T載體與目的基因連接

1、一.重組質(zhì)粒的構(gòu)建 T 質(zhì)粒載體重組的 DNA 分子是在 DNA 連接酶的作用下，有 Mg2、ATP 存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將分別經(jīng)酶切的載體分子與外源 DNA 分子進行連接。DNA 連接酶有兩種：T4 噬菌體 DNA 連接酶和大腸桿菌 DNA 連接酶。兩種 DNA 連接酶都有將兩個帶有相同粘性末端的 DNA 分子連在一起的功能，而且 T4 噬菌體 DNA 連接酶還有一種大腸桿菌 DNA 連接酶沒有的特性，即能使兩個平末端的雙鏈 DNA 分子連接起來。但這種連接的效率比粘性末端的連接率低，一般可通過提高 T4 噬菌體 DNA連接酶濃度或增加 DNA 濃度來提高平末端的連接效率。T4 噬菌體 D

2、NA 連接酶催化DNA 連接反應(yīng)分為 3 步：首先，T4DNA 連接酶與輔因子 ATP 形成酶-ATP 復合物；然后，酶-ATP 復合物再結(jié)合到具有 5磷酸基和 3羥基切口的 DNA 上，使 DNA 腺昔化；最后產(chǎn)生一個新的磷酸二酯鍵，把切口封起來。連接反應(yīng)通常將兩個不同大小的片斷相連。很多 DNA 聚合酶在進行 PCR 擴增時會在 PCR 產(chǎn)物雙鏈 DNA 每條鏈的 3端加上一個突出的堿基AopUCm-T 載體是一種已經(jīng)線性化的載體，載體每條鏈的 3端帶有一個突出的 To 這樣，pUCm-T 載體的兩端就可以和 PCR 產(chǎn)物的兩端進行正確的 AT 配對，在連接酶的催化下，就可以把 PCR 產(chǎn)

3、物連接到 pUCm-T 載體中，形成含有目的片斷的重組載體。連接反應(yīng)的溫度在 37C 時有利于連接酶的活性。但是在這個溫度下粘末端的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的。因此采取折中的溫度，即 12-16C,連接 12-16h（過夜），這樣既可最大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又兼顧到短暫配對結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。二 .感受態(tài)制備原理細菌在 0CCaCl2低滲溶液中脹成球形，丟失部分膜蛋白，成為容易吸收外源 DNA的感受態(tài)。三 .-半乳糖甘酶顯色反應(yīng)選擇法LacZ 基因是大腸桿菌乳糖操縱子中的一個基因，可以編碼 3半乳糖核甘酶。3 一半乳糖核甘酶是由 4 個亞基組成的四聚體，可催化乳糖的水解.用 X-Gal 為底物進行染色時，

4、呈藍色?，F(xiàn)在一些特定的質(zhì)粒（比如 pUC/pBS 等），常帶有 3半乳糖核甘酶的調(diào)控序列和 3半乳糖核甘酶 N 端 146 個氨基酸（“肽段）的編碼序列，在這個編碼序列里還插入一個多克隆位點（MCS，它并不影響 lacZ 的表達。另外，常用的大腸桿菌帶有3 一半乳糖核甘酶 C 端部分序列（3 肽段），的編碼序列。在各自獨立的情況下，這些質(zhì)粒與大腸桿菌各自編碼的 3半乳糖核甘酶片段都沒有酶的活性。只有當攜帶 a肽編碼信息的克隆載體成功進入宿主細胞，在培養(yǎng)基誘導物 IPTG 的誘導下，載體質(zhì)粒能夠合成 3 一半乳糖核甘酶 N 端（a 肽段），這樣就與宿主細胞合成的 3 一半乳糖核音酶 C 端部分序

5、列（3 肽段）互補，形成完整的 3 一半乳糖核甘酶活性蛋白。而當外源基因插入到此種載體質(zhì)粒 lacZ 的多克隆位點后，會造成 lacZ 基因不能表達，從而不能合成 3 一半乳糖核甘酶；而對于空載體，lacZ 基因正常表達，通過“互補合成 3 一半乳糖核甘酶，分解培養(yǎng)基里的色素底物 X-gal,最終形成藍色的化合物，出現(xiàn)藍色菌斑。實驗準備：清洗，5 個 100ml 錐形瓶（外加 1 個小的），6 副培養(yǎng)皿，3 個小試劑瓶，接種環(huán)，涂布棒。準備 100ml 超純水。溶液:LB300ml（液體 50ml+50ml,固體100ml）,0.1mol/LCaCl210ml,100mg/mlAmp1ml,2

