子大小不同來(lái)進(jìn)行分離。當(dāng)大小不同的分子流經(jīng)凝膠層析柱時(shí)，分子直徑比凝膠的孔徑大的分子不能進(jìn)入凝膠顆粒的微孔中，只能經(jīng)過(guò)凝膠顆粒之間的間隙，這樣的分子隨洗脫液一起移動(dòng)，因而最先流出柱外。而分子直徑比凝膠的孔徑小的分子能進(jìn)入凝膠顆粒的微孔中，遷移距離長(zhǎng)，移動(dòng)速度小于大分子，并于大分子相互分離。不同大小的分子被凝膠顆粒阻滯的速度不同，因而以不同的速度流出。對(duì)于中等大小的分子，其遷移行為是既在凝膠顆粒內(nèi)部移動(dòng)又在凝膠顆粒

25、之間移動(dòng)，分子量大的在凝膠柱中全部遷移距離短先流出，分子量小的則后流出，因而得以分離。常見的分子篩層析支持物l 交聯(lián)葡聚糖（Sephadex）l 聚丙烯酰胺（Bio-gel P）l 瓊脂糖凝膠（Sepharose，Bio-gel A）l 瓊脂糖-聚丙烯酰胺凝膠l 受控微孔玻璃球交聯(lián)葡聚糖（Sephadex）柱層析的基本步驟l 用于物質(zhì)的分離、脫鹽、大分子溶液的濃縮，還可用于大分子物質(zhì)的分子量測(cè)定l 1.凝膠顆粒的溶脹:l 凝膠顆粒浸泡在洗脫液中，除去飄浮在表面的細(xì)碎顆粒。l 2.層析柱的準(zhǔn)備:l 從大分子（MW>20000）中分離小分子，如無(wú)機(jī)鹽或代謝中間物（MW<1500）時(shí)，柱

26、床體積應(yīng)是上樣體積的410倍，柱高：柱直徑應(yīng)為5：115：1，這類柱稱為脫鹽柱。相反，分離生物大分子時(shí)，柱床體積應(yīng)是上樣體積的25100倍，柱高：柱直徑應(yīng)為20：1100：1。l 3.上樣和洗脫：l 上樣量： 1025%（脫鹽）、15%（分離生物大分子）l 洗脫液：離子強(qiáng)度大于0.08l 4.凝膠的再生:l 層析柱可反復(fù)使用數(shù)十次，如層析柱受到污染，則可用0.5mol/LNaOH和0.5mol/LNaCl的混合液進(jìn)行處理。三、離子交換層析l 離子交換層析：離子交換是指液相中的離子與固相上的活性基團(tuán)離子之間的可逆交換反應(yīng)。將要分離的混合樣品先在一定pH值條件下全部解離，然后流過(guò)固定相使與固定相上

27、的離子進(jìn)行交換并吸附于固定相上，在根據(jù)混合樣品中各組分解離度的差別，用不同pH值和不同離子強(qiáng)度的緩沖液分別洗脫，從而達(dá)到分離混合樣品中各組分的目的。這種利用離子交換反應(yīng)分離物質(zhì)的方法稱為離子交換層析。離子交換劑l 交換劑母體：l 人工合成的樹脂、纖維素、葡聚糖、瓊脂糖，l 陽(yáng)離子交換劑：強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換劑：-SOHl 中強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換劑：-POHl 弱酸型陽(yáng)離子交換劑：-COOH、-OHl 帶正電荷的蛋白質(zhì)和核酸常用在纖維素上引入羧甲基（-O-CH- l COO-）的陽(yáng)離子交換劑l 陰離子交換劑：強(qiáng)堿型：-N+（CH）OHl 弱堿型：-N（CH）、-NHCH、-NHl 帶正電荷的蛋白質(zhì)和核酸

28、在纖維素上引入二乙基氨基乙基（-O-CH- l CH- NH （CH CH ）的陰離子交換劑離子交換層析的基本操作過(guò)程l 1.交換劑的選擇:l 被分離的物質(zhì)是陽(yáng)離子應(yīng)選用陽(yáng)離子交換劑,否則反之。l 2.交換劑的處理、轉(zhuǎn)型和再生l 蒸餾水浸透使之充分吸水溶脹，酸堿處理，在用無(wú)離子水洗至中性；轉(zhuǎn)型是使交換樹脂帶上所要求的離子，如需將陽(yáng)離子交換劑轉(zhuǎn)為Na+型，則用NaOH處理，如需NH+，則用NHCl處理，最后都要用無(wú)離子水洗至中性，再用緩沖液平衡。所謂平衡就是通過(guò)洗滌，使流出液與所需pH值和離子強(qiáng)度相同。用過(guò)的交換劑，經(jīng)處理后可繼續(xù)使用，此處理過(guò)程稱為再生，一般是用酸和堿分別浸泡，再用水洗至中性。

