酶分子化學(xué)修飾

1、1第四章第四章 酶分子的修飾酶分子的修飾 2第二節(jié)第二節(jié) 酶化學(xué)修飾的種類及應(yīng)用酶化學(xué)修飾的種類及應(yīng)用 一、酶的表面化學(xué)修飾一、酶的表面化學(xué)修飾 （一）大分子修飾（一）大分子修飾（大分子結(jié)合修飾）（大分子結(jié)合修飾） 是目前應(yīng)用最廣的酶分子修飾方法。是目前應(yīng)用最廣的酶分子修飾方法。 1.1.定義：定義：利用水溶性大分子與酶結(jié)合，使酶的空間結(jié)利用水溶性大分子與酶結(jié)合，使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細(xì)的改變，從而改變酶的特性與功能的構(gòu)發(fā)生某些精細(xì)的改變，從而改變酶的特性與功能的方法。方法。32. 2. 修飾劑：修飾劑： 聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）、右旋糖酐（）、右旋糖酐（dextrandextra

2、n）、肝）、肝素（素（heparinheparin）、蔗糖聚合物（）、蔗糖聚合物（FicollFicoll）等。）等。 修飾方法：修飾前活化，然后在一定條件下與修飾方法：修飾前活化，然后在一定條件下與酶分子共價(jià)結(jié)合。酶分子共價(jià)結(jié)合。43. 3. 應(yīng)用：應(yīng)用：如：如：PEGPEG超氧化物歧化酶（超氧化物歧化酶（SODSOD） PEGPEG溶血類蛋白質(zhì)（鏈激酶、尿激酶等）溶血類蛋白質(zhì)（鏈激酶、尿激酶等） PEGPEG天門冬酰胺酶（天門冬酰胺酶（ASNaseASNase） 消除了抗原性消除了抗原性 延長(zhǎng)了酶在體內(nèi)的半衰期延長(zhǎng)了酶在體內(nèi)的半衰期又如：用又如：用Dextran Dextran 右旋糖酐右

3、旋糖酐 修飾修飾 - -淀粉酶，淀粉酶，淀粉酶，胰淀粉酶，胰蛋白酶、過(guò)氧化氫酶，提高了酶的熱穩(wěn)定性。蛋白酶、過(guò)氧化氫酶，提高了酶的熱穩(wěn)定性。5（二）小分子修飾（二）小分子修飾 （酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)修飾）（酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)修飾）1 1 概念概念定義：通過(guò)選擇性的試劑或親和標(biāo)記試劑與酶分子側(cè)鏈定義：通過(guò)選擇性的試劑或親和標(biāo)記試劑與酶分子側(cè)鏈上特定的功能基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。上特定的功能基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。側(cè)鏈基團(tuán)：組成蛋白質(zhì)氨基酸殘基上的功能團(tuán)。主要有：側(cè)鏈基團(tuán)：組成蛋白質(zhì)氨基酸殘基上的功能團(tuán)。主要有：氨基、羧基、胍基、巰基、酚基、咪唑基。氨基、羧基、胍基、巰基、酚基、咪唑基。側(cè)鏈基團(tuán)修飾劑：采用的各種小分子

4、化合物。側(cè)鏈基團(tuán)修飾劑：采用的各種小分子化合物。 2020種不同氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán)中種不同氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán)中只有極性只有極性氨基酸的側(cè)氨基酸的側(cè)鏈易被修飾，它們一般具有親核性。鏈易被修飾，它們一般具有親核性。6根據(jù)氨基酸側(cè)鏈根據(jù)氨基酸側(cè)鏈R R基的極性，基的極性，2020種氨基酸可分成種氨基酸可分成4 4類類。 非極性非極性R R基氨基酸（共基氨基酸（共8 8種）：種）： 丙氨酸丙氨酸(Alanine,Ala,A),(Alanine,Ala,A), 亮氨酸亮氨酸(Leucine,Leu, L),(Leucine,Leu, L), 纈氨酸纈氨酸(Valine,Val,V),(Valine,Val,

5、V), 異亮氨酸異亮氨酸(Isoleucine,Ile,I),(Isoleucine,Ile,I), 苯丙氨酸苯丙氨酸(Phenylalanine,Phe,F),(Phenylalanine,Phe,F), 色氨酸色氨酸(Tryptophan,Trp,W),(Tryptophan,Trp,W), 甲硫氨酸甲硫氨酸(Methionine,Met,M),(Methionine,Met,M), 脯氨酸脯氨酸(Proline,Pro,P)(Proline,Pro,P)7 無(wú)電荷的極性無(wú)電荷的極性R R基氨基酸（共基氨基酸（共7 7種）：種）：絲氨酸絲氨酸(Serine,Ser,S),(Serine,S

