2022年蛋白質(zhì)概論教學(xué)課件

1、蛋白質(zhì)概論蛋白質(zhì)是全部生物中非常重要的結(jié)構(gòu)分子和功能分子，幾乎全部的生命現(xiàn)象和生物功能都是蛋白質(zhì)作用的結(jié)果，因此，蛋白質(zhì)是現(xiàn)代生物技術(shù)，尤其是基因工程，蛋白質(zhì)工程'酶工程等研究的重點(diǎn)和歸宿點(diǎn)。一、蛋白質(zhì)的化學(xué)組成與分類(lèi)1、元素組成碳50%氫7%氧23%氮16%硫0-3%微量的磷、鐵、銅、碘、鋅、相凱氏定氮：平均含氮16%,粗蛋白質(zhì)含量二蛋白氮X6.252、氨基酸組成從化學(xué)結(jié)構(gòu)上看，蛋白質(zhì)是由20種L-型a氨基酸組成的長(zhǎng)鏈分子。3、分類(lèi)、按組成:簡(jiǎn)單蛋白：完全由氨基酸組成結(jié)合蛋白：除蛋白外還有非蛋白成分輔基詳細(xì)分類(lèi)，P75范表3-1,范表3-2o注意輔基的組成。2、按分子外形的對(duì)稱(chēng)程度：

2、球狀蛋白質(zhì)：分子對(duì)稱(chēng)，外形接近球狀，溶化度好，能結(jié)晶，大多數(shù)蛋白質(zhì)屬此類(lèi)。纖維狀蛋白質(zhì)：對(duì)稱(chēng)性差，分子類(lèi)似細(xì)棒或纖維狀。3、功能分:酶'運(yùn)輸?shù)鞍?#39;營(yíng)養(yǎng)和貯存蛋白、激素、受體蛋白、運(yùn)動(dòng)蛋白'結(jié)構(gòu)蛋白、防備蛋白。4、蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)的分布含量（干重）微生物50-80%人體45%一般細(xì)胞50%種類(lèi)大腸桿菌3000種人體10萬(wàn)種生物界1010-1012二'蛋白質(zhì)分子大小與分子量蛋白質(zhì)是由20種根本aa組成的多聚物，aa數(shù)目由幾個(gè)到成百上千個(gè)，分子量從幾千到幾千萬(wàn)。一般情況下，少于50個(gè)aa的低分子量aa多聚物稱(chēng)為肽，寡肽或生物活性肽，有時(shí)也罕稱(chēng)多肽。多于50個(gè)aa的稱(chēng)為

3、蛋白質(zhì)。但有時(shí)也把含有一條肽鏈的蛋白質(zhì)不嚴(yán)謹(jǐn)?shù)胤Q(chēng)為多肽。此時(shí)，多肽一詞著重于結(jié)構(gòu)意義，而蛋白質(zhì)原則強(qiáng)調(diào)了其功能意義。P76范表3-3注意：?jiǎn)误w蛋白'寡聚蛋白；殘基數(shù)、肽鏈數(shù)。蛋白質(zhì)分子量二aa數(shù)目x110對(duì)于任一給定的蛋白質(zhì)，它的全部分子在氨基酸組成、順序、肽鏈長(zhǎng)度、分子量等方面都是相同的，均一性。三、蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象與結(jié)構(gòu)層次蛋白質(zhì)分子是由氨基酸首尾連接而成的共價(jià)多肽鏈，每一種天然蛋白質(zhì)都有自己特有的空間結(jié)構(gòu)，這種空間結(jié)構(gòu)稱(chēng)為蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象。P77圖37,蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象示意圖。一級(jí)結(jié)構(gòu)氨基酸順序二級(jí)結(jié)構(gòu)a螺旋、B折疊'B轉(zhuǎn)角，無(wú)規(guī)卷曲三級(jí)結(jié)構(gòu)a螺旋、B折疊'B轉(zhuǎn)角

4、'松散肽段四級(jí)結(jié)構(gòu)多亞基聚集四'蛋白質(zhì)功能的多樣性細(xì)胞中含量最豐實(shí)、功能最多的生物大分子。1 .酶2 .結(jié)構(gòu)成分結(jié)締組織的膠原蛋白'血管和皮膚的彈性蛋白,膜蛋白3 .貯藏卵清蛋白、種子蛋白4 .物質(zhì)運(yùn)輸血紅蛋白、Na+-K+-ATPase、葡萄糖運(yùn)輸載體、脂蛋白、電子傳遞體5 .細(xì)胞運(yùn)動(dòng)肌肉收縮的肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白6 .激素功能胰島素7 .防備抗體,皮膚的角蛋白、血凝蛋白8 .接受、傳遞信息受體蛋白，味覺(jué)蛋白9 .調(diào)節(jié)、操縱細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、和遺傳信息的范表達(dá)組蛋白、阻遏蛋白第二節(jié)氨基酸一、蛋白質(zhì)的水解（見(jiàn)P79）氨基酸是蛋白質(zhì)的根本結(jié)構(gòu)單位。在酸'堿'蛋

5、白酶的作用下，可以被水解成氨基酸單體。酸水解：色氨酸破壞，天冬酰胺、谷胺酰胺脫酰胺基堿水解：消旋，色氨酸穩(wěn)定酶水解：水解位點(diǎn)特異，用于一級(jí)結(jié)構(gòu)分析，肽譜氨基酸的功能：1、組成蛋白質(zhì)2、一些aa及其衍生物充當(dāng)化學(xué)信號(hào)分子-aminoybutyricacid-氨基丁酸）'Serotonic（5-羥色胺，血清緊張素）、melatonin（褪黑激素，N-乙酰-甲氧基色胺），都是神經(jīng)遞質(zhì)，后二者是色氨酸衍生物（神經(jīng)遞質(zhì)是一個(gè)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生的影響第二個(gè)神經(jīng)細(xì)胞或肌肉細(xì)胞功能的物質(zhì)）。丫（Thyroxine（甲狀腺素，動(dòng)物甲狀腺thyroidgland產(chǎn)生的Tyr衍生物）和口引乙酸（植物中的Trp衍生

6、物）都是激素（激素就是一個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生的調(diào)節(jié)其它細(xì)胞的功能的化學(xué)信號(hào)分子）o3、氨基酸是許多含N分子的前體物核甘酸和核酸的含氮堿基'血紅素'葉綠素的合成都需要aa4、一些根本氨基酸和非根本aa是代謝中間物精氨酸'CitrulIine（瓜氨酸）、Ornithine（鳥(niǎo)氨酸）是尿素循不（Ureacycle）的中間物，含氮廢物在脊椎動(dòng)物肝臟中合成尿素是排解它們的一種重要機(jī)制。三、氨基酸的結(jié)構(gòu)與分類(lèi)1809年發(fā)覺(jué)Asp,1938年發(fā)Thr,目前已發(fā)覺(jué)180多種。但是組成蛋白質(zhì)的aa常見(jiàn)的有20種，稱(chēng)為根本氨基酸編碼的蛋白質(zhì)氨基酸，還有一些稱(chēng)為稀有氨基酸，是多肽合成后由根本aa經(jīng)酶促