29、l 3.裝柱：l 裝好的柱要求無(wú)氣泡、無(wú)分節(jié)、柱床表面平坦，裝好的柱床表面要保持一層溶液。l 4.樣品上柱：l 階段洗脫：用幾種不同離子強(qiáng)度和pH值的洗脫液依次相繼洗脫。l 梯度洗脫：采用梯度混和器，使洗脫液的離子強(qiáng)度和pH值發(fā)生逐漸的變化，分離效果較好。l 5.洗脫四、親和層析l 利用由高度生物特異性及親和力引起的生物大分子與小分子之間的結(jié)合平衡而建立起來(lái)的分離生物大分子的層析方法。這種特異可逆結(jié)合（配體與受體）的物質(zhì)很多，如抗原與抗體、底物與酶、激素與受體等。l 將配體固定在固相載體上，并且將其裝在層析柱中，當(dāng)樣品通過(guò)層析柱時(shí)，由于配體和相對(duì)應(yīng)的生物大分子有專一的親和作用，將生物大分子吸附

30、于柱中，樣品中的其它組分不產(chǎn)生這種專一性的結(jié)合，而直接流出層析柱。然后，便可以利用洗脫劑將吸附于柱中的生物大分子洗脫下來(lái)。l 親和層析具有高度的專一性，而且層析過(guò)程簡(jiǎn)單快速，是一種理想的有效分離純化生物大分子的手段。親和層析的基本步驟l 1.固相載體的選擇:l 如瓊脂糖Sepharose-4B等l 2.配體的選擇:l 與生物大分子之間有合適的親和力，配體有雙重功能，即和載體及生物大分子都能結(jié)合。l 3.配體與載體的偶聯(lián)：l 偶聯(lián)劑：溴化氰、環(huán)氧乙烷等l 4.使用方法l 吸附、洗脫四、基因重組技術(shù)與分子生物學(xué)鑒定技術(shù)l 一、多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)l 二、DNA核苷酸順序測(cè)定三、DNA重組技術(shù)四

31、、轉(zhuǎn)基因技術(shù)五、體細(xì)胞克隆技術(shù)六、DNA指紋技術(shù)七、蛋白質(zhì)工程一、多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR，Polymerase chain reaction），是20世紀(jì)80年代末發(fā)展起來(lái)的一種快速的DNA特定片段體外合成擴(kuò)增的方法。PCR反應(yīng)的步驟在微量離心管中,加入適量的緩沖液，微量的模板DNA，人工合成的兩個(gè)DNA引物，四種脫氧單核苷酸(dNTP)，一種耐熱的多聚酶和Mg2+。將上述溶液加熱，使模板DNA在高溫下(如95)變性，雙鏈解開為兩條單鏈；然后降低反應(yīng)溫度，使兩條引物在低溫下(37)分別與兩條模板互補(bǔ)退火，形成局部雙鏈；再升高反應(yīng)溫度至中溫(72)，此時(shí)多聚酶以dNTP

32、為原料，以兩引物為復(fù)制的起點(diǎn)，在兩條模板上合成新的DNA子鏈。如此重復(fù)改變反應(yīng)溫度，即高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個(gè)階段。PCR反應(yīng)的結(jié)果以三次改變溫度為一個(gè)循環(huán)，每一次循環(huán)就使欲擴(kuò)增的DNA區(qū)段的拷貝數(shù)放大一倍，即第一次循環(huán)，每條模板雙鏈DNA變?yōu)?條；第二次循環(huán)，則變?yōu)?條；第三次循環(huán)，變成8條以幾何級(jí)數(shù)擴(kuò)增下去。一般樣品經(jīng)30次循環(huán)最終使特定DNA片段放大了數(shù)百萬(wàn)倍。退火在高溫變性的DNA逐漸降低溫度，復(fù)性為雙鏈DNA的過(guò)程。PCR的特點(diǎn)(1)對(duì)DNA模板要求不高，純度要求不嚴(yán)，用量很低，DNA分子量的長(zhǎng)度僅為幾百個(gè)bp，只要含有未損傷的需要擴(kuò)增的片段即可。(2)引物設(shè)計(jì)十分重要，它決

