顯微鏡知識擴(kuò)充

1、另1首頁T第三章顯微鏡、光學(xué)顯微鏡的發(fā)展歷史早在公元前一世紀(jì)，人們就已發(fā)現(xiàn)通過球形透明物體去觀察微小物體時(shí)，可以使其放大成像。后來逐漸對球形玻璃表面能使物體放大成像的規(guī)律有了認(rèn)識。1590 年，荷蘭和意大利的眼鏡制造者已經(jīng)造出類似顯微鏡的放大儀器。1610 年前后，意大利的伽利略和德國的開普勒在研究望遠(yuǎn)鏡的同時(shí)，改變物鏡和目鏡之間的距離，得出合理的顯微鏡光路結(jié)構(gòu)，當(dāng)時(shí)的光學(xué)工匠遂紛紛從事顯微鏡的制造、推廣和改進(jìn)。17 世紀(jì)中葉，英國的胡克和荷蘭的列文胡克，都對顯微鏡的發(fā)展作出了卓越的貢獻(xiàn)。1665 年前后，胡克在顯微鏡中加入粗動(dòng)和微動(dòng)調(diào)焦機(jī)構(gòu)、照明系統(tǒng)和承載標(biāo)本片的工作臺。 這些部件經(jīng)過不斷改

2、進(jìn)，成為現(xiàn)代顯微鏡的基本組成部分。16731677 年期間，列文胡克制成單組元放大鏡式的高倍顯微鏡，其中九臺保存至今。胡克和列文胡克利用自制的顯微鏡，在動(dòng)、植物機(jī)體微觀結(jié)構(gòu)的研究方面取得了杰出成就。19 世紀(jì)，高質(zhì)量消色差浸液物鏡的出現(xiàn)，使顯微鏡觀察微細(xì)結(jié)構(gòu)的能力大為提高。1827年阿米奇第一個(gè)采用了浸液物鏡。19 世紀(jì) 70 年代，德國人阿貝奠定了顯微鏡成像的古典理論基礎(chǔ)。這些都促進(jìn)了顯微鏡制造和顯微觀察技術(shù)的迅速發(fā)展，并為19 世紀(jì)后半葉包括科赫、巴斯德等在內(nèi)的生物學(xué)家和醫(yī)學(xué)家發(fā)現(xiàn)細(xì)菌和微生物提供了有力的工具。在顯微鏡本身結(jié)構(gòu)發(fā)展的同時(shí)，顯微觀察技術(shù)也在不斷創(chuàng)新：1850 年出現(xiàn)了偏光顯微

3、術(shù)；1893 年出現(xiàn)了干涉顯微術(shù)；1935 年荷蘭物理學(xué)家澤爾尼克創(chuàng)造了相襯顯微術(shù)，他為此 在 1953 年獲得了諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。古典的光學(xué)顯微鏡只是光學(xué)元件和精密機(jī)械元件的組合，它以人眼作為接收器來觀察放大的像。后來在顯微鏡中加入了攝影裝置，以感光膠片作為可以記錄和存儲的接收器。現(xiàn)代又普遍采用光電元件、電視攝像管和電荷耦合器等作為顯微鏡的接收器，配以微型電子計(jì)算機(jī)后構(gòu)成完整的圖像信息采集和處理系統(tǒng)。目前全世界最主要的顯微鏡廠家主要有：奧林巴斯、蔡司、徠卡、尼康。國內(nèi)廠家主要有：江南、麥克奧迪等。二、主要電鏡制備技術(shù)介紹由于電子顯微鏡本身的分辨能力與性能在不斷提高，生物樣品制備技術(shù)在不斷改進(jìn)，

4、以及電子顯微鏡技術(shù)在細(xì)胞生物學(xué)研究中所發(fā)揮的巨大作用，因此，對電鏡觀察的生物樣品有一些特殊要求：（1）要求樣品很薄。電子束的穿透能力是十分有限的，即使電場高壓增加到 100200kV，電子穿透生物樣品的厚度僅達(dá)1 卩 m。故此，用電鏡觀察樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu)時(shí)，首先要求樣品很薄，一般是數(shù)十納米。即使是細(xì)菌與其他單細(xì)胞生物，假如不經(jīng)過超薄切片，內(nèi)部的細(xì)微結(jié)構(gòu)也很難觀察清楚。所以，超薄切片（ultra secti on ）技術(shù)是基本的電鏡實(shí)驗(yàn)技術(shù)；（2）要求更好地保持樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu)。一般樣品制備都要經(jīng)過一個(gè)復(fù)雜的過程：如 固定、脫水、包埋、切片、染色等。所以要使樣品盡量保持生活狀態(tài)下的精細(xì)結(jié)構(gòu)而不嚴(yán)重