7、修飾而來(lái)。此外還有存在于生物體內(nèi)但不組成蛋白質(zhì)的非蛋白質(zhì)氨基酸（約150種）。一編碼的蛋白質(zhì)氨基酸20種也稱(chēng)根本氨基酸或標(biāo)準(zhǔn)氨基酸，有對(duì)應(yīng)的遺傳密碼。近年發(fā)覺(jué)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶中存在硒代半胱氨酸，有證據(jù)范說(shuō)明此氨基酸由終止密碼UGA編碼，可能是第21種蛋白質(zhì)氨基酸。結(jié)構(gòu)通式：不變局部，可變局部。L-型，粉酸的a-碳上接-NH2,所以都是L-a-氨基酸。a-氨基酸都是白色晶體，熔點(diǎn)一般在200以上。除胱氨酸和酪氨酸外都能溶于水，脯氨酸和羥脯氨酸還能溶于乙醇和乙醛。范表20種氨基酸結(jié)構(gòu)1、按照R基的化學(xué)結(jié)構(gòu)分蛋白質(zhì)工程的同源替代：1、R為脂肪燃基的氨基酸5種GIy、Ala、Vai、Leu、lie、

8、圖3-2R基均為中性烷基Gly為H，R基對(duì)分子酸堿性影響很小，它們幾乎有相同的等電點(diǎn)。6.0±0.03P92范表3-7比擬等電點(diǎn)。Gly是唯一不含手性碳原子的氨基酸，因此不具旋光性。從Gly至lie,R基團(tuán)疏水性增加，lie是這20種a.a中脂溶性最強(qiáng)的之一除Phe2.5、Trp3.4、Tyr2.3以外。2、R中含有羥基和硫的氨基酸共4種含羥基的有兩種：Ser和Thr。圖3-3Ser的-CH20H基pKa=15，在生理?xiàng)l件下不解離，但它是一個(gè)極性基團(tuán)，能與其它基團(tuán)形成氫鍵，具有重要的生理意義。在大多數(shù)酶的活性中心都發(fā)覺(jué)有Ser殘基存在。Thr中的-0H是仲醇，具有親水性，但此-0H形

9、成氫鍵的能力較弱，因此，在蛋白質(zhì)活性中心中很少出現(xiàn)。Ser和Thr的-0H往往與糖鏈相連，形成糖蛋白。含硫的兩種：Cys、Met圖3-4Cys中R含筑基-SH，Cys具有兩個(gè)重要性質(zhì)：1在較高pH值條件，端基離解。2兩個(gè)Cys的硫基氧化生成二硫鍵，生成胱氨酸。Cys-s-sCys二硫鍵在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)中具有重要意義。Cys還常常出現(xiàn)在酶的活性中心。Met的R中含有甲硫基-SCH3,硫原子有親核性，易發(fā)生極化，因此，Met是一種重要的甲基供體。Cys與結(jié)石u在細(xì)胞外液如血液中，Cys以胱氨酸(Cystine)氧化形式存在，胱氨酸的溶化性最差。胱氨酸尿(Cystinuria)是一種遺傳病，由于胱氨酸

10、的跨膜運(yùn)輸缺陷導(dǎo)致大量的胱氨酸排泄到尿中。胱氨酸在腎(Kidney)、輸尿管(ureter)x膀胱(urinarybladder)中結(jié)晶形成結(jié)石(CaIcuIus,calculi),結(jié)石會(huì)導(dǎo)致疼疼、發(fā)炎甚至尿血。大量服用青霉胺(PeniciIIcemine)能降低腎中胱氨的含量，因?yàn)榍嗝拱放c半胱氨酸形成的化合物比胱氨酸易溶化。青霉胺的結(jié)構(gòu)3、R中含有酰胺基團(tuán)2種AsnxGIn圖3-5酰胺基中氨基易發(fā)生氨基轉(zhuǎn)移反響，轉(zhuǎn)氨基反響在生物合成和代謝中有重要意義4、R中含有酸性基團(tuán)2種Asp、Glu,一般稱(chēng)酸性氨基酸圖36Asp側(cè)鏈竣基pKaB-COOH為3.86,Glu側(cè)鏈翔基pKay-COOH為4.

11、25它們是在生理?xiàng)l件下帶有負(fù)電荷的僅有的兩個(gè)氨基酸。5、R中含堿性基團(tuán)3種Lys、Arg、His,一般稱(chēng)堿性氨基酸圖3-7Lys的R側(cè)鏈上含有一個(gè)氨基，側(cè)鏈氨基的pKa為10.53。生理?xiàng)l件下，Lys側(cè)鏈帶有一個(gè)正電荷一NH3+，同時(shí)它的側(cè)鏈有4個(gè)C的直鏈，柔性較大，使側(cè)鏈的氨基反響活性增大。如肽聚糖的短肽間的連接Arg是堿性最強(qiáng)的氨基酸，側(cè)鏈上的服基是已知堿性最強(qiáng)的有機(jī)堿，pKa值為12.48,生理?xiàng)l件下完全質(zhì)子化。His含咪嗖環(huán)，咪嘎環(huán)的pKa在游離氨基酸中和在多肽鏈中不同，前者pKa為6.00,后者為7.35,它是20種氨基酸中側(cè)鏈pKa值最接近生理pH值的一種，在接近中性pH時(shí)，可離解

12、平衡。它是在生理pH條件下唯一具有緩沖能力的氨基酸。His含咪理環(huán)，一側(cè)去質(zhì)子化和另一側(cè)質(zhì)子化同步進(jìn)行，因而在酶的酸堿催化機(jī)制中起重要作用。6、R中含有芳基的氨基酸3種Phe、Try、Trp圖3-8都具有共軻n電子體系,易與其它缺電子體系或n電子體系形成電荷轉(zhuǎn)移復(fù)合物(charge-transfercompIex)或電子重疊復(fù)合物。在受體一底物、或分子相互識(shí)別過(guò)程中具有重要作用。這三種氨基酸在紫外區(qū)有特別汲取峰，蛋白質(zhì)的紫外汲取主要來(lái)自這三種氨基酸，在280nm處，Trp>Tyr>RheoPhe疏水性最強(qiáng).。酪氨酸的-0H磷酸化是一個(gè)十分普遍的調(diào)控機(jī)制，Tyr在較高pH值時(shí)，酚羥基

13、離解。Trp有復(fù)雜的n共輾休系，比Phe和Tyr更易形成電荷轉(zhuǎn)移絡(luò)合物。7、R為環(huán)狀的氨基酸1種Pro,有時(shí)也把His、Trp歸入此類(lèi)。圖3-9Pr。是唯一的一種環(huán)狀結(jié)構(gòu)的氨基酸，它的a-亞氨基是環(huán)的一局部，因此具有特別的剛性結(jié)構(gòu)。它在蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)中具有極重要的作用，一般出現(xiàn)在兩段a-螺旋之間的轉(zhuǎn)角處，Pro殘基所在的位置必定發(fā)生骨架方向的變化，必需氨基酸：u成年人：Leu、lie、Vai、Thr、Met、TrpvLys、Phe嬰兒期：Arg和His供應(yīng)缺乏，屬半必須氨基酸。必須氨基酸在人體內(nèi)不能合成，是由于人體內(nèi)不能合成這些氨基酸的碳架a-酮酸2、按照R基的極性性質(zhì)（能否與水形成氫鍵）20