6、0mg/mlX-gal1ml,200mg/mlIPTG1ml。大腸桿菌菌液1mlo感受態(tài)細胞連接產(chǎn)物4 管 4x5=20ul 做 4 份目的基因T 載體T4 連接酶10 x 沖液4x4uL4x1uL4x0.5uL4x1uL滅菌：5 個 100ml 錐形瓶（外加 1 個小的），6 副培養(yǎng)皿，3 個小試劑瓶，接種環(huán)，涂布棒，10ml超純水，LB 培養(yǎng)基，1.5mlEP 管，大小槍頭，過濾用具 2 副，0.1mol/LCaCl2實際配置 20mg/mlX-galX-gal 為 5-澳-4-氯-3-口引喋-3-D 半乳糖甘。用二基甲酰胺（DMF 溶解 X-gal配制成的 20mg/ml（取 0.02g

7、X-gal,用 DMF 定容為 1ml）的貯存液。保存于一玻璃管或聚丙烯管中，裝有 X-gal 溶液的試管須用鋁箔封裹以防因受光照而被破壞， 并應(yīng)貯存于-20C。X-gal 溶液無須過濾除菌。（DMF 二甲基甲酰胺；Dimethylformamide;N,N-Dimethylformamide;DMF;CAS:68-12-2 理化性質(zhì)：無色、淡的胺味的液體。 分子式C3-H7-N-O。分子量73.10。相對密度0.9445 （25C）。熔點-61Co沸點152.8C。 ）溶于 DMSO 溶解度可達 20mg/ml。也溶于 DMF 溶于 DMSQ溶解度可達 20mg/ml。也溶于 DMF200m

8、g/mlIPTG 在 0.8ml 蒸儲水中溶解 0.2gIPTG 后，用蒸儲水定容至 1ml,用0.22 科 m 濾器過濾除菌，貯存于-20C。LB 培養(yǎng)基：配制每升培養(yǎng)基，應(yīng)該在 950ml 去離子水中加入：胰化蛋白月東 10g 酵母提取物 5gNaCl10g 搖動容器直至溶質(zhì)溶解.用 5mol/LNaOH 調(diào) pH 至 7.3.用去離子水定容至 1L.在 15psi 高壓下蒸汽滅菌20min.（100mlLB 培養(yǎng)基加入 1.5g 瓊脂粉為固體培養(yǎng)基）0.1mol/LCaCl2:取 0.11098g 氯化鈣固體定容至 10mlAmp（100mg/ml）：溶解 0.1g 氨葦青霉素鈉鹽于足量

9、的水中，最后定容至 1ml,用 0.2211m 濾膜過濾除菌.實驗過程（一） .目的基因片段與載體連接器材旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5ml 微量離心管，雙面離心管架，臺式離心機，干式恒溫氣浴。試齊 IT 載體，T4DNA 連接酶，連接酶緩沖液，無菌 ddWater。操作步驟PCR 產(chǎn)物與 T 載體直接連接：（1） 事先將干式恒溫儀（或冰盒里的水）溫度設(shè)定在 1416Co（2） 取 4 個滅菌的 200ul 微量離心管，加入：（需要調(diào)整）4ml 目的基因；1mlT 載體；0.5mlT4DNA 連接酶（TAKARA,350U/ul）;1ml 連接酶緩沖液 10 xbuffer;3

10、.5mlddWater，總量 10ml 體系。（3） 述混合液輕輕震蕩后再短暫離心，然后置于 14。C 干式恒溫儀（或 14。C水中）中保溫過夜（12-16h）。（4） 連接后的產(chǎn)物可以立即用來轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞或置 4。C 冰箱備用。（二） .大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備細菌轉(zhuǎn)化儀器：旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，50ml 微量離心管，1.5ml 微量離心管，臺式冷凍離心機，制冰機，恒溫搖床，分光光度計，超凈工作臺，恒溫培養(yǎng)箱，搖菌試管，三角燒瓶，接種環(huán)，恒溫搖床，培養(yǎng)皿（已鋪好固體 LB-Amp） ,酒精燈，玻璃涂棒，恒溫培養(yǎng)箱，濾膜和過濾器試劑： E.coli 菌種， LB 培養(yǎng)基，

11、0.1mol/LCaCl2 溶液， 無菌 ddWater,LB 培養(yǎng)基 （不加抗菌素），LB 培養(yǎng)基（加抗菌素），無菌 ddwater,IPTG,X-gal。步驟（1）在超凈工作臺中，將 1ml 大腸桿菌菌液加入 100mlLB 液態(tài)培養(yǎng)基（不含抗菌素），37c 搖床培養(yǎng)過夜。（2） 取 0.5ml 上述菌液轉(zhuǎn)接到含有 50mLLB 培養(yǎng)基的三角燒瓶中，37c 下250r/min 搖床培養(yǎng) 23h,測定 OD590 為 0.350.4 左右（0.40.6,細胞數(shù)108/mL,此為關(guān)鍵參數(shù)?。＃ㄗ⒁猓捍瞬綋u菌的時候，要有一管不加菌的 LB 培養(yǎng)液同時搖菌）（3） 將 1ml 菌液加入到 4 支