5、失真，對固定齊 U 與包埋劑的選擇以及固定與包埋的條件均要求比較嚴(yán)格（一）超薄切片技術(shù)由于電子束的穿透能力有限，為獲得較高分辨率，切片厚度一般僅為4050nm,即一個(gè)直徑為 20um 的細(xì)胞可切成幾百片，故稱超薄切片。這需要樣品既要有一定剛性又要有一 定韌性，而生物樣品并不具備這些特性。為此，樣品往往需要包埋在特殊的介質(zhì)中。但包埋 的過程會破壞樣品的結(jié)構(gòu)，所以超薄切片樣品制備的第一步就是樣品的固定，以更好地保存細(xì)胞的精細(xì)結(jié)構(gòu)。1.固定如何保持觀察樣品的真實(shí)性，固定是很重要的一環(huán)。固定不僅要求保持樣品 的形態(tài)結(jié)構(gòu)不發(fā)生改變；有時(shí)甚至要求在超微和分子水平上使細(xì)胞內(nèi)部的結(jié)構(gòu)和成分保持在 原來的位置上

6、，同時(shí)盡量保持原來的性質(zhì)，如抗原性等。超薄切片常用的固定劑為鋨酸和戊二醛等。根據(jù)需要選擇最合適的固定劑。此外，還可以用物理方法固定，如高頻微波。在固 定操作過程中，動(dòng)物的處死和取材都要快速進(jìn)行，并通常在低溫下固定，以防止酶的自溶作用造成破壞，固定的樣品塊也不宜太大，以便固定劑迅速滲透。幾種固定劑對細(xì)胞各成分的固定效果固定劑 核 酸 蛋白質(zhì) 磷 脂 多糖不飽和脂肪酸鋨酸+戊二醛+KMnO + +表示相對固定效果2.包埋 包埋的目的是要使樣品中各種細(xì)微結(jié)構(gòu)在切片過程中都得到均勻良好地支撐，使切成的超薄切片仍能保持連續(xù)完整并且有足夠的強(qiáng)度，并能耐受干燥以及觀察時(shí)的電子轟擊、高溫和真空揮發(fā)。同時(shí)要求包

7、埋劑在高倍放大時(shí)也不顯示其本身結(jié)構(gòu)，還要求在聚合時(shí)不發(fā)生明顯的收縮，以防止樣品中細(xì)微結(jié)構(gòu)的損壞和移位；應(yīng)具有良好的機(jī)械性能 （如剛度和韌性等）以利于切片；應(yīng)易被電子穿透等。目前常用的包埋劑是環(huán)氧樹脂。生物樣品固定 后通常仍含有大量水分，而包埋劑又多是與水不相溶的，因此在包埋前通常要經(jīng)過一系列脫水處理過程。3切片 超薄切片厚度通常是 4050nm 切片厚度可通過樣品桿的金屬熱膨脹或機(jī)械伸縮來控制。切片刀以玻璃或鉆石為材料，最常用的是玻璃刀。 切片須撈在覆有支持膜的載網(wǎng)（銅網(wǎng)或鎳網(wǎng)）上才能在電鏡下觀察。4染色 樣品中的不同成分對各種“染料”有不同的親和性，如鋨酸宜染脂肪；鉛鹽易染蛋白質(zhì)；醋酸鈾易染

8、核酸等。 電鏡樣品僅用重金屬鹽進(jìn)行染色以形成明暗反差，因此只能通過電子束振幅的改變觀察到黑白圖像。它不能使光鏡切片染色， 通過改變波長而獲得彩色圖像。幾乎各種細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)都可以用超薄切片法觀察。超薄切片技術(shù)顯示典型動(dòng)物細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。不僅如此，超薄切片技術(shù)還可以與放射性同位素自顯影、細(xì)胞化學(xué)、免疫電鏡和電 鏡原位雜交等技術(shù)結(jié)合，用于不同的研究目的。（二）負(fù)染色技術(shù)某些結(jié)構(gòu)，如線粒體基粒、核糖體和蛋白質(zhì)及其組成的纖維甚至病毒等可以通過負(fù)染色（Negative stai ning ）電鏡技術(shù)觀察其精細(xì)結(jié)構(gòu)。其分辨率可達(dá)左右。負(fù)染色是用重金屬鹽，如磷鎢酸或醋酸雙氧鈾，對鋪展在載網(wǎng)上的樣品進(jìn)行染色，吸