14、種根本aa,可以分為4類(lèi)：側(cè)鏈極性（疏水性程度）GIy0Ser-0.3GIu-2.5Lys-3.0AIa0.5Asn-0.2Asp-2.5Arg-3.0Met1.3Gin-0.2His0.5Pro1.4Thr0.4Vai1.5Cys1.0Leu1.8Tyr2.3Ile1.8Phe2.5Trp3.41、非極性氨基酸9種，包含：甘氨酸、丙氨酸'綴氨酸'亮氨酸、異氨酸'苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸氨酸'脯氨酸，這類(lèi)氨基酸的R基都是疏水性的，在維持蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)中起著重要作用。2、不帶電何的極性氨基酸6種，絲氨酸'蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺。這

15、類(lèi)氨基酸的側(cè)鏈都能與水形成氫鍵，因此很簡(jiǎn)單溶于水。酪氨酸的-0H磷酸化是一個(gè)十分普遍的調(diào)控機(jī)制，Ser和Thr的-0H往往與糖鏈相連，Asn和Gin的-NH2很簡(jiǎn)單形成氫鍵，因此能增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。3、帶負(fù)電荷的aa（酸性aa）2種，在pH67時(shí)，谷氨酸和天冬氨酸的第二個(gè)粉基解離，因此，帶負(fù)電何。4、帶正電何的aa（堿性aa）3種，Arg、Lys、Hiso在pH7時(shí)帶凈正電荷。當(dāng)膠原蛋白中的Lys側(cè)鏈氧化時(shí)能形成很強(qiáng)的分子間（內(nèi)）交聯(lián)。Arg的胚基堿性很強(qiáng),與NaOH相當(dāng)。His是一個(gè)弱堿，在pH7時(shí)約10%質(zhì)子化，是天然的緩沖劑，它往往存在于許多酶的活性中心。酶的活性中心：His、Serv

16、Cys非極性aa一般位于蛋白質(zhì)的疏水核心，帶電荷的aa和極性aa位于范外表。二非編碼的蛋白質(zhì)氨基酸也稱(chēng)修飾氨基酸，是在蛋白質(zhì)合成后，由根本氨基酸修飾而來(lái)。-竣基谷氨酸，能結(jié)合Ca2+。yProthrombin（凝血酶原）中含有結(jié)締組織中最豐富的蛋白質(zhì)膠原蛋白含有大量4-羥脯氨酸和5-羥賴(lài)氨酸。圖370修飾aa的結(jié)構(gòu)14-羥脯氨酸(25-羥賴(lài)氨酸這兩種氨基酸主要存在于結(jié)締組織的纖維狀蛋白如膠原蛋白中。36-N-甲基賴(lài)氨酸存在于肌球蛋白中(4)-竣基谷氨酸存在于凝血酶原及某些具有結(jié)合Ca2+離子功能的蛋白質(zhì)中。5Tyr的衍生物：3.5-二碘酪氨酸、甲狀腺素甲狀腺蛋白中6鎖鏈素由4個(gè)Lys組成彈性蛋

17、白中。三非蛋白質(zhì)氨基酸除參與蛋白質(zhì)組成的20多種氨基酸外，生物體內(nèi)存在大量的氨基酸中間代謝產(chǎn)物，它們不是蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)單元，但在生物體內(nèi)具有很多生物學(xué)功能，如尿素循環(huán)中的L-瓜氨酸和L-鳥(niǎo)氨酸。1L-型a-氨基酸的衍生物L(fēng)-瓜氨酸圖L-鳥(niǎo)氨酸圖2D-型氨基酸D-GluxD-Ala肽聚糖中、D-Phe短桿菌肽S33-v丫-、6-氨基酸3-Ala泛素的前體、丫-氨基丁酸神經(jīng)遞質(zhì)。四、氨基酸的構(gòu)型'旋光性和光汲取1、氨基酸的構(gòu)型除Gly外，19種氨基酸的a-碳原子都是不對(duì)稱(chēng)碳原子，因此有兩種光學(xué)異構(gòu)體，而Thr和lie的B-碳原子也是不對(duì)稱(chēng)的，因此Thr、lie各有兩個(gè)不對(duì)稱(chēng)碳原子，有四種光學(xué)

18、異構(gòu)體。圖P86L-蘇氨酸D-蘇氨酸L-別一蘇D-別-蘇構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸均屬L-型L-蘇氨酸，大局部游離氨基酸也是L-型。2、旋光性20種氨基酸中，只有Gly無(wú)手性碳。Thr、lie各有兩個(gè)手性碳。其余17種氨基酸的L型與D型互為鏡象關(guān)系，互稱(chēng)光學(xué)異構(gòu)體對(duì)映體，或立體異構(gòu)體。一個(gè)異構(gòu)體的溶液可使偏振光逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)記為一。另一個(gè)異構(gòu)體可使偏振光順時(shí)針旋轉(zhuǎn)計(jì)為+，稱(chēng)為旋光性。光學(xué)異構(gòu)體的其它理化性質(zhì)完全相同。外消旋物：D-型和1_-型的等摩爾混合物。L-蘇氨酸和D-蘇氨酸'L-別一蘇氨酸和D-別-蘇氨酸分別組成消旋物，而L-D-蘇氨酸和L-D-別一蘇氨酸則是非對(duì)映體。旋光性物質(zhì)在化學(xué)反響時(shí)

19、經(jīng)過(guò)對(duì)稱(chēng)的過(guò)度態(tài)時(shí)會(huì)發(fā)生消旋現(xiàn)象。蛋白質(zhì)在與堿共熱水解時(shí)或用一般的化學(xué)方法人工合成氨基酸時(shí)也會(huì)得到無(wú)旋光性的D-、L-消旋物。內(nèi)消旋物：分子內(nèi)消旋胱氨酸有三種立體異構(gòu)體：L-胱氨酸,D-胱氨酸'內(nèi)消旋胱氨酸。L-胱氨酸和D-胱氨酸是外消旋物圖P86L-胱氨酸D-胱氨酸內(nèi)消旋胱氨酸：分子內(nèi)部相互抵消而無(wú)旋光性蛋白質(zhì)中L型氨基酸的比旋光度P87蛋白質(zhì)中L型氨基酸的比旋光度。氨基酸的旋光符號(hào)和大小取決于它的R基的性質(zhì)，并與溶液的PH值有關(guān)PH值影響氨基和粉基的解離。3、氨基酸的光汲取性20種氨基酸在可見(jiàn)光地域無(wú)光汲取，在遠(yuǎn)紫外區(qū)220nm均有光汲取，在近紫外區(qū)220-300nm只有Tyr、P

20、he、Trp有汲取。Tyr、Phe、Trp的R基含有共輾雙鍵，在220-300所紫外區(qū)有汲取。人nmETyr2751.4X103Phe2572.0X102Trp2805.6X103Lambert-Beer：五'氨基酸的酸堿性質(zhì)重點(diǎn)1、氨基酸在晶體和水溶液中主要以兼性離子形式存在a-氨基酸都含有-C00H和-NH2,都是不揮發(fā)的結(jié)晶固體，熔點(diǎn)200-350,不溶于非極性溶劑，而易溶于水，這些性質(zhì)與典型的竣酸R-C00H）或胺R-NH2明顯不同。三個(gè)現(xiàn)象：晶體溶點(diǎn)高T離子晶格，不是分子晶格。不溶于非極性溶劑T極性分子介電常數(shù)高氨基酸使水的介電常數(shù)增高，而乙醇、丙酮使水的介電常數(shù)降低。T水溶