12、 1.5mL 預冷無菌的聚丙烯離心管中，于冰上放置 10min,然后于4C,5000rpm 離心 5min。立即在渦旋混合器上混勻，插入冰中放置 30mino(5)4C,5000rpm 離心 5min,棄上清液后， 用 100dL 冰冷的 0.1mol/LCaCl2 溶液垂懸， 插入冰中放置 2h,可以直接用作轉(zhuǎn)化實驗，或立即放入-4 攝氏度冰柜中保藏。(6)事先將恒溫水浴的溫度調(diào)到 42o(7)從-70C 超低溫冰柜中取出一管(100LL)感受態(tài)菌，立即用手指加溫融化后插入冰上，冰浴 510min。(8)加入 5dL 連接好的質(zhì)?；旌弦?DNA 含量不超過 100ng),輕輕震蕩后放置冰上

13、20min。(9)輕輕搖勻后插入 42c 水浴中 90s 進行熱休克，然后迅速放回冰中，靜置 3min。(10)在超凈工作臺中向上述各管中分別加入 300 科 LLB 培養(yǎng)基(不含抗菌素)輕輕混勻，然后固定到搖床的彈簧架上 37c 震蕩 1h。(11)在超凈工作臺中取上述轉(zhuǎn)化混合液 200dL,分別滴到含合適抗菌素(Amp100ug/L)的固體 LB 平板培養(yǎng)皿中，再在平板上滴加 40dL20mg/mlX-gal,7L200mg/mlIPTG,用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻(注意：一個不含抗生素作為對照組，玻璃涂布棒上的酒精熄滅后稍等片刻，待其冷卻后再涂，菌液涂皿操作時，應(yīng)避免反復來回涂布，

14、因為感受態(tài)細菌的細胞壁有了變化，過多的機械擠壓涂布會使細胞破裂，影響轉(zhuǎn)化率。)。(12)在涂好的培養(yǎng)皿上做上標記，先放置在 37c 恒溫培養(yǎng)箱中 30min 直到表面的液體都滲透到培養(yǎng)基里后，再倒置過來放入 37C 恒溫培養(yǎng)箱過夜。(13)在被細菌污染的桌面上噴灑 70 叱醇，擦干桌面。(14)觀察平板上長出的菌落克隆，以菌落之間能互相分開為好。注意白色菌斑。(三).轉(zhuǎn)化克隆的篩選和鑒定器材旋渦混合器，小鐐子，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5ml 微量離心管，雙面離心管架，干式恒溫氣浴(或恒溫水浴鍋)，制冰機，恒溫搖床，超凈工作臺，酒精燈，無菌牙簽，搖菌管。試齊 ILB 培養(yǎng)基(加抗菌素)，

15、PCR 用試劑，引物，質(zhì)粒提取用試劑，酶切需要的限制性內(nèi)且酶及其緩沖液，65%甘油(65%甘油，0.1mol/LMgSO4,0.025mol/LTrisClpH8.0)。操作步驟方法一：快速 PCR 篩選法(1)在轉(zhuǎn)化的平板培養(yǎng)基上隨機選取 4 個邊緣清晰的白色菌落，并用記號筆在其所在的培養(yǎng)皿底部玻璃背面畫圈做標記編號。(2)在 0.2mlPCR 微量離心管中配制 256 反應(yīng)體系。ddwater16 科 l(4)將離心管倒置以倒盡上清液，加入1ml 冰冷的 0.1mol/LCaCl2 溶液,10 xPCRbuffer(不含 MgCl2)2.5l25mMMgCl21.5l2.5mmol/LdN

16、TP2l(每種 dNTP 終濃度 0.2mM)10mol/LPrimeri1 科 l(12.525pmoles)10mol/Lprimer21 科 l(12.525pmoles)模板質(zhì)粒用小 tip 頭輕輕粘一下選中的白色菌落，再伸入 PCR 混合液中洗一洗Taq 酶 0.5 科 l(1.5u)總體積 25 科 l(2)根據(jù)廠商的操作手冊設(shè)置 PCR 儀的循環(huán)程序(本實驗室已經(jīng)設(shè)置為 WZ:94C5min94C1min60C1min72C1min50sgoto29times72c10min(2)PCR 結(jié)束后，取 10 科 l 產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳(與原始插入片斷同時比對)。觀察膠上是否有預計的主要產(chǎn)物帶。(3)按照編號找到培養(yǎng)皿中的原菌斑。根據(jù)需要進行放大培養(yǎng)提取其質(zhì)粒(4)提取到的質(zhì)粒與原先的空載體(或已知分子量的質(zhì)粒)再對比電泳，以進一步確認。方法二：提質(zhì)粒再 PCR 或酶切鑒定(1)在超凈工作臺中取 3 支無菌搖菌管，各加入 3mLLB(含 50mg/mL 氨茉青霉素)，用記號筆寫好編號。(2)在超凈工作臺中將 70%乙醇浸泡的小鐐子頭用酒精燈烤過，鐐?cè)∫恢o菌牙簽。用牙簽的尖部接觸轉(zhuǎn)化的平板培養(yǎng)基上的一個白色菌落，然后將牙簽放入盛有3mLLB(含