9、去多余染料，樣品經(jīng)自然干燥后，整個(gè)載網(wǎng)上都鋪上了一薄層重金屬鹽，從而襯托出樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu)。（三）冰凍斷裂和冰凍蝕刻電鏡技術(shù)用快速低溫冷凍法將樣品迅速冷凍（液氮或液氦中），然后在低溫下進(jìn)行斷裂。這時(shí)樣品往往從其結(jié)構(gòu)相對“脆弱”的部位（即膜脂雙分子層的疏水端）斷裂。從而顯示出鑲嵌在膜脂中的蛋白質(zhì)顆粒，由于冰在真空中的少量升華，可進(jìn)一步增強(qiáng)“浮雕”式的蝕刻效果。用鉑、金等金屬進(jìn)行傾斜噴鍍， 以形成對應(yīng)于凹凸的電子反差， 再經(jīng)碳垂直于斷面進(jìn)行真空 噴鍍，形成一個(gè)連續(xù)的碳膜，然后用消化液把樣品本身消化掉， 將剩下的碳膜及其構(gòu)成圖形 的金屬微粒移到載網(wǎng)上進(jìn)行電鏡觀察。冰凍蝕刻（Freeze etching

10、 ）技術(shù)主要用來觀察膜斷裂面的蛋白質(zhì)顆粒和膜表面結(jié)構(gòu)，圖形富有立體感，樣品不需包埋甚至也不需固定，同時(shí)能更好地保持樣品的真實(shí)結(jié)構(gòu)。近年來發(fā)展起來的快速冷凍深度蝕刻技術(shù)（quick freeze deep etchi ng）就是在此基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。深度蝕刻主要用于觀察胞質(zhì)中的細(xì)胞骨架纖維及其結(jié)合蛋白。（四）電鏡三維重構(gòu)技術(shù)生物大分子的三維結(jié)構(gòu)是當(dāng)今生命科學(xué)研究中的核心課題之一。電鏡三維重構(gòu)技術(shù)是電子顯微術(shù)、電子衍射與計(jì)算機(jī)圖像處理相結(jié)合而形成的具有重要應(yīng)用前景的一門新技術(shù)，尤其適于分析難以形成三維晶體的膜蛋白以及病毒和蛋白質(zhì)一核酸復(fù)合物等大的復(fù)合體的三 維結(jié)構(gòu)。其基本步驟是對生物樣品（如蛋白質(zhì)

11、二維晶體）在電鏡中的不同傾角下進(jìn)行拍照，得到一系列電鏡圖片后再經(jīng)傅立葉變換等處理，從而展現(xiàn)出生物大分子及其復(fù)合物三維結(jié)構(gòu)的電子密度圖。最早提出并發(fā)展這一技術(shù)是英國生物物理學(xué)家，并因此獲得1982 年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。近年來在此基礎(chǔ)上發(fā)展了低溫電鏡技術(shù)（Cryoelectron microscopy ）,其樣品不經(jīng)固定、染色和干燥，直接包被在約100nm 厚的冰膜中，在電鏡內(nèi)-1600C 低溫下利用相位襯度成像。該技術(shù)不僅更真實(shí)地展示出生物大分子及其復(fù)合物表面與內(nèi)部的空間結(jié)構(gòu)，而且還具有更高的分辨率。電鏡三維重構(gòu)技術(shù)與 X-射線晶體衍射技術(shù)及核磁共振分析技術(shù)相結(jié)合，是當(dāng)前結(jié)構(gòu)生 物學(xué)（Structu