21、液中的氨基酸是極性分子。原因：a-粉基pK1在2.0左右，當(dāng)pH>3.5,a-竣基以-C00-形式存在。a-氨基pK2在9.4左右，當(dāng)pH<8.0時(shí)，a-氨基以a-NH+3形式存在。在pH3.5-8.0時(shí)，帶有相反電荷，因此氨基酸在水溶液中是以?xún)尚噪x子離子形式存在。Gly溶點(diǎn)232比相應(yīng)的乙酸16.51、乙胺(-80.5)高，可推測(cè)氨基酸在晶體狀態(tài)也是以?xún)尚噪x子形式存在。圖2、氨基酸的兩性解離和酸堿滴定曲線(xiàn)HAA-+H+pH=pKa/+Log共輾堿/共聊酸pOH=pKb/+Log共輾酸/共輾堿1pH>pKa/時(shí)，堿>酸pH=pKa/時(shí)，堿=酸pH<pKa/時(shí)，酸&

22、gt;堿2pKa/就是堿二酸時(shí)溶液的pH值，Ka/就是此時(shí)溶液的H+3當(dāng)堿二酸時(shí)，溶液的pH值等于pKa/4Gly的兩性解離和滴定曲線(xiàn)圖374Gly的滴定曲線(xiàn)在pH2.34和pH9.60處，Gly具有緩沖能力。滴定開(kāi)始時(shí)，溶液中主要是Gly+。起點(diǎn)：100%Gly+凈電荷：+1第一拐點(diǎn)：50%Gly+,50%Gly±平均凈電荷：+0.5第二拐點(diǎn)：100%Gly土凈電荷：0等電點(diǎn)pl第三拐點(diǎn)：50%Gly±,50%GIy-平均凈電荷：-0.5終點(diǎn)：100%GIy凈電荷：-1第一拐點(diǎn)：pH=pK+lgGly±/Gly+,pH=pK1=2.34第二拐點(diǎn)：100%Gly土

23、，凈電荷為0,此時(shí)的pH值稱(chēng)氨基酸的等電點(diǎn)pl。第三拐點(diǎn)：pH=pK2+lgGly-/Gly±=pK2=9.6Gly的等電點(diǎn)：等電點(diǎn)時(shí)：GIy-=GIy+等電點(diǎn)時(shí)氫離子濃度用I范表示I2=K1K2PI=1/2(pK1+pK2)氨基酸在等電點(diǎn)狀態(tài)下，溶化度最小pH>pl時(shí)，氨基酸帶負(fù)電荷,-C00H解離成-C00-,向正極移動(dòng)。pH=pl時(shí)，氨基酸凈電荷為零pH<pl時(shí)，氨基酸帶正電荷，-NH2解離成-N+H3,向負(fù)極移動(dòng)。以Gly為例pH>2.34正+1.0+0.5pH=2.34正+0.52.34<pH<5.97正0.505.97<pH<9.

24、60負(fù)00.5pH>9.60負(fù)-0.51.0問(wèn)題：1pH二pKa/時(shí)，緩沖能力最大，等電點(diǎn)時(shí)緩沖能力最小。為什么？2pl的計(jì)算氨基酸，寡肽，等電點(diǎn)時(shí)各組分的比例分析3不同pH下的組成分析和電泳行為pH>pl時(shí)，氨基酸帶負(fù)電荷，-C00H解離成-C00-,向正極移動(dòng)。pH=pl時(shí)，氨基酸凈電荷為零，溶化度最小pH<pl時(shí)，氨基酸帶正電荷，-NH2解離成-N+H3,向負(fù)極移動(dòng)。4利用pl和pKa/確定各種氨基酸合適的酸堿緩沖范圍5計(jì)算不同氨基酸水溶液的pH值6繪制滴定曲線(xiàn)Glu依據(jù)P92頁(yè)范表3-7中G中的數(shù)據(jù)（pK1a-C00H2.19,pK2a-N+H39.67,pKRR-C

25、OOH4.25,pl3.22繪出滴定曲線(xiàn)指出GIu-和GIu二各一半時(shí)的pH值指出Glu總是帶正電荷的pH范圍指出GIu土和GIu-能作為緩沖液使用的pH范圍解：見(jiàn)圖GIu-和GIu=各50%時(shí)pH為9.67pH<3.22時(shí)Glu總帶正電荷Glu土和Glu-緩沖范圍pH4.25左右P92范表3-7,氨基酸的范表觀(guān)解離常數(shù)和等電點(diǎn)從范表中P92可以看出，氨基酸的a-峻基pKa在1.8-2.6間，比典型竣基的pKa如乙酸pKa為4.76要小很多，說(shuō)明氨基酸粉基的酸性此一般粉基強(qiáng)100倍以上。主要原因是氨基酸中a-氨基對(duì)a-粉基解離的影響場(chǎng)效應(yīng)。圖范表中只有His的咪嗖基側(cè)鏈在生理?xiàng)l件下不帶電

26、荷。在生理?xiàng)l件下，只有His有緩沖能力。血紅蛋白中His含量高，在血液中具很強(qiáng)的緩沖能力。六'氨基酸的化學(xué)性質(zhì)一a-NH2參加的反響1、?；错戸；噭喝斞貂Ｂ?#39;叔丁氧甲酰氯、苯二甲酸酊、對(duì)-甲苯磺酰氯。這些酰化劑在多肽和蛋白質(zhì)的人工合成中被用作氨基愛(ài)護(hù)劑。丹磺酰氯CDNS-c1,5二甲基氨基蔡T-磺酰氯DNScI可用于多肽鏈一NH2末端氨基酸的標(biāo)記和微量氨基酸的定量測(cè)定。圖NGIyAIaSerLeuPheC-TTDNSGIyAIaSer-Leu-PheC水解DNSGly、Ala、Ser、Leu、PheDNS-氨基酸在紫外光激發(fā)后發(fā)黃色熒光。蛋白質(zhì)的合成圖生物體內(nèi)在酶和ATP

27、存在條件下，竣酸也可與氨基酸的氨基作用，形成酰基化產(chǎn)物。苯甲酸與Gly的氨基的?；错懯巧矬w內(nèi)解毒作用的一個(gè)典型的例子。將經(jīng)過(guò)勻漿的動(dòng)物肝臟組織與Gly、苯甲酸和ATP混合保溫，從混合液中可別離出N-苯甲酸一Glyo圖苯甲酸是食品防腐劑，在生物體內(nèi)轉(zhuǎn)變成N-苯甲酰-Gly后，可經(jīng)尿排出。2、烷基化反響a-氨基中的氮是一個(gè)親核中心，能發(fā)生親核取代反響。肌氨酸是存在于生物組織中重要的組分，它是Gly甲基化的產(chǎn)物：圖強(qiáng)親電的有機(jī)物能與a-NH2發(fā)生烷基化反響。第一次X中使用的芥子氣，它的主要作用是使氨基酸的a-氨基烷基化，從而破壞蛋白質(zhì)的正常功能。圖Sanger反響2.4一二硝基氟茉，DNFP圖