33、定了PCR擴(kuò)增片段的大小及特異性。引物的設(shè)計(jì)是按需要及引物設(shè)計(jì)原則進(jìn)行的?，F(xiàn)在已有DNA合成儀，設(shè)計(jì)好的引物能很快合成。(3)需要一個(gè)耐熱的DNA聚合酶。發(fā)現(xiàn)了TaqDNA聚合酶，PCR才進(jìn)入實(shí)用階段。PCR技術(shù)現(xiàn)已成為分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、生物工程、法醫(yī)學(xué)及考古學(xué)等領(lǐng)域不可缺少的工具。TaqDNA聚合酶 1988年Saiki開始用Cetus公司從水生棲熱菌YT-1(Thermus aquaticus Strain YT-1)中獲得的耐熱聚合酶(稱為TaqDNA Polymerase)進(jìn)行PCP擴(kuò)增，從此PCR才進(jìn)入實(shí)用階段。Taq聚合酶在DNA變性溫度(95)時(shí)不變性，聚合方向?yàn)?3，需要Mg2

34、+，最適溫度為75-80。PCR技術(shù)的應(yīng)用PCR技術(shù)可以廣泛應(yīng)用于科研和實(shí)際檢測(cè)中，用于DNA研究、序列分析、測(cè)定基因表達(dá)，從cDNA可放大特定克隆、構(gòu)建基因圖、進(jìn)化分析、生物證據(jù)分析和醫(yī)學(xué)研究與臨床檢驗(yàn)等。PCR反應(yīng)示意圖二、DNA核苷酸順序測(cè)定DNA順序測(cè)定技術(shù)有A.Maxam和W.Gilbert提出的化學(xué)裂解法和1978年F.Sanger提出的雙脫氧核苷酸末端終止法。以Sanger法最適用。Sanger法 Sanger法從引物的3-端開始能合成約300個(gè)核苷酸的排列順序。是現(xiàn)今分子生物學(xué)中最重要的手段之一。Sanger法的程序Sanger法最突出的特點(diǎn)是在反應(yīng)中加入一種2，3-二脫氧核苷

35、三磷酸(ddNTP), 整個(gè)測(cè)定的程序如下：將被測(cè)DNA制成單鏈模板。分別加入4個(gè)反應(yīng)管中。并在每個(gè)管中加入引物、DNA聚合酶和4種dNTP(其中一種為32P標(biāo)記)。然后在4個(gè)管中分別加入ddTTP、ddCTP、ddGTP和ddATP。然后進(jìn)行保溫反應(yīng)。由于雙脫氧的ddNTP比正常的dNTP少了3-羥基，當(dāng)它在DNA聚合酶作用下?lián)饺氲秸谘由斓腄NA鏈時(shí)，因ddNTP不含3-羥基，于是就阻止了其它dNTP的繼續(xù)摻入，起了特異性終止劑的作用。2，3-二脫氧核苷三磷酸結(jié)構(gòu)圖Sanger法的結(jié)果分析反應(yīng)結(jié)束后在4個(gè)管中分別形成一些全部具有相同5-引物端、和分別以ddT、ddC、ddG、ddA 殘基為

36、3-端結(jié)尾的一系列長(zhǎng)短不一的混合物。每種混合物經(jīng)變性聚丙烯酰胺電泳分離及放射自顯影，可見4種混合物形成不同的電泳遷移條帶。每一條帶都代表著一段以ddNTP終止的片段。只要按照電泳條帶出現(xiàn)的先后次序即可讀出被測(cè)DNA的順序。Sanger法的結(jié)果分析圖三、DNA重組技術(shù) DNA重組技術(shù)是按生物科學(xué)規(guī)律及人為設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)體外基因改造，最后使生物的遺傳性狀獲得改變，故稱為“遺傳工程”(genetic engineering)。（一）DNA重組技術(shù)的基礎(chǔ)（二）DNA重組技術(shù)的基本過(guò)程（三）DNA重組技術(shù)的意義DNA重組技術(shù)定義DNA重組技術(shù)是運(yùn)用多種限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶等，在細(xì)胞外將一種外源基因DN