12、ral Biology ）主要研究生物大分子空間結(jié)構(gòu)及其相互關(guān)系的主要實(shí)驗(yàn)手 段。（五）掃描電鏡技術(shù)掃描電鏡（Scanning electron microscope ，簡稱 SEM 是二十世紀(jì) 60 年代才正式問世的。其電子槍發(fā)射出的電子束被磁透鏡匯聚成極細(xì)的電子“探針”，在樣品表面進(jìn)行“掃描”，電子束可激發(fā)樣品表面放出二次電子（同時(shí)也有一些其他信號）。二次電子產(chǎn)生的多少與樣品表面的形貌有關(guān)。 二次電子由探測器收集，并在那里被閃爍器轉(zhuǎn)變成光信號，再經(jīng)光電倍增管和放大器又轉(zhuǎn)變成電壓信號來控制熒光屏上電子束的強(qiáng)度。這樣，樣品不同部位上產(chǎn)生二次電子多或少的差異，直接反映在熒光屏相應(yīng)部位亮或暗的差別

13、，從而得到一幅放大的立體感很強(qiáng)的圖像。掃描電鏡主要是用來觀察樣品表面的形貌特征，而生物樣品在干燥過程中由于表面張力的作用極易發(fā)生形變，解決這一問題最常用的是CO 臨界點(diǎn)干燥法，即利用CO 在其臨界溫度以上就不再存在氣-液相面，也就不存在引起樣品變形的表面張力問題，從而完成生物樣品的干燥。通常用液態(tài)CQ 等介質(zhì)浸透樣品，然后在臨界溫度以上使CO 以氣態(tài)形式逸去。由于沒有氣-液相面的形成，也就沒有表面張力，樣品的形態(tài)能得到很好地保持。此外，為 了得到良好的二次電子信號，樣品表面需良好的導(dǎo)電性，所以樣品在觀察前還要噴鍍一層金膜。掃描電鏡景深長，成像具有強(qiáng)烈的立體感，可用于觀察核孔復(fù)合體等更精細(xì)的結(jié)構(gòu)

14、。三、細(xì)胞拆合與顯微操作技術(shù)真核細(xì)胞是由細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)兩大部分組成的，為了探明核質(zhì)相互作用的機(jī)理，科學(xué)家們創(chuàng)建了細(xì)胞拆合技術(shù)。 所謂細(xì)胞拆合就是把核與質(zhì)分離開來，然后把不同來源的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核相互配合，形成核質(zhì)雜交細(xì)胞。細(xì)胞拆合可以分為物理法和化學(xué)法兩種類型。物理法就是用機(jī)械方法或短波光把細(xì)胞核去掉或失活，然后用微吸管吸取其他細(xì)胞的核，注入去核的細(xì)胞質(zhì)中，組成新的雜交細(xì)胞。 這種核移植必須用顯微操縱儀進(jìn)行操作?；瘜W(xué)法就是用松胞素B( cytochalasinB)處理細(xì)胞，細(xì)胞出現(xiàn)排核現(xiàn)象，再結(jié)合離心技術(shù)，將細(xì)胞分拆為核體(karyoplast )和胞質(zhì)體(cytoplast )兩部分。由于核體

15、外表包有一層細(xì)胞膜和少量胞漿，因而在PEG 或仙臺病毒的介導(dǎo)下，核體可同另一胞質(zhì)體融合，形成重組細(xì)胞。顯微操作技術(shù)(microma nipulation )是早期建立的一種胚胎學(xué)技術(shù)， 即在顯微鏡下，用顯微操作裝置對細(xì)胞進(jìn)行解剖和微量注射(microinjecti on)的技術(shù)?，F(xiàn)在顯微操作裝置的設(shè)計(jì)愈來愈精密，不僅用于核移植，而且亦可對細(xì)胞核進(jìn)行解剖和向核內(nèi)注入基因。細(xì)胞拆合、顯微注射與現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合使這些經(jīng)典的胚胎學(xué)技術(shù)展現(xiàn)出極大的潛力，它不僅成為核質(zhì)關(guān)系、細(xì)胞內(nèi)某種mRNA 或蛋白質(zhì)功能等基礎(chǔ)研究的重要手段，而且在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、高等動(dòng)物的克隆方面的理論與實(shí)踐研究中取得重大的突破。

