293T細胞轉染201709271600291

1、細胞轉染實驗1.實驗目的學習和掌握外源基因導入真核細胞的主要方法一脂質體介導的轉染。了解外源基因進入的一般性方法，觀測外源蛋白的表達（綠色熒光蛋白），為染色準備實驗材料。2.實驗原理RlbMOHtl上圖所示是脂質體介導轉染的示意圖，它顯示了外源質粒進入細胞的一般過程。外源基因進入細胞主要有四種方法：電擊法、磷酸鈣法和脂質體介導法和病毒介導法。電擊法是在細胞上短時間暫時性的穿孔讓外源質粒進入；磷酸鈣法和脂質體法是利用不同的載體物質攜帶質粒通過直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因進入細胞；病毒法是利用包裝了外源基因的病毒感染細胞的方法使得其進入細胞。但是由于電擊法和磷酸鈣法的實驗條件控制較嚴、難度

2、較大；病毒法的前期準備較復雜、廣州息行虎生化醫(yī)藥有限公司廣州息行虎生化醫(yī)藥公司成立于2017年8月21日,公司成立的緣由是發(fā)起人察覺到社會經濟的發(fā)展浪潮和人民生活的更新期待需要有一個敢于挑戰(zhàn)風險、善于克服困難、勇于探索前進、勤于變革創(chuàng)新、肯于傳播正義的社會團體站出來承擔責任,公司的宗旨是改變每個人的生活記憶，讓人類生活更加生態(tài)環(huán)保和更加智能安康.公司的營業(yè)范疇涵蓋：生命科學研究生態(tài)智能化實晚室創(chuàng)建、化工制造生態(tài)智能化車間創(chuàng)建、醫(yī)療檢測和治療生態(tài)智能化臨床創(chuàng)建、藥品內外用生態(tài)智能化健康創(chuàng)建。公司聯(lián)系手機來電一般情況能接聽，特殊情況下未接的當天回電，不需回電的請發(fā)短信注明

3、。現(xiàn)階段公司自主研發(fā)的部分產品目錄:產品編號產品名稱產品規(guī)格產品價格Xxh1RealTimePCR2x預混液1ml50-70元5ml200-230元Xxh2總RNA提取液20ml70-90元50ml150-180元100ml270-300元Xxh3總DNA提取液100ml100-200元Xxh4總protein提取液強50ml60-70元100ml中50ml50-60元100ml90410元弱50ml40-50元100ml|70-90元Xxh5TaqDNApolymerasePCR試劑盒TaqM200U20-25元Taq酶1000U80-90元Taq®5000U350-380元Xxh

4、6CDNA第一鏈合成試劑盒20次250-280元50次550-600元100次1000-1100元Xxh7總糖提取和檢測試劑盒500ml100-200元Xxh8黃酮類化合物的提取、分離純化和含量測定試劑盒500ml100-200元Xxh9紫外流膠照膠儀30cm*30cm*30cm,260nm700-1000元Xxh10慢病毒包裝服務電議Xxh11腺病毒包裝服務Xxh12細胞培養(yǎng)服務Xxh13植物組織培養(yǎng)服務Xxh14CRISPR-Cas9敲靶點服務Xxh15細菌突變體構建服務Xxh16感受態(tài)DH5Q1支12-15元10支100-130元50支400.450元BL21(

5、DE3)：1支12-15元10支100-130元50支400-450元Stbl33支3040元10支250-300元50支1100-1200元ToplO工支13-15元10支110430元50支480-530元EHA105二支20-23元10支180-220元50支850-950元Xxh17便隱血檢測家用試紙10片20元50片90元100片170元Xxh18質粒構建服務電議Xxh19觀賞熒光植物40cm*40cm*50cm500元而且可能對于細胞有較大影響；所以現(xiàn)在對于很多普通細胞系，一般的瞬時轉染方法多采用脂質體法。利用脂質體轉染法最重要的就是防止其毒性，因此脂質體

6、與質粒的比例，細胞密度以及轉染的時間長短和培養(yǎng)基中血清的含量都是影響轉染效率的重要問題，通過實驗摸索的合適轉染條件對于效率的提高有巨大的作用。CHg。o上圖是本次實驗采用的脂質體中陽離子組分的結構的示意圖。本次實驗采用的脂質體是promega公司的TransFast脂質體試劑，它是一種陽離子脂質體和中性脂質體的混合物，是對于本次實驗中采用的293T細胞優(yōu)化的轉染試劑。3 .實驗材料與器材1）材料293T名田胞MyoD表達質粒和EGFP表達質粒DMEM培養(yǎng)基鏈霉素/青霉素（雙抗）FCS（小牛血清）PBS（磷酸鹽緩沖溶液）胰酶/EDTA消化液轉染試劑(TransFast)2)器材20ul/200u

7、l/1ml微量移液器和Tip頭酒精燈廢液缸血球計數板渦旋振蕩器恒溫水浴箱臺式離心機35mm培養(yǎng)皿轉染管15ml離心管觀察用倒置顯微鏡熒光顯微鏡和CCD4 .實驗步驟細胞傳代(1)試驗準備：200ul/1mlTip頭各一盒(以上物品均需高壓滅菌)，酒精棉球，廢液缸，試管架，微量移液器，記號筆，培養(yǎng)皿，離心管。(2)棄掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用1ml的PBS溶液洗滌兩次。(3)用Tip頭加入1mlTrypsin液，消化1分鐘(37°C,5%CO2)。用手輕拍培養(yǎng)瓶壁，觀察到細胞完全從壁上脫落下來為止。(4)加入1ml的含血清培養(yǎng)基終止反應。(5)用Tip頭多次吹吸，使細胞完全分散開。(6)將

8、培養(yǎng)液裝入離心管中，1000rpm離心5min。(7)用培養(yǎng)液重懸細胞，細胞計數后選擇0.8X106個細胞加入一個35mm培養(yǎng)皿。(8)將合適體積完全培養(yǎng)液加入離心管中，混勻細胞后輕輕加入培養(yǎng)皿中，使其均勻分布。(9)將培養(yǎng)皿轉入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第二天轉染。細胞轉染1)轉染試劑的準備A.將400ul去核酸酶水加入管中，震蕩10秒鐘，溶解脂狀物。B.震蕩后將試劑放在20攝氏度保存，使用前還需震蕩，。2)選擇合適的¥M合比例(1:11:2/脂質體體積：DNA質量)來轉染細胞。在一個轉染管中加入合適體積的無血清培養(yǎng)基。加入合適質量的MyoD或者EGFP的DNA,震蕩后在加入合適體積的轉染試劑，再次震蕩。5)將混合液在室溫放置10-15分鐘。6)吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次。7)加入混合液，將細胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個小時8）到時后，根據細胞種類決定是否移除混合液，之后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2448小時。第二次細胞傳代1)在轉