37、A(來(lái)自原核或真核生物)和載體DNA重新組合連接(重組)，形成雜交DNA。最后將雜交DNA轉(zhuǎn)入宿主生物(如大腸桿菌)。使外源基因DNA在宿主生物細(xì)胞中，隨著生物細(xì)胞的繁殖而增殖，或最后得到表達(dá)。最終獲得基因表達(dá)產(chǎn)物或改變生物原有的遺傳性狀。DNA重組技術(shù)別稱其本質(zhì)是基因的體外重組，所以又稱“基因工程”(gene engineering)或“DNA重組技術(shù)”(recombinant DNA techniques)、分子克隆(molecular cloning)等。（一）DNA重組技術(shù)的基礎(chǔ) DNA重組技術(shù)出現(xiàn)不是偶然的，它是許多技術(shù)方法發(fā)展的結(jié)果。1.核酸的制備 2.限制性內(nèi)切酶 3.分子雜交

38、4.載體 5.宿主細(xì)胞1.核酸的制備現(xiàn)在已經(jīng)能從動(dòng)、植物組織、細(xì)菌及病毒中制得比較完整的DNA分子了。 RNA的分子比DNA小，極易遭到核糖核酸酶(RNase)的降解。RNase很穩(wěn)定，具有驚人的活力，加熱到蛋白質(zhì)變性的溫度(90)其活力也不完全喪失。RNase分布極廣，不但存在于細(xì)胞內(nèi)也分布在環(huán)境中，包括實(shí)驗(yàn)器皿上，如不小心制得的RNA也易被降解。近年來(lái)經(jīng)過(guò)技術(shù)改進(jìn)，已經(jīng)能制得各種RNA，尤其是mRNA。2.限制性內(nèi)切酶所謂DNA重組即是在實(shí)驗(yàn)室將兩種DNA分子經(jīng)過(guò)切割，選擇適合的片段連接起來(lái)的過(guò)程。實(shí)現(xiàn)這一步，是在限制性內(nèi)切酶發(fā)現(xiàn)以后才實(shí)現(xiàn)的。50年代有人在實(shí)驗(yàn)中曾經(jīng)發(fā)現(xiàn)同一種噬菌體分別與

39、兩種細(xì)菌培養(yǎng)，噬菌體只在一種細(xì)菌中成活，而在另一種中絕大多數(shù)不能成活，表明這個(gè)菌株對(duì)入侵的噬菌體具有限制性作用。限制修飾系統(tǒng) 1962年Arber等人經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)終于證明：細(xì)菌中存在有兩種酶，一種是限制性內(nèi)切酶，可以將外源DNA切割降解；另一種是修飾酶也稱甲基化酶，能使DNA中的核苷酸甲基化，使之不受限制性酶的降解。兩種酶可對(duì)同一DNA序列作用。細(xì)菌借助這兩種酶，將自身的DNA進(jìn)行甲基化修飾使之不受限制性酶的降解，而對(duì)外來(lái)的、末甲基化的DNA則進(jìn)行降解，以保證細(xì)菌自身的DNA不受外來(lái)DNA的干擾，保持其遺傳性狀的穩(wěn)定性。這兩種酶稱限制修飾系統(tǒng)(restriction-modification

40、system)。限制性內(nèi)切酶一類核酸內(nèi)切酶，可以將外源DNA在特定位點(diǎn)切割降解。以后從細(xì)菌中分別分離出了I型和型兩類限制性內(nèi)切酶。I型限制性內(nèi)切酶 I型能識(shí)別DNA分子內(nèi)非甲基化的特定序列，但切割是隨機(jī)的，且切割位點(diǎn)遠(yuǎn)離識(shí)別位點(diǎn)，不能生成特定片段。型限制性內(nèi)切酶型是1970年Smith第一次從流感嗜血桿菌中分離到的。它能識(shí)別雙鏈DNA分子中特定的序列，大部分具有雙重交替式的對(duì)稱點(diǎn)，即從5到3方向讀這段DNA的單鏈堿基，發(fā)現(xiàn)兩條互補(bǔ)鏈的堿基是相同的。型限制性內(nèi)切酶識(shí)別的DNA序列一般長(zhǎng)度是4、5和6個(gè)堿基對(duì)。EcoRI的識(shí)別序列限制性內(nèi)切酶切割DNA的方式a.從識(shí)別序列的中間切開b.在識(shí)別序列對(duì)