16、四、掃描探針顯微鏡SPM( Scanning Probe Microscope或 Scanning Probe Microscopy)是掃描探針顯微鏡或掃描探針顯微術(shù)的縮寫，是一個(gè)大的種類，目前，SPM 家族中已經(jīng)產(chǎn)生了二三十種顯微鏡，例如掃描隧道顯微鏡(Scanning Tunneling Microscope - STM)、原子力顯微鏡(AtomicForce Microscope - AFM )、磁力顯微鏡(Magnetic Force Microscope - MFM )、靜電力 顯微鏡(Electrostatic ForceMicroscope - EFM)等等。(一) SPM 工作

17、原理掃描探針顯微鏡（SPM ）的工作原理是基于微觀或宏觀范圍的各種物理特性，通過原子線度的極細(xì)探針在被研究物質(zhì)的表面上方掃描時(shí)檢測兩者之間的相互作用，以得到被研究物質(zhì)的表面特性，不同類型的 SPM 之間的主要區(qū)別在于它們的針尖特性及其相應(yīng)的針尖-樣品相互作用方式的不同。STM 的工作原理來源于量子力學(xué)中的隧道貫穿原理。其核心是一個(gè)能在樣品表面上掃 描、并與樣品間有一定偏置電壓、其直徑為原子尺度的針尖。由于電子隧穿的幾率與勢壘 V（r）的寬度呈現(xiàn)負(fù)指數(shù)關(guān)系， 當(dāng)針尖和樣品的距離非常接近時(shí)，其間的勢壘變得很薄，電子云相互重疊，在針尖和樣品之間施加一電壓，電子就可以通過隧道效應(yīng)由針尖轉(zhuǎn)移到樣品或從樣

18、品轉(zhuǎn)移到針尖，形成隧道電流。通過記錄針尖與樣品間的隧道電流的變化就可以得到樣 品表面形貌的信息。（二）與其他表面分析技術(shù)相比，SPM 所具有的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)：?（1） 具有原子級高分辨率。 STM平行和垂直于樣品表面方向的分辨率分別可達(dá)和， 即可分辨出單個(gè)原子。（2） 可實(shí)時(shí)地得到在實(shí)空間中表面的三維圖像，可用于具有周期性或不具備周期性的 表面結(jié)構(gòu)研究，這種可實(shí)施觀測的性能可用于表面擴(kuò)散等動(dòng)態(tài)過程的研究。（3） 可以觀察單個(gè)原子層的局部表面結(jié)構(gòu)，而不是個(gè)體像或整個(gè)表面的平均性質(zhì)，因而可直接觀察到表面缺陷、表面重構(gòu)、表面吸附體的形態(tài)和位置，以及由吸附體引起的表面重構(gòu)等。（4）可在真空、大氣、常溫等不同

19、環(huán)境下工作，甚至可將樣品浸在水和其他溶液中，不需要特別的制樣技術(shù)，并且探測過程對樣品無損傷。這些特點(diǎn)特別適用于研究生物樣品和 對不同實(shí)驗(yàn)條件下對樣品表面的評價(jià)，例如對于多相催化機(jī)理、超導(dǎo)機(jī)制、電化學(xué)反應(yīng)過程中電極表面變化的監(jiān)測等。（5） 配合掃描隧道譜 STS （Scanning Tunneling Spectroscopy）可以得到有關(guān)表面電子結(jié)構(gòu)的信息，例如表面不同層次的態(tài)密度、表面電子阱、表面勢壘的變化和能隙結(jié)構(gòu)等。（三）SPM 的應(yīng)用領(lǐng)域1 表面結(jié)構(gòu)的確定表面原子結(jié)構(gòu)的確定是表面科學(xué)的奠基石。發(fā)明SPM 以前，用的是各種衍射方法，諸如低能電子衍射和原子束散射。然而，這些方法只能提供相對

20、大的面積內(nèi)平均的原子結(jié)構(gòu)經(jīng)過傅立葉變換過的信息。通常，一個(gè)表面結(jié)構(gòu)由衍射方法觀察以后，不同的作者提出相互抵觸的模型，有時(shí)也可達(dá)到一致的意見，而在多數(shù)情況下爭論繼續(xù)存在。另外，衍射方法只能提供有關(guān)相對簡單的以及有完整周期性的表面信息。大而復(fù)雜的結(jié)構(gòu)是衍射方法無能為力的。在實(shí)空間中，非周期結(jié)構(gòu)，例如缺陷及局域變異總是存在的。發(fā)明 SPMI 前，沒有辦法確定這些非周期性結(jié)構(gòu)。SPM 的發(fā)明使局面完全改觀，到 1991 年底，借助于 SPM 并結(jié)合其他的技術(shù)，大量表面結(jié)構(gòu)成為已知的。2.成核過程與晶體生長？固體表面上的薄膜生長在技術(shù)上很重要，而成核現(xiàn)象對生長 機(jī)理的認(rèn)識是關(guān)鍵之一。SPM 有能力使局域