28、二硝基苯基氨基酸DNP-氨基酸，黃色，層析法鑒定，被Sanger用來(lái)測(cè)定多肽的NH2末端氨基酸。Edman反響苯異硫氟酸酯，PITC)圖苯氨基硫甲酰衍生物PTC-氨基酸T苯乙內(nèi)酰硫服衍生物PTH-氨基酸PTH-氨基酸，無(wú)色，可以用層析法別離鑒定。被Edman用來(lái)鑒定多肽的NH2末端氨基酸生成西佛堿的反響Schiff氨基酸的a氨基與醛類(lèi)反響，生成西佛堿。圖西佛堿是某些酶促反響的中間產(chǎn)物如轉(zhuǎn)氨基反響的中間產(chǎn)物。含硫氨基酸的烷基化反響硫原子也是親核中心，可發(fā)生親核取代反響。生物體內(nèi)，最重要的甲基化劑是S-腺昔甲硫氨酸SAM，是由Met與ATP作用得到的S-烷基化產(chǎn)物。圖在酶催化下，SAM可以使多種生

29、物分子的氨基甲基化，如磷脂酰膽堿的生物合成。圖S-腺口票吟核昔-高半胱氨酸比Cys多一個(gè)CH2二a-竣基參加的反響成鹽、成酯分別與堿'醇作用成酰氯的反響使藪基活化氨基被愛(ài)護(hù)后，竣基可與二氯亞碉或五氯化磷反響，生成酰氯。此反響使氨基酸的竣基活化，易與另一個(gè)氨基酸的氨基結(jié)合，在多肽的人工合成中常用。三CL-NH2和a-COOH共同參加的反響1、與苗三酮反響茴三酮在弱酸中與a-氨基酸共熱，引起氨基酸的氧化脫氨，脫猿反響，最后，茴三酮與反響產(chǎn)物氨和復(fù)原茴三酮反響，生成紫色物質(zhì)。入max=570nm圖定性、定量。四側(cè)鏈R基參加的反響用于蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾不作要求，只提一下，陶慰孫第四章七、氨基酸的

30、別離和分析1、電泳別離電泳的根本原理舉例:GluvLeu、His、Lys,4種混合樣，在pH6.0時(shí)，泳動(dòng)方向及相對(duì)速度。GIuLeuHisLyspl3.225.987.599.74圖2、濾紙層析和薄層層析分配原理3、離子交換層析別離氨基酸磺酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂圖樹(shù)脂先用含Na的緩沖液處理成鈉鹽，且pH在2左右，將氨基酸混合液PH2-3上柱，氨基酸此時(shí)是陽(yáng)離子，與樹(shù)脂上的鈉離子交換，被固定在樹(shù)脂上。作用力：1靜電吸引，2氨基酸側(cè)鏈與樹(shù)脂基質(zhì)（聚苯乙烯）的疏水作用力氨基酸分析儀第三節(jié)肽peptide一、肽和肽鍵的結(jié)構(gòu)肽：是由一個(gè)氨基酸的粉基和另一個(gè)氨基酸的氨基脫水縮合而成的化合物。肽鍵：氨基酸間脫

31、水后形成的共價(jià)鍵稱(chēng)肽鍵酰氨鍵，其中的氨基酸單位稱(chēng)氨基酸殘基。由兩個(gè)氨基酸形成的肽叫二肽，少于10個(gè)氨基酸的肽叫寡肽，多于10個(gè)氨基酸的肽叫多肽。結(jié)構(gòu)：P111±5肽主要重復(fù)單位:側(cè)鏈R：由不同的氨基酸殘基構(gòu)成名稱(chēng)：絲氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸寫(xiě)法：NSer-GlyTry-Ala-Leu或SGYAl_,如果倒過(guò)來(lái)寫(xiě)，則范表示不同的肽，如LeuAlaTyrGlySer。肽鍵的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：1酰胺氮上的孤對(duì)電子與相鄰皴基之間的共振作用，形成共振雜化體，穩(wěn)定性高。2肽鍵具有局部雙鍵性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)，具有平面性。圖P111下肽鍵結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)1中，C-N單鍵長(zhǎng)0.148nm結(jié)構(gòu)2中，C=N雙鍵長(zhǎng)0.

32、127nm結(jié)構(gòu)3中，CN鍵長(zhǎng)0.132nm,6個(gè)原子幾乎處在同一平面內(nèi)（酰氨平面。肽鍵結(jié)構(gòu)介于1和2之間結(jié)構(gòu)3,是結(jié)構(gòu)1和結(jié)構(gòu)2之間的平均中間狀態(tài)。CN單鍵具有的40%的雙鍵性質(zhì)，C=0雙鍵具有40%的單鍵性質(zhì)。3肽鍵亞氨基在pHO14內(nèi)不解離。4肽鏈中的肽鍵一般是反式構(gòu)型，而Pro的肽鍵可能出現(xiàn)順、反兩種構(gòu)型.二'肽的重要性質(zhì)1、旋光性一般短肽的旋光度等于其各個(gè)氨基酸的旋光度的總和。蛋白質(zhì)水解得到的各種短肽，只要不發(fā)生消旋作用，也具有旋光性。2、肽的酸堿性質(zhì)短肽在晶體和水溶液中也是以偶極離子形式存在。在pHO14范圍內(nèi)，肽鍵中的亞氨基不解離，因此肽的酸堿性質(zhì)主要取決于N端aNH2和C

33、端a-COOH以及側(cè)鏈R上可解離的基團(tuán)。在長(zhǎng)肽或蛋白質(zhì)中，可解離的基團(tuán)主要是側(cè)鏈基團(tuán)。肽中的末端aCOOHpK值比游離a.a中的大一些，而末端aN+H3的pK值比游離氨基酸中的小一些，R基變化不大。pK值改變的原因：見(jiàn)P113、范表38,比擬范表38中Gly-Gly和Gly-Gly-GlyGIyGIuLysAIa的解離：圖P113pH占優(yōu)勢(shì)離子的凈電荷：<3.5+2+10-1>10. 2-2注意：占優(yōu)勢(shì)離子的凈電荷不是全部離子的平均凈電荷。問(wèn)題1:求出二肽LysLys及三肽LysLys一Lys的pl值。圖將R+變成R+,就必須考慮R+一與R+,+,-1等同,即側(cè)鏈一N+H3解離50

34、%,此時(shí)圖Lys-Lys-Lys分子中有三個(gè)側(cè)鏈可解離，它的R+-實(shí)際相對(duì)于R+,+,+,-1，此時(shí)每個(gè)側(cè)鏈解離后帶有1/3個(gè)正電荷。問(wèn)題2：把一個(gè)氨基酸結(jié)晶參加pH7.0的純水中，得到pH6.0的溶液，此氨基酸的pl值是大于6.0?小于6.0還是等于6.0?小于6.0多肽的等電點(diǎn)，隨著肽鏈內(nèi)酸性氨基酸殘基數(shù)的增加而下降，隨著肽鏈內(nèi)堿性氨基酸殘基數(shù)的增加而上升。多肽的等電點(diǎn)可以通過(guò)計(jì)算求得如上例中，但殘基數(shù)增大時(shí)，此法不行?？蓪㈦逆渻?nèi)酸性殘基和堿性殘基進(jìn)行清點(diǎn)比擬，推測(cè)等電點(diǎn)偏酸還是偏堿，然后用等電點(diǎn)聚焦電泳進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)定。3、肽的化學(xué)反響和游離氨基酸一樣，肽的a粉基，a氨基和側(cè)鏈R基上的活性基