41、稱軸的左右兩方進(jìn)行切割c.在識(shí)別序列對(duì)稱軸的右邊(5-3鏈)和對(duì)稱軸左邊(3-5鏈)切開a.從識(shí)別序列的中間切開從識(shí)別序列的中間切開產(chǎn)生平齊末端(blunt ends), 如Haeb.在識(shí)別序列對(duì)稱軸的左右兩方進(jìn)行切割即分別在5-3鏈和3-5鏈對(duì)稱軸的左右方切開，形成帶有凸出的5磷酸基團(tuán)的粘性末端(Cohesive ends)，如EcoRc.在識(shí)別序列對(duì)稱軸的右邊(5-3鏈)和對(duì)稱軸左邊(3-5鏈)切開形成帶有凸出的3羥基的粘性末端，如pstI平齊末端有些限制性內(nèi)切酶在識(shí)別序列的中間切開，產(chǎn)生沒(méi)有未互補(bǔ)堿基的末端稱為平齊末端。平齊末端需要另一DNA片段也修飾成平齊末端方可連接。粘性末端有些限制

42、性內(nèi)切酶在識(shí)別序列對(duì)稱軸的左右兩方進(jìn)行切割，形成帶有凸出的5-磷酸基團(tuán)的單鏈部分，稱為粘性末端。粘性末端可與用同一個(gè)酶切割的DNA片段退火連接。粘性末端法連接DNA分子限制性內(nèi)切酶的命名用細(xì)菌同名的第一個(gè)字母(大寫)和種名的前兩個(gè)字母(小寫)構(gòu)成酶的基本名稱。若酶是從其中一種特殊菌株來(lái)，還在基本名稱后加上菌株名稱符號(hào)。名稱后的羅馬數(shù)字，表示在該特殊菌株中發(fā)現(xiàn)此酶的先后次序。如HaeII是從(Haemophilus aegypticus)中提取的，并且是從中發(fā)現(xiàn)的第二個(gè)酶。3.分子雜交經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割的DNA片段可以通過(guò)凝膠電泳分開并顯示，很容易檢測(cè)出DNA片段的存在和大小。用聚丙烯酰胺凝膠可

43、分離1000堿基對(duì)(bp)以下的片段。用多孔的瓊脂糖凝膠可分離20kb的片段。這些凝膠的分辨率很高，某些膠可從長(zhǎng)為幾百個(gè)核苷酸的片段中分辨出一個(gè)核苷酸的差異。含有特定堿基順序的DNA的鑒定含有特定堿基順序的DNA的限制性酶切割片段，可以進(jìn)行分子雜交鑒定。即用另一標(biāo)記的與之互補(bǔ)的DNA鏈作探針進(jìn)行雜交鑒定。如Southern雜交(Southern印跡法) 、Northern雜交、western blot。Southern雜交它是由發(fā)明的。它是將混合在一起的限制性酶切DNA片段，用瓊脂糖電泳分開，并變性為單鏈DNA，再轉(zhuǎn)移到一張硝酸纖維素膜上。在膜上的這些DNA片段可以用P32標(biāo)記的單鏈DNA探針

44、雜交。再用放射自顯影方法顯示出與探針順序互補(bǔ)的限制性酶切DNA片段的位置。用這個(gè)方法能很容易地將上百萬(wàn)片段中間的一個(gè)特殊片段鑒定出來(lái)，像從一堆干草中尋找出一顆針一樣，十分靈敏有效。Southern雜交示意圖Northern雜交用凝膠電泳分離RNA，將特殊片段轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，之后用雜交法來(lái)鑒定它，此法稱為Northern雜交或稱Northern印跡法。Western blot Western blot(western印跡法)是用化學(xué)免疫法鑒定蛋白質(zhì)的技術(shù)。它是用特殊的抗體與對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)(抗原)結(jié)合染色。這項(xiàng)技術(shù)是鑒定基因表達(dá)產(chǎn)物所不可缺少的。原位雜交即將長(zhǎng)在培養(yǎng)皿上的菌落或噬菌斑轉(zhuǎn)移到硝酸

45、纖維素膜上用標(biāo)記探針進(jìn)行分子雜交。這些檢測(cè)手段都是DNA重組技術(shù)所不可缺少的。4.載體能將外源基因DNA帶入宿主細(xì)胞并能復(fù)制或最終使外源基因DNA表達(dá)的自主DNA，稱為載體(vector)。用得最廣泛的載體是大腸桿菌的質(zhì)粒(plasmid)。質(zhì)粒質(zhì)粒是一種環(huán)狀雙鏈的DNA分子。自身在細(xì)菌細(xì)胞中能不斷復(fù)制繁殖，有些質(zhì)粒當(dāng)細(xì)菌停止繁殖時(shí)，自身還能復(fù)制擴(kuò)增，稱為復(fù)制松弛型控制(relaxed control)；有的隨著細(xì)菌停止繁殖，復(fù)制也停止，稱為嚴(yán)緊型控制(stringent control)。研究比較深入的質(zhì)粒有大腸桿菌的性因子(F因子)、大腸桿菌素因子和抗藥因子等?？顾幰蜃涌顾幰蜃?質(zhì)粒)在其