21、結(jié)構(gòu)直到原子的細(xì)節(jié)成像，使它對于成核現(xiàn)象、 薄膜生長以及晶體生長的研究成為理想的工具。3.超導(dǎo)體的局域隧道譜？?Giaever (I960)的經(jīng)典隧道實(shí)驗(yàn)對超導(dǎo)性的 BCS 理論提供 了明確無誤的證據(jù)，作為局域探針的 SPM 肯定適于作超導(dǎo)體局域性質(zhì)的探測，例如 Abrikosov 磁通晶格。4表面化學(xué)？微電子與化學(xué)工業(yè)的大量工藝過程依賴于固體表面發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)。SPM提供一種與眾不同的機(jī)遇，在原子水平上研究這些化學(xué)反應(yīng)。例如，觀察金屬膜與半導(dǎo)體硅化物形成的初始階段，進(jìn)而研究Jchottky 勢壘的形成及晶體取向生長的性質(zhì)；通過觀察半導(dǎo)體樣品表面的能隙狀態(tài)來研究費(fèi)米能級的釘扎；研究表面化學(xué)反應(yīng)

22、的原子級細(xì)節(jié)；對原子簇化合物進(jìn)行深入研究，以尋求更新更多的特種催化劑；研究吸附質(zhì)/載體系統(tǒng)，推理吸附分子的局域電子性質(zhì)和對基底表面結(jié)構(gòu)的影響等。5. 生命科學(xué)研究？SPM 技術(shù)有在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用的諸多優(yōu)越性，如能夠在較高的分辨率水平上觀察樣品的實(shí)三維表面結(jié)構(gòu)；可在生命的天然條件下或準(zhǔn)天然條件下(常溫、常壓、大氣下、潮濕條件下或水溶液條件下)，對生物樣品的結(jié)構(gòu)進(jìn)行直接觀察，是生命科學(xué)家夢寐以求的事情；視野可從數(shù)納米到一百微米；樣品制作簡單，所需樣品量極少；儀器 成本低廉等。由于這些獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，為 SPM 在生命科學(xué)研究中的成功應(yīng)用展示了廣闊的前景。 目前已經(jīng)取得的成果，無一不顯示出 SPM

23、在生命科學(xué)中應(yīng)用的生命力。盡管目前很多成果還是初步的，但已經(jīng)顯示出 SPM 各有可能在天然和準(zhǔn)天然條件下，揭示生命的微觀結(jié)構(gòu)，這為揭示活性狀態(tài)的生命結(jié)構(gòu)及其變化提供了可能。6. 電化學(xué)？電解液與固體表面間的界面處發(fā)生的化學(xué)過程幾個(gè)世紀(jì)以來一直是科技的豐產(chǎn)田，包括電鍍、化學(xué)鍍、腐蝕與防腐蝕、電池以及其他許多應(yīng)用。早就知道電化學(xué)過程 明顯地依賴于電極表面的原子的細(xì)節(jié)。例如，對不同結(jié)晶學(xué)取向上的電鍍速率可相差兩個(gè)數(shù)量級。伏安測量的結(jié)果顯著地依賴于電極的原子排列，一個(gè)無暇的表面通常產(chǎn)生鮮明而可重復(fù)的伏安特性。STM 和 AFM 同樣能在液一固界面工作，對電化學(xué)過程在原子水平的研究提供自然的工具。STM