35、團(tuán)都能發(fā)生與游離氨基酸相似的反響。但凡有肽鍵結(jié)構(gòu)的化合物都會(huì)發(fā)生雙縮服反響，且可用于定量分析。雙縮服反響是肽和蛋白質(zhì)特有的反響，游離氨基酸無(wú)此反響。圖三、天然存在的活性肽生物體內(nèi)存在大量的多肽和寡肽，其中有很多具有很強(qiáng)的生物活性，稱(chēng)活性肽。生物的生長(zhǎng)、發(fā)育、細(xì)胞分化、大腦功能、免疫、生殖、衰老、病變等都涉及到活性肽。活性肽是細(xì)胞內(nèi)部、細(xì)胞間、器官間信息溝通的主要化學(xué)信使。很多激素、抗生素都屬于肽類(lèi)或肽的生物。1谷胱甘肽GIu一Cys-GIy廣泛存在于動(dòng)、植、微生物細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)參與氧化復(fù)原過(guò)程，去除內(nèi)源性過(guò)氧化物和自由基，維護(hù)蛋白質(zhì)活性中心的筑基處于復(fù)原狀態(tài)。2GSHGSSGH202 + 2

36、GSH2H20 + GSSG2、短桿菌肽抗生素由短桿菌產(chǎn)生的10肽環(huán)?？垢锾m氏陽(yáng)性細(xì)菌，臨床用于醫(yī)治化濃性病癥。L-0rnL-LeuD-PheL-ProL-VaIL-0rnL-LeuD-Phe-L-Pro-L-VaI3、腦啡肽5肽已發(fā)覺(jué)幾十種Met腦啡肽：TyrGIyGIyPheMetLeu腦啡肽：TyrGIyGIyPheLeu具有鎮(zhèn)痛作用。1982年，中科院上海生化所用蛋白質(zhì)工程技術(shù)合成了Leu腦啡肽，既有鎮(zhèn)痛作用又不會(huì)象嗎啡那樣使人上癮。神經(jīng)生物化學(xué)神經(jīng)多肽生物體內(nèi)多肽或寡肽的X：合成蛋白質(zhì)的剪切、修飾酶專(zhuān)一性逐漸合成如谷胱甘肽、動(dòng)物腸道可汲取寡肽第四節(jié)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)共價(jià)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的一級(jí)

37、結(jié)構(gòu)也稱(chēng)共價(jià)結(jié)構(gòu)、主鏈結(jié)構(gòu)。一、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)層次一級(jí)結(jié)構(gòu)氨基酸順序、共價(jià)結(jié)構(gòu)、主鏈結(jié)構(gòu)I是指蛋白質(zhì)分子中氨基酸殘基的排列順序二級(jí)結(jié)構(gòu)I超二級(jí)結(jié)構(gòu)I構(gòu)象高級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域I三級(jí)結(jié)構(gòu)（球狀結(jié)構(gòu)）四級(jí)結(jié)構(gòu)（多亞基聚集體）一級(jí)結(jié)構(gòu)：共價(jià)結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)分子中氨基酸殘基的排列順序（含二硫鍵）二級(jí)結(jié)構(gòu)：多肽鏈主鏈中各個(gè)肽段形成的規(guī)則的或無(wú)規(guī)則的構(gòu)象。主要有a-螺旋、0折疊'轉(zhuǎn)角'無(wú)規(guī)卷曲。超二級(jí)結(jié)構(gòu)：由兩個(gè)以上二級(jí)結(jié)構(gòu)單元相互聚集形成的有規(guī)則的二級(jí)結(jié)構(gòu)的組合體如aav3aPxBBB。結(jié)構(gòu)域：大的球蛋白分子中，多肽鏈形成幾個(gè)緊密的球狀構(gòu)象，彼此分開(kāi)，以松散的肽鏈相連，此球狀構(gòu)象是結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域是多肽鏈

38、的獨(dú)立折疊單位，一般由100-200個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成。三級(jí)結(jié)構(gòu)：多肽鏈通過(guò)盤(pán)旋'折疊，形成緊密的借各種次級(jí)鍵維持的球狀構(gòu)象。或：蛋白質(zhì)分子或亞基內(nèi)全部原子的空間排布，不含亞基間或分子間的空間排列關(guān)系。四級(jí)結(jié)構(gòu)：寡聚蛋白中亞基種類(lèi)、數(shù)目、空間排布及亞基間相互作用力。單鏈蛋白質(zhì)只有一、二'三級(jí)結(jié)構(gòu)，無(wú)四級(jí)結(jié)構(gòu)。RNase單條肽鏈肌紅蛋白單體蛋白胰島素多條肽鏈胰凝乳蛋白酶蛋白質(zhì)相同亞基一種乳酸脫氫酶Q4寡聚蛋白不同亞基血紅蛋白a2P2蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)（序列）中含有形成高級(jí)結(jié)構(gòu)的全部需的信息,一級(jí)結(jié)構(gòu)決定高級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)及功能。二、一級(jí)結(jié)構(gòu)的要點(diǎn)蛋白質(zhì)主鏈由氨基酸以酰胺鍵連接，多肽的線(xiàn)性結(jié)構(gòu)

39、叫肽鏈，組成肽鏈的氨基酸叫氨基酸殘基。一級(jí)結(jié)構(gòu)要點(diǎn)：蛋白質(zhì)中的肽鍵都是由a-NH2和a-COOH結(jié)合生成的。每一種蛋白質(zhì)都有相同的肽主鏈結(jié)構(gòu)，各種蛋白質(zhì)間的差異是蛋白質(zhì)的氨基酸種類(lèi)、數(shù)量及排列順序不同。氨基酸的a-NH2和a-COOH縮合，只有末端及側(cè)鏈基團(tuán)有化學(xué)活性。每個(gè)蛋白質(zhì)或每個(gè)蛋白質(zhì)的亞基只有一個(gè)a-NH2和a-COOH分子量大于5000的活性肽才能稱(chēng)為蛋白質(zhì)。三、.蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定推斷預(yù)測(cè)氨基酸序列一級(jí)結(jié)構(gòu)空間結(jié)構(gòu)高級(jí)結(jié)構(gòu)T功能一蛋白質(zhì)測(cè)序的一般步驟祥見(jiàn)P1161測(cè)定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目。2拆分蛋白質(zhì)分子中的多肽鏈。3測(cè)定多肽鏈的氨基酸組成。4斷裂鏈內(nèi)二硫鍵。5分析多肽鏈的N末