46、DNA上編碼有某些酶的基因，表達(dá)產(chǎn)生的酶對(duì)鏈霉素、氯霉素、磺胺、青霉素、四環(huán)素、卡那霉素等藥物能產(chǎn)生生物化學(xué)修飾，使之鈍化而失效。質(zhì)粒的作用質(zhì)粒DNA能從細(xì)菌中提出來(lái)，又能再轉(zhuǎn)入細(xì)菌。這個(gè)過(guò)程稱轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)入的質(zhì)粒DNA仍能進(jìn)行復(fù)制，這種性能為DNA重組技術(shù)提供了重要的條件，即將一種外源基因與質(zhì)粒重組后，再轉(zhuǎn)入細(xì)菌中去復(fù)制繁殖，使外源基因得以增殖。質(zhì)粒自身的某些抗藥基因成為從轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中篩選它們的一種標(biāo)記。除質(zhì)粒外，噬菌體、病毒也能通過(guò)“感染”將外源基因帶入細(xì)菌并進(jìn)行復(fù)制。目前所使用的質(zhì)粒目前實(shí)驗(yàn)中所使用的質(zhì)粒、噬菌體和病毒載體種類很多。但都是經(jīng)過(guò)了人工改造，更適宜運(yùn)用于DNA重組技術(shù)。它們既保留

47、了轉(zhuǎn)化和感染活細(xì)胞的能力，又具有多處攜帶外源DNA的酶切位點(diǎn)，并含有特殊的篩選標(biāo)記。這些載體中有些只能復(fù)制擴(kuò)增帶入的外源基因；有些可以使外源基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯出基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，這種載體稱為表達(dá)載體。5.宿主細(xì)胞 DNA重組技術(shù)最終的目的是要使外源基因得以增殖和表達(dá)，而增殖和表達(dá)必須借助于活細(xì)胞內(nèi)的酶，底物及各種因子才能實(shí)現(xiàn)。宿主細(xì)胞是重組技術(shù)不可缺少的條件。質(zhì)粒是運(yùn)用最早的載體，轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞是細(xì)菌，因此細(xì)菌(大腸桿菌E.Coli)是實(shí)現(xiàn)DNA重組技術(shù)的第一個(gè)宿主生物體。目前所使用的大腸桿菌宿主細(xì)胞都是缺陷性的。缺陷性大腸桿菌由于存在于人體及其環(huán)境之中，無(wú)所不在。DNA重組技術(shù)發(fā)展之初，人

48、們害怕在無(wú)意間會(huì)將癌基因等有害基因重組于載體。重組體轉(zhuǎn)入大腸桿菌后，癌基因會(huì)隨著大腸桿菌的四處傳染，導(dǎo)致其嚴(yán)重后果。鑒于這種潛在性危險(xiǎn)，世界各國(guó)曾制定了各種準(zhǔn)則和嚴(yán)格規(guī)定，以防范危害人類事件的發(fā)生。以后，由于科學(xué)工作者的努力，對(duì)所使用的大腸桿菌作了改造，使之缺陷某些必需因子，這樣細(xì)菌只有在實(shí)驗(yàn)條件下滿足缺陷因子才會(huì)生長(zhǎng)繁殖，其它環(huán)境難以存括。重組DNA的宿主細(xì)胞現(xiàn)在除大腸桿菌外，酵母、真菌及各種真核細(xì)胞、受精卵細(xì)胞都成為重組DNA的宿主細(xì)胞。(二)DNA重組技術(shù)的基本過(guò)程(1)選擇人們所期望的外源基因(稱為目的基因)； (2)將目的基因與適合的載體DNA(如質(zhì)粒)在體外進(jìn)行重組、獲得重組體(雜