24、 對浸沒在電解液中固體表面成像的實(shí)現(xiàn)為電化學(xué)的研究開了一條新路。在電解液中實(shí)現(xiàn) STM 的主要困難是隧道電流與感應(yīng)電流相混，使信噪比變壞。隨著 AFM 的進(jìn)展，特別是斥力范疇內(nèi)的光束偏轉(zhuǎn)法， AFM 研究電解液下的固體表面成為現(xiàn)實(shí)。在液一固界面的AFM 可常規(guī)地達(dá)到原子分辨率。7.表面微細(xì)加工？?STM 在工作時(shí)，探針將充分接近樣品產(chǎn)生一高度空間限制的電子束， 因此在成像工作時(shí)，STM 具有極高的空間分辨率。與一般的聚焦電子束一樣，這個(gè)高度空間 限制的電子束也會在針尖所對應(yīng)的樣品表面微小區(qū)域中產(chǎn)生結(jié)構(gòu)性缺陷、相變、化學(xué)反應(yīng)和吸附質(zhì)移位等干擾， 并誘導(dǎo)化學(xué)淀積和腐蝕， 這正是 STM 可用于微細(xì)

25、加工的客觀依據(jù)，由于STM 裝置中針尖與樣品的間距很小，為納米數(shù)量級，這樣產(chǎn)生的電流總是流至（或發(fā)射至） 樣品表面直徑為納米級大小的區(qū)域，由它產(chǎn)生的區(qū)域?qū)⒏　?因此，用 STM 進(jìn)行表面加工一定是在納米尺度上進(jìn)行的，即 STM 所進(jìn)行的表面加工是納米加工，以后我們將看到利用STM甚至可對表面單個(gè)原子進(jìn)行操作。自從 STM 問世以來，把它作為一種納米加工工具的研究已經(jīng)涉及在表面直接刻寫、電子束輔助淀積、微小粒子及單原子操作等方面。STM 在該領(lǐng)域中的實(shí)際應(yīng)用前景是相當(dāng)誘人的。 首先，通過 STM 進(jìn)行的光刻、微區(qū)淀積和刻蝕等操作， 有可能將目前大規(guī)模集成電路線條寬 度從微米數(shù)量級降到納米數(shù)量級

26、，這是當(dāng)今世界技術(shù)領(lǐng)域追求的目標(biāo)之一；當(dāng)器件尺寸達(dá)到納米級甚至原子級時(shí)，量子效應(yīng)可能起主要作用，這是有可能發(fā)現(xiàn)新效應(yīng)，據(jù)此可設(shè)計(jì)出新 器件，用 STM 等手段實(shí)現(xiàn)這些新設(shè)想。其次，利用 STM 可修補(bǔ)表面掩膜及集成電路等的線路結(jié)構(gòu)。STM 在對表面進(jìn)行加工處理的過程中，可實(shí)時(shí)對表面形貌進(jìn)行成像，這樣可發(fā)現(xiàn)表面 各種結(jié)構(gòu)上的缺陷和損傷，并用表面淀積和刻蝕等方法建立或切斷連線，以消除缺陷，達(dá)到修補(bǔ)的目的；而后還可用 STM行成像，以檢查修補(bǔ)結(jié)果的好壞。另外，把STM 的針尖作為工具，可對原子團(tuán)或原子在表面上的生長、遷移、擴(kuò)散等物理過程及微小粒子間的相互作用，微小粒子與表面間的相互作用等進(jìn)行基礎(chǔ)研究

27、，以達(dá)到有目的地控制和安排原子團(tuán)甚至單個(gè)原子的目的。&表面的直接刻寫？當(dāng) STM 在恒流狀態(tài)下工作時(shí)，突然縮短針尖與樣品的間距或在針尖與樣品的偏置電壓上加一脈沖，針尖下樣品表面微區(qū)中將會出現(xiàn)納米級的坑、丘等結(jié)構(gòu)上的變化，這是 STM 所能產(chǎn)生的最普通的納米級結(jié)構(gòu)。產(chǎn)生這些結(jié)構(gòu)時(shí)，并不需要在樣品表面涂敷抗蝕膜，也不需要特定的液體或氣體氛圍，可將它們看成是針尖在樣品表面上的直接寫入。針尖進(jìn)行寫入操作后一般并未損壞，仍可對表面原子進(jìn)行成像，以實(shí)時(shí)檢驗(yàn)刻寫結(jié)果的好壞。對于不同的刻寫操作方式，產(chǎn)生納米級結(jié)構(gòu)的機(jī)理并不一樣。9.電子束光刻？電子束光刻及電子束輔助淀積和刻蝕是聚焦電子束通常應(yīng)用的領(lǐng)域