40、端和C末端。6多肽鏈局部裂解成肽段。7測(cè)定各個(gè)肽段的氨基酸順序8確定肽段在多肽鏈中的順序。9確定多肽鏈中二硫鍵的位置。二蛋白質(zhì)測(cè)序的根本策略對(duì)于一個(gè)純蛋白質(zhì)，理想方法是從N端直接測(cè)至C端，但目前只能測(cè)60個(gè)N端氨基酸。1、直接法測(cè)蛋白質(zhì)的序列兩種以上特異性裂解法NCA法裂解A1A2A3A4B法裂解B1B2B3B4用兩種不同的裂解方法，產(chǎn)生兩組切點(diǎn)不同的肽段，別離純化每一個(gè)肽段，別離測(cè)定兩個(gè)肽段的氨基酸序列，拼接成一條完整的肽鏈。2、間接法測(cè)核酸序列推斷氨基酸序列核酸測(cè)序，一次可測(cè)600-800bp三測(cè)序前的打算工作1、蛋白質(zhì)的純度鑒定純度要求，97%以上，且均一，純度鑒定方法。兩種以上才可靠(

41、1)聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)要求一條帶DNS-cl二甲氨基蔡磺酰氯法測(cè)N端氨基酸2、測(cè)定分子量用于估算氨基酸殘基n=方法：凝膠過(guò)濾法'沉降系數(shù)法3、確定亞基種類(lèi)及數(shù)目多亞基蛋白的亞基間有兩種結(jié)合方法：非共價(jià)鍵結(jié)合8moi/L尿素，SDSSDS-PAGE測(cè)分子量二硫鍵結(jié)合過(guò)甲酸氧化：SSi-HCOOOHTS03HB筑基乙醇復(fù)原：舉例：血紅蛋白(a232)注意，人的血紅蛋白a和B的N端相同。分子量：M拆亞基：M1、M2兩條帶拆二硫鍵：M1、M2兩條帶分子量關(guān)系：M=2M1+2M24、測(cè)定氨基酸組成主要是酸水解，同時(shí)輔以堿水解。氨基酸分析儀自動(dòng)進(jìn)行。確定肽鏈中各種a.a出現(xiàn)的頻率,便于

42、選擇裂解方法及試劑。Trp測(cè)定對(duì)二甲基氨基苯甲醛590nmoCys測(cè)定5、5/一二硫代雙一2一硝基苯甲酸DTNB,412nm5、端基分析N端分析DNS-cl法：最常用，黃色熒光，靈敏度極高，DNS-多肽水解后的DNS-氨基酸不需要提取。DNFB法：Sanger試劑，DNP-多肽，酸水解，黃色DNP-氨基酸，有機(jī)溶劑乙酸乙酯抽提別離，紙層析、薄層層析、液相等PITC法：Edman法，逐漸切下。無(wú)色PTH-氨基酸，有機(jī)溶劑抽提，層析。C端分析A.腓解法H2N-A-B-C-D-C00H無(wú)水腫NH2NH21005-10hoA-NHNH2、B-NHNH2、C-NHNH2、D-COOH氨基酸的酰胱，用苯甲

43、醛沉淀，C端在上清中，Gin、Asn、Cys、Arg不能用此法。B.竣肽酶法Pro不能測(cè)陵肽酶A：除Pro、Arg、Lys外的全部C端a.a竣肽酶B：只水解Arg、LysN H2NVa ISerGI y C圖P118竣肽酶法測(cè)C末端四肽鏈的局部裂解和肽段的別離純化1、化學(xué)裂解法;臭化氟MetX產(chǎn)率85%亞碘酰基苯甲酸一TrpX產(chǎn)率70700%NTCB2-硝基-5-硫氟茉甲酸一XCys一羥胺NH20HAsnGIy約150個(gè)氨基酸出現(xiàn)一次2、酶法裂解胰蛋白酶LysX(X豐Pro)ArgX胰凝乳蛋白酶TyrX(X*Pro)TrpXPheX胃蛋白酶Phe(TrpxTry、Leu)Phe(TrpxTry

44、、Leu)Glu蛋白酶GluXV8蛋白酶Arg蛋白酶ArgXLys蛋白酶XLysPro蛋白酶ProX3、肽段的別離純化電泳法SDS-PAGE依據(jù)分子量大小別離離子交換層析法DEAECellulose、DEAESephadex依據(jù)肽段的電荷特性別離反相HPLC法依據(jù)肽段的極性別離凝膠過(guò)濾4、肽段純度鑒定別離得到的每一個(gè)肽段，需分別鑒定純度，常用DNScI法要求：SDS-PAGE單帶、HPLC單峰'N端單一。五肽段的序列測(cè)定及肽鏈的拼接1、Edman法一次水解Is,N端a.a1耦聯(lián)PITC + H2NA-B-C-DpH89 , 40PTCA-B-C-D2裂解PTCA-B-C-DTFA無(wú)水三

45、氟乙酸ATZA+H2NB-C-D3轉(zhuǎn)化ATZAPTHA用GC或HPLC測(cè)定PTH-APTC肽：苯氨基硫甲酰肽ATZ：睡嗖琳酮革胺一氨基酸PTH：苯乙內(nèi)酰硫服一氨基酸耦聯(lián)：得PTC肽一次循環(huán)裂解：ATZ-a.a轉(zhuǎn)化：PTH-a.a反響產(chǎn)率99%循環(huán)次數(shù)120（偶聯(lián)、降98%60解兩步90%402、DNS-Edman法用DNS法測(cè)N末端，用Edman法提供n-1肽段。ABCDE肽圖3、有色Edman法熒光基團(tuán)或有色試劑標(biāo)記的PITC試劑。4、用自動(dòng)序列分析儀測(cè)序儀器原理：Edman法，可測(cè)60肽。1967液相測(cè)序儀自旋反響器，適于大肽段。1971固相測(cè)序儀范外表接有丙氨基的微孔玻璃球，可耦連肽段的

46、C端。1981氣相測(cè)序儀用Polybrene反響器。聚陽(yáng)離子四級(jí)鐵鹽聚合物液相：5nmol20-40肽97%氣相：5pmol60肽98%5、肽段拼接成肽鏈16肽，N端HC端SA法裂解：ONSPSEOVERLAH0WTB法裂解：SEOWTONVERLAPSH0重疊法確定序列：HOWTONSEOVERLAPS六二硫鍵、酰胺及其他修飾基團(tuán)確實(shí)定1、二硫鍵確實(shí)定雙向電泳法碘乙酰胺封閉-SH胃蛋白酶酶解蛋白質(zhì)第一向電泳過(guò)甲酸氧化一S一S一生成-SO3H第二向電泳別離出含二硫鍵的兩條短肽，測(cè)序與拼接出的肽鏈比擬，定出二硫鍵的位置。2、酰胺確實(shí)定Asp-AsrixGIu-GIn酶解肽鏈，產(chǎn)生含單個(gè)Asx或G

47、lx的肽，用電泳法確定是Asp還是Asn舉例：Leu-GIx-Pro-Val肽在pH=6.0時(shí)，電荷量是Leu+ProOVal-此肽除Glx外，凈電荷為0,可依據(jù)此肽的電泳行為確定是Glu或是Gn。3、糖'脂、磷酸基位置確實(shí)定糖類(lèi)通過(guò)Asn、Ser與蛋白質(zhì)連接，-上糖昔-0-糖昔脂類(lèi)：SerVThrVCys磷酸：ServThr、His經(jīng)驗(yàn)性序列：Lys(Arg)-Ser-Asn-Ser(P04)Arg-Thr-Leu-Ser(P04)Lys(Arg)-Ala-Ser(P04)四、蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)與生物功能一蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定高級(jí)結(jié)構(gòu)和功能蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)舉例：1牛胰島素Sanger于1