49、交DNA)； (3)將重組體轉(zhuǎn)入合適的生物活細(xì)胞，使目的基因復(fù)制擴(kuò)增或轉(zhuǎn)錄、翻譯表達(dá)出目的基因編碼的蛋白質(zhì)； (4)從細(xì)胞中分離出基因表達(dá)產(chǎn)物或獲得一個(gè)具有新遺傳性狀的個(gè)體。重組技術(shù)DNA分子克隆DNA重組的發(fā)展過(guò)程人類第一例DNA重組是70年代初，將一種細(xì)菌抗四環(huán)素的質(zhì)粒DNA與另一種細(xì)菌抗卡那霉素的質(zhì)粒DNA進(jìn)行體外重組，雜交DNA再轉(zhuǎn)入大腸桿菌，結(jié)果細(xì)菌表達(dá)出了雙親DNA的遺傳信息，即同時(shí)抗四環(huán)素和抗卡那霉素，說(shuō)明外源基因得到了表達(dá)?，F(xiàn)在人、豬、牛的生長(zhǎng)激素、胰島素、干擾素等許多具有生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)，已經(jīng)通過(guò)DNA重組技術(shù)由細(xì)菌等生物來(lái)生產(chǎn)，滿足人類的需要。DNA重組技術(shù)的具體步驟1.

50、 目的基因的獲得2重組3轉(zhuǎn)化1.目的基因的獲得目前普遍采取三種方法。 (1)以mRNA為模板，用反轉(zhuǎn)錄酶合成DNA。 (2)構(gòu)建基因文庫(kù) (3)人工合成基因(1)以mRNA為模板，用反轉(zhuǎn)錄酶合成DNA以mRNA為模板，用反轉(zhuǎn)錄酶合成DNA。關(guān)鍵是要預(yù)先獲得目的基因的mRNA。(2)構(gòu)建基因文庫(kù)生物(包括動(dòng)物)細(xì)胞染色體DNA分子上編碼了生物的全部基因，但每個(gè)基因在DNA上的確切位置是不知道的。要想從中找到所需要的目的基因，是先將DNA從細(xì)胞中盡量完整地提取出來(lái)(由于操作中剪切力的作用，獲得的DNA只是一些大片段)。再用某些限制性內(nèi)切酶處理，使DNA成為一定長(zhǎng)度的片段并與載體結(jié)合。基因文庫(kù)通常選

51、用噬菌體DNA作載體，它自身長(zhǎng)50kb，其中25kb可以刪去，代之以20kb左右的外源DNA插入。重組的噬菌體完全具備對(duì)大腸桿菌的侵染和在細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制的能力。每個(gè)侵染的大腸桿菌中都含有一定片段的DNA，而且是彼此不同的基因片段。這樣，大腸桿菌細(xì)胞有如圖書館內(nèi)珍藏著許多書刊一樣，這些細(xì)胞里也珍藏著總DNA中各種基因的片段，只要選用與所需基因互補(bǔ)的DNA片段作探針，通過(guò)原位雜交、Southern雜交等即可從大腸桿菌中篩出所需要的目的基因。通常把這些大腸桿菌細(xì)胞稱為基因文庫(kù)(gene library,gene bank ) 。(3)人工合成基因現(xiàn)在使用計(jì)算機(jī)控制的DNA合成儀可以合成一定長(zhǎng)度的DN

52、A片段。只要已知某基因的密碼，即可輸入編碼順序由DNA合成儀合成。1977年K.Itakura合成了哺乳動(dòng)物的生長(zhǎng)抑制激素基因(14個(gè)氨基酸)，并在大腸桿菌中表達(dá)成功。2.重組目的基因與載體的重組，整個(gè)過(guò)程是在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行，是各種限制性內(nèi)切酶、連接酶巧妙運(yùn)用的結(jié)果。DNA重組的產(chǎn)物稱重組體。因轉(zhuǎn)入活細(xì)胞后能復(fù)制增殖，所以是一種無(wú)性繁殖體系英文稱為克隆(Clone)。因而重組體也稱為克隆。有時(shí)把DNA重組的操作過(guò)程也稱為“克隆”。3.轉(zhuǎn)化由質(zhì)粒作載體形成的克隆，轉(zhuǎn)入細(xì)菌時(shí)細(xì)菌預(yù)先要在低溫條件下用氯化鈣處理，形成“感受態(tài)”細(xì)胞。即增加細(xì)胞膜的通透性才能實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。由噬菌體作載體的克隆，轉(zhuǎn)入細(xì)胞的