28、。STM 同樣可應(yīng)用在這些領(lǐng)域中，盡管這些應(yīng)用還很不成熟，但它所進(jìn)行的工作能獲得許多新 信息，得到許多新結(jié)果。用聚焦電子束進(jìn)行光刻時(shí)，可在涂敷抗蝕膜的樣品表面上直接刻寫曝光，以形成各種圖形。通常所用的抗蝕膜有聚甲基丙烯酸甲脂（PMM）含有尿烷的聚丁二炔（P4BCM）等，它們一般只對低能電子（小于20eV）敏感，故對通常所用的透鏡聚焦的電子束來說，由于入射電子能量很高（大于5kV）,這些抗蝕膜只能通過與一次入射束產(chǎn)生的二次電子的相互作用來曝光，加之存在背散式電子，結(jié)果導(dǎo)致抗蝕膜上實(shí)際曝光面積總是比一次束束徑大許 多。而對于 STM 即使工作在場發(fā)射模式，也能夠提供能量很低的可直接與抗蝕膜發(fā)生作用

29、 的聚焦電子束。由于針尖與樣品的間距很近，這個(gè)低能電子束在樣品表面上的有效束徑很小， 與該間距同一數(shù)量級；另外，STM 裝置可在水平方向上由計(jì)算機(jī)控制作精確的掃描，故它非常適用于電子束光刻技術(shù)。在抗蝕膜上進(jìn)行直接刻寫，抗蝕膜的曝光只需通過與一次束的相 互作用就可產(chǎn)生，可克服由于與二次電子相互作用所引起的分辨率降低的缺點(diǎn)，能獲得更精細(xì)的結(jié)構(gòu)，最終提高集成電路的集成度。另外，用STM 進(jìn)行光刻時(shí)，在恒流模式及特定時(shí)間間隔內(nèi)，通過控制偏壓（電子能量）就可精確控制曝光電子的能量，根據(jù)在不同曝光電子能 量下抗蝕膜的變化情況，可對抗蝕膜的曝光機(jī)理進(jìn)行深入研究。還有，諸如PMMA P4BCMU等抗蝕膜的曝光

30、時(shí)總是有化學(xué)反應(yīng)發(fā)生，因而用 STM 進(jìn)行光刻時(shí)，它一般要工作在場發(fā)射模式，以使電子具有足夠高的能量來引發(fā)化學(xué)反應(yīng)。這時(shí)若忽視幾何效應(yīng)，由于針尖與樣品的間距與偏壓成正比，故增加偏壓，同時(shí)將會增加所刻結(jié)構(gòu)的線條寬度。10. 電子束誘導(dǎo)淀積和刻蝕？電子束誘導(dǎo)淀積和刻蝕是一種在液體或氣體氛圍下在表面上形成各種結(jié)構(gòu)的方法，它可以看成是氣體或液體氛圍下的光刻。這在通常的電子束、離子束、和光束的光刻技術(shù)中已被廣泛使用。用 STMS行淀積和刻蝕操作的原理非常簡單。在一個(gè)非常小的區(qū)域內(nèi)用聚集電子束來提供能量分解化合物，分解產(chǎn)物中可包含金屬成分而沉積在表面上，或包含腐蝕成分而參加刻蝕反應(yīng)，并在表面上進(jìn)行局域刻蝕

31、。所用襯底有si、GaAs 等半導(dǎo)體及石墨、金屬等。用在液體條件下工作的STM 裝置，可提供實(shí)驗(yàn)要求的液體氛圍，此時(shí) STM 針尖要經(jīng)過一定的處理，如表面圖蠟等以抑制法拉第電流；也可將 STM 針尖作為電化學(xué)電極而產(chǎn)生局域的法拉第電流，然后用此電流去誘導(dǎo)淀積或腐蝕，此時(shí)所得結(jié)構(gòu)的分辨率比直接用隧道（或場發(fā)射）電流時(shí)要低，目前，還達(dá)不到納米級水平。氣體氛圍通常是通過在真空室中引入金屬有機(jī)化合物氣體來實(shí)現(xiàn)的。真空室本底壓強(qiáng)為 10-5-10-6Pa ,引入氣體一般到幾帕數(shù)量級，所用氣體有二甲基鎘（DMC） W（CO 6、WF6 及 Au 的有機(jī)化合物等，隨所需淀積金屬的不同而各異。有三種可能的機(jī)理可以解釋這些有機(jī)化