48、953年第一次完成測(cè)序工作。P128圖3-38分子量：5700dalton51個(gè)a.a殘基，A鏈21個(gè)殘基，B鏈30個(gè)殘基，A鏈內(nèi)有一個(gè)二硫鍵Cys6Cys11A.B鏈間有二個(gè)二硫鍵A.Cys7BCys7A.Cys20BCys192核糖核酸酶RNaseP128圖3-39分子量：12600124個(gè)a.a殘基4個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵。牛胰RNase變性一復(fù)性實(shí)驗(yàn)：P164圖3-69。（8M尿素+B硫基乙醇）變性'失活T透析，透析后構(gòu)象恢復(fù),活性恢復(fù)95%以上，而二硫鍵正確復(fù)性的概率是1/105o3人血紅蛋白a和|3鏈及肌紅蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)P129圖3-40二同源蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的種屬差異與生物進(jìn)化同源蛋

49、白質(zhì)：在不同的生物體內(nèi)具有同一功能的蛋白質(zhì)。如：血紅蛋白在不同的脊椎動(dòng)物中都具有輸送氧氣的功能，細(xì)胞色素在全部的生物中都是電子傳遞鏈的組分。同源蛋白質(zhì)的特點(diǎn)：多肽鏈長(zhǎng)度相同或相近同源蛋白質(zhì)的氨基酸順序中有許多位置的氨基酸對(duì)全部種屬來(lái)說(shuō)都是相同的，稱(chēng)不變殘基，不變殘基高度保守，是必需的。除不變殘基以外，其它位置的氨基酸對(duì)不同的種屬有很大變化，稱(chēng)可變殘基，可變殘基中，個(gè)別氨基酸的變化不影響蛋白質(zhì)的功能。通過(guò)比擬同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列的差異可以研究不同物種間的親源關(guān)系和進(jìn)化，親源關(guān)系越遠(yuǎn)，同源蛋白的氨基酸順序差異就越大。1、細(xì)胞色素C存在于線(xiàn)粒體膜內(nèi)，在真核細(xì)胞的生物氧化過(guò)程中傳遞電子。P130,圖

50、3-41分子量：12500左右氨基酸殘基：100個(gè)左右，單鏈。25種生物中，細(xì)胞色素C的不變殘基35個(gè)。60種生物中，細(xì)胞色素C的不變殘基27個(gè)。親源關(guān)系越近的，其細(xì)胞色素C的差異越小。親源關(guān)系越遠(yuǎn)的，其細(xì)胞色素C的差異越大。人與黑猩猩0人與猴1人與狗10人與酵母442、胰島素祥見(jiàn)P175胰島素的結(jié)構(gòu)與功能不同生物的胰島素a.a序列中，有24個(gè)氨基酸殘基位置始終不變，A.B鏈上6個(gè)Cys不變重要性，其余1824-6個(gè)氨基酸多數(shù)為非極性側(cè)鏈，對(duì)穩(wěn)定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)起重要作用。其它氨基酸對(duì)穩(wěn)定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)作用不大，但對(duì)免疫反響起作用，豬與人接近，而狗則與人不同，因此可用豬的胰島素醫(yī)治人的糖尿病

51、。三蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的個(gè)體差異一分子病分子?。夯蛲蛔円鹉硞€(gè)功能蛋白的某個(gè)些氨基酸殘基發(fā)生了遺傳性替代從而導(dǎo)致整個(gè)分子的三維結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，致使其功能局部或全部喪失。Linus鏈第6位的aa線(xiàn)基由正常的GIu變成了疏水性的VaL因此，當(dāng)血紅蛋白沒(méi)有攜帶02時(shí)就由正常的球形變成了剛性的棍棒形，病人的紅細(xì)胞變成鐮刀形，簡(jiǎn)單發(fā)生溶血作用（血細(xì)胞溶化）導(dǎo)致病血，棍棒形的血紅蛋白對(duì)02的結(jié)合力比正常的低。P2,鐮刀形紅細(xì)胞中，血紅蛋白02。鏈組成B鏈和兩條相同的aPauling首先發(fā)覺(jué)鐮刀形紅細(xì)胞貧血現(xiàn)是由于血紅蛋白發(fā)生了遺傳突變引起的，成人的血紅蛋白是由兩條相同的以血紅蛋白為例：（12B2寡聚蛋白正常人

52、血紅蛋白，3.NGlu6鑲刀型貧血B.NVai6生理?xiàng)l件下電荷：Va10Glu-疏水親水人的血紅蛋白分子的四條肽鏈中574個(gè)氨基酸殘基只有兩個(gè)Glu分子變化成Va1分子，就能發(fā)生鐮刀狀細(xì)胞貧血病。四一級(jí)結(jié)構(gòu)的局部切除與蛋白質(zhì)的激活一些蛋白質(zhì)'酶'多肽激素在剛合成時(shí)是以無(wú)活性的前體形式存在，只有切除局部多肽后才呈現(xiàn)生物活性，如血液凝固系統(tǒng)的血纖維蛋白原和凝血酶原，消化系統(tǒng)的蛋白酶原、激素前體等。1、血液凝固的機(jī)理凝血因子凝血酶原致活因子凝血酶凝血酶原纖維蛋白原A纖維蛋白B凝膠1、凝血酶原P133圖3-43凝血酶原的結(jié)構(gòu)糖蛋白，分子量66000,582個(gè)a.a殘基，單鏈。在凝血酶原

53、致活因子催化下，凝血酶原分子中的Arg274-Thr275和Arg323IIe324斷裂，釋放出274個(gè)a.a,產(chǎn)生活性凝血酶。A鏈49a.aB鏈259a.a2、纖維蛋白原P133圖3-44纖維蛋白原的結(jié)構(gòu)a2B2r2a肽：600個(gè)氨基酸，B肽：461氨基酸，r肽：410個(gè)氨基酸在凝血酶作用下，從二條a鏈和二條B鏈的N端各斷裂一個(gè)特定的肽鍵-ArgGly-,釋放出二個(gè)纖維肽A19個(gè)氨基酸和二個(gè)纖維肽B21個(gè)氨基酸，它們含有較多的酸性氨基酸殘基。P133纖維肽A.B的結(jié)構(gòu)A、B肽切除后，減少了蛋白質(zhì)分子的負(fù)電荷，促進(jìn)分子間聚集，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。P134±在凝血因子X(jué)IIla纖維蛋白穩(wěn)定因子催化下，纖維蛋白質(zhì)單體間形成共價(jià)健Gln-Lys結(jié)合，生成交聯(lián)的纖維蛋白。2、胰島素原的激活P134圖3-45胰島素在胰島的B細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核糖體上合成，稱(chēng)前胰島素原，含信號(hào)肽。前胰島素原在信號(hào)肽的引導(dǎo)下，進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，進(jìn)入后，信號(hào)肽被信號(hào)肽酶切除，生成胰島素原，被運(yùn)至高爾基體貯存。并在特異的肽酶作用下，切除C肽，得到活性胰島素。五、多肽與蛋白質(zhì)的人工