53、過(guò)程稱為“侵染”。因噬菌體具有自動(dòng)侵入的功能。細(xì)菌不用預(yù)先處理?！案惺軕B(tài)”細(xì)胞未經(jīng)特殊處理的培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)重組DNA分子不敏感,難以轉(zhuǎn)化成功，只有經(jīng)Cacl2處理之后的敏感細(xì)胞才有較高的轉(zhuǎn)化頻率，這種細(xì)胞稱為“感受態(tài)”細(xì)胞。（三）DNA重組技術(shù)的意義 (1)不同來(lái)源的、無(wú)關(guān)的基因在實(shí)驗(yàn)室中可以按人的愿望進(jìn)行重組構(gòu)建。 (2)重組的外源基因引入另一種生物細(xì)胞后，可以被增殖并保持原有遺傳性狀，在新的環(huán)境中轉(zhuǎn)錄和翻譯。使宿主的遺傳性狀按照設(shè)計(jì)的路線發(fā)生永久性的改變。這是生物科學(xué)上的重大進(jìn)展，開辟了人類主動(dòng)改造生物的途徑。四、轉(zhuǎn)基因技術(shù)1982年P(guān)almiter等人首次將大白鼠的生長(zhǎng)激素基因放在質(zhì)粒中小白

54、鼠金屬巰基蛋白啟動(dòng)子之后。這個(gè)啟動(dòng)子通常在染色體上，控制金屬巰基蛋白的轉(zhuǎn)錄。金屬巰基蛋白富含半胱氨酸、對(duì)重金屬有很高的親合力。肝臟在合成這種保護(hù)性蛋白時(shí)要靠重金屬，如銅的誘導(dǎo)。轉(zhuǎn)基因技術(shù)實(shí)例“碩鼠”或“超級(jí)鼠”的產(chǎn)生將重組好的這種質(zhì)粒(幾百個(gè)拷貝)用特制的微量注射器注入小鼠受精卵的雄性原細(xì)胞核(plonucleus)中，再將這個(gè)受精卵植入小鼠子宮中。結(jié)果發(fā)育生成的小鼠中經(jīng)Southern雜交證明許多小鼠中都含有大白鼠的生長(zhǎng)激素基因。而且成熟的小鼠體重比對(duì)照大兩倍，成為“碩鼠”或“超級(jí)鼠”。這些小鼠中的生長(zhǎng)激素水平相當(dāng)于對(duì)照的500倍。這個(gè)實(shí)驗(yàn)首次證明，外源基因在新的啟動(dòng)子控制下可以整合到哺乳類

55、細(xì)胞核內(nèi)，并在其中實(shí)現(xiàn)有效地表達(dá)。這是一項(xiàng)重大的突破。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的出現(xiàn)1986年美國(guó)的Wagner等首先制備出轉(zhuǎn)生長(zhǎng)激素基因的豬，這種豬生長(zhǎng)快，飼料轉(zhuǎn)換率和瘦肉率顯著提高而肥膘低，與注射生長(zhǎng)激素的效果相同。我國(guó)北京農(nóng)業(yè)大學(xué)也制備出轉(zhuǎn)基因豬和羊。然而，轉(zhuǎn)生長(zhǎng)激素基因的豬生殖能力明顯下降，不能繁殖擴(kuò)群。國(guó)外轉(zhuǎn)基因動(dòng)物出現(xiàn)畸形等。這些問(wèn)題的出現(xiàn)表明，轉(zhuǎn)基因技術(shù)中有關(guān)外源基因與染色體的定位重組，表達(dá)調(diào)控等還有待深入研究。生物反應(yīng)器人們?cè)O(shè)想用轉(zhuǎn)基因技術(shù)使轉(zhuǎn)基因動(dòng)物來(lái)生產(chǎn)某些蛋白類藥物。1991年國(guó)外首先將1抗胰蛋白酶基因置于綿羊的-乳球蛋白基因的調(diào)控成分之下，制成轉(zhuǎn)基因綿羊。當(dāng)這種綿羊長(zhǎng)大繁殖時(shí)，乳腺內(nèi)基因開放表達(dá)奶中各種蛋白，此時(shí)1-抗胰蛋白酶基因在-乳球蛋白調(diào)控成分調(diào)控下也開放，結(jié)果表達(dá)出1-抗胰蛋白酶(一種藥物)。奶中含量高達(dá)每升35g，產(chǎn)量十分可觀。這種轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物稱為“生物反應(yīng)器”。我國(guó)也正在研制。它潛在性的經(jīng)濟(jì)效應(yīng)將促進(jìn)這項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展。轉(zhuǎn)基因外源基因在新的啟動(dòng)子控制下可以整合到哺乳類細(xì)胞核內(nèi)，并在其中實(shí)現(xiàn)有效地表達(dá)。五、體細(xì)胞克隆技術(shù) 1997年Natur