基因診斷與基因治療(1)

1、 基因診斷（基因診斷（4-184-18） 基因治療（基因治療（4-254-25）48小時(shí)內(nèi)使用最有效基因診斷（一）核酸分子雜交技術(shù)（二）聚合酶鏈反應(yīng) (PCR)（三）基因測(cè)序（四）基因芯片常用固相核酸雜交方法 (1) Southern 印跡雜交法 限制性內(nèi)切酶酶切 檢測(cè)雜交信號(hào)檢測(cè)雜交信號(hào) 提取提取DNADNA Southern 法可用于檢測(cè)特異的DNA序列片段,進(jìn)行基因定位、分子量測(cè)定等。Kary Mullis research scientist in the 1980s at a California biotechnology company called Cetus co-winne

2、r of 1993 Nobel Prize PCR產(chǎn)物以指數(shù)形式增加，即Y = 2n n為循環(huán)數(shù)他們給DNA 的測(cè)序帶來(lái)了一場(chǎng)革命，分享了1980年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。后來(lái)Sanger法發(fā)展為自動(dòng)化測(cè)序法，并為人類基因組測(cè)序做出了卓越貢獻(xiàn)。Fred Sanger 發(fā)明的末端合成終止法 (sanger法)Walter Gilbert發(fā)明的化學(xué)裂解法 Maxam-Gillbert法n快速、高通量、平行化、自動(dòng)化基因診斷方法經(jīng)典基因診斷.限制性內(nèi)切酶法.RFLP分析法.寡核苷酸分析法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)特異基因診斷未知基因診斷直接，過(guò)程簡(jiǎn)單過(guò)程繁雜準(zhǔn)確性低，過(guò)程繁條件嚴(yán)格基因診斷進(jìn)展.PCR方法.PCR-序列分析法

3、.DNA芯片技術(shù)簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、敏感操作直接、準(zhǔn)確集成度高、快速、并行假陽(yáng)性高價(jià)格高尚無(wú)成熟產(chǎn)品問(wèn)世遺傳疾病腫瘤感染性疾病，傳染性流行病判斷個(gè)體疾病易感性器官移植組織配型法醫(yī)學(xué)中個(gè)體識(shí)別、親子鑒定鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析Mst酶切位點(diǎn)(CCTNAGG)5 3 正?；? 3 突變基因突變基因1.15kb1.35kb0.2kb正常珠蛋白基因： 5CCTGAGG3鐮刀型貧血： 5CCTGTGG30.2kb1.15kb1.35kb正常人突變攜帶著 患者實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè) 熒光 起始模板Real Time vs. Traditional PCRPCRTheoreticalReal LifeLog T

4、arget DNA理想的PCR反應(yīng)XnX0 2n*Xn：第n次循環(huán)后擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量X0 ：起始模板數(shù)量n：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)熒光定量PCR原理Ct值定量的數(shù)學(xué)原理非理想的PCR反應(yīng)XnX0 （1En）n*Xn：第n次循環(huán)后擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量X0 ：起始模板數(shù)量n：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)En：擴(kuò)增效率熒光定量PCR原理Ct值定量的數(shù)學(xué)原理在擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到熒光閾值時(shí)XCtX0 （1En）CtM （1）*XCt ：熒光擴(kuò)增信號(hào)達(dá)到閾值時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量，在閾值設(shè)定以后，它是一個(gè)常數(shù)，：熒光擴(kuò)增信號(hào)達(dá)到閾值時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量，在閾值設(shè)定以后，它是一個(gè)常數(shù)，定為定為M方程式（1）兩邊同取對(duì)數(shù)得：Log2MLog2X0 *（1En）Ct （2

5、）整理方程式（2）：Log2X0 Log 2M Ct Log2（1En）熒光定量PCR原理Ct值定量的數(shù)學(xué)原理 TaqMan Probe Molecular Beacon TaqManSYBR Green I GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAADissociation curvePrimer Length: 15-30bpPCR Product: 100-200bpG+C%: 4060Tm of primers: 55-60 Tm of probes: 65 (10 )No G at 5探針中GC含量的差異對(duì)定量PCR反應(yīng)效率的影響Absolute Quantification0123456Sample1Sample2Sample3Sa