6、er,S), 蘇氨酸蘇氨酸(Threonine,Thr,T),(Threonine,Thr,T),酪氨酸酪氨酸(Tyrosine,Tyr,Y),(Tyrosine,Tyr,Y), 半胱氨酸半胱氨酸(Cysteine,Cys,C),(Cysteine,Cys,C),天冬酰胺天冬酰胺(Asparagine,Asn,N),(Asparagine,Asn,N),甘氨酸甘氨酸(Glycine,Gly,G),(Glycine,Gly,G), 谷氨酰胺谷氨酰胺(Glutamine,Gln,Q)(Glutamine,Gln,Q)帶正電荷的極性帶正電荷的極性R R基氨基酸（共基氨基酸（共3 3種）：種）：賴氨酸

7、賴氨酸(Lysine,Lys,K),(Lysine,Lys,K), 精氨酸精氨酸(Arginine,Arg,R),(Arginine,Arg,R),組氨酸組氨酸(Histidine,His,H)(Histidine,His,H)帶負(fù)電荷的極性帶負(fù)電荷的極性R R基氨基酸（共基氨基酸（共2 2種）：種）：天冬氨酸天冬氨酸(Aspartic acid,Asp,D),(Aspartic acid,Asp,D),谷氨酸谷氨酸(Glutamic acid,Glu,E)(Glutamic acid,Glu,E)8小分子修飾小分子修飾的幾種重要反應(yīng)：的幾種重要反應(yīng)： 烷基化反應(yīng)烷基化反應(yīng) ?；磻?yīng)?；磻?yīng)

8、氧化還原反應(yīng)氧化還原反應(yīng) 芳香環(huán)取代反應(yīng)芳香環(huán)取代反應(yīng)92 2 修飾反應(yīng)修飾反應(yīng)1) 1) 烷基化反應(yīng)烷基化反應(yīng) 試劑特點(diǎn)：試劑特點(diǎn)：烷基上帶活潑鹵素，導(dǎo)致酶分子的親核烷基上帶活潑鹵素，導(dǎo)致酶分子的親核基團(tuán)基團(tuán)（如（如NHNH2 2，-SH-SH等）等）發(fā)生烷基化。發(fā)生烷基化。 可作用基團(tuán)：可作用基團(tuán)： 氨基氨基（LysLys賴賴，ArgArg精精），），巰基巰基（CysCys半光半光），），羧基羧基（AspAsp天冬天冬、GluGlu谷谷），），甲硫基甲硫基（MetMet甲硫甲硫），），咪唑基咪唑基（HisHis組組）。 修飾劑：修飾劑：2 2，4 4二硝基二硝基氟氟苯、苯、碘碘乙酸、乙酸、

9、碘碘乙酰胺等。乙酰胺等。 10烷基化反應(yīng)烷基化反應(yīng)11 2) 2) ?；磻?yīng)?；磻?yīng) 試劑特點(diǎn)：試劑特點(diǎn)：含有含有 結(jié)構(gòu)，作用于側(cè)鏈基團(tuán)上的結(jié)構(gòu)，作用于側(cè)鏈基團(tuán)上的 親核親核基團(tuán)，使之酰基化。基團(tuán)，使之?；?。 可作用基團(tuán)：可作用基團(tuán)： 氨基，巰基，醇羥基氨基，巰基，醇羥基（SerSer絲絲、ThrThr蘇蘇），），酚羥基酚羥基（TyrTyr絡(luò)絡(luò)）12酰基化反應(yīng)13 3) 3) 氧化還原反應(yīng)氧化還原反應(yīng) 試劑特點(diǎn)：具有氧化或還原性。試劑特點(diǎn)：具有氧化或還原性。 氧化劑：氧化劑：H H2 2O O2 2 ，N-N-溴代琥珀酰亞胺溴代琥珀酰亞胺 可被氧化的側(cè)鏈基團(tuán)：可被氧化的側(cè)鏈基團(tuán)：巰基，甲

10、硫基，吲哚基（巰基，甲硫基，吲哚基（TrpTrp）、）、咪唑基，酚基等。咪唑基，酚基等。 還原劑：還原劑：2 2巰基乙醇、巰基乙醇、DTTDTT等。等。 可被還原的側(cè)鏈基團(tuán)：二硫鍵?？杀贿€原的側(cè)鏈基團(tuán)：二硫鍵。14連四硫酸鹽氧化巰基，連四硫酸鹽氧化巰基，DTTDTT還原逆回，用于保護(hù)巰基。還原逆回，用于保護(hù)巰基。15 4) 4) 芳香環(huán)取代反應(yīng)芳香環(huán)取代反應(yīng) 試劑：鹵（碘）化，硝化試劑。試劑：鹵（碘）化，硝化試劑。 碘代：碘代： I2 + HI 硝化：硝化： (NO2)4C + +(NO2)3CH （四硝基甲烷）（四硝基甲烷）163 3 特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的

11、化學(xué)修飾1) 1) 氨基的氨基的化學(xué)修飾：化學(xué)修飾：來(lái)源：來(lái)源：LysLys賴賴, Arg, Arg精精, His, His組組, Gln, Gln谷谷修飾反應(yīng)：?；c烷基化修飾反應(yīng)：?；c烷基化?；揎梽；揎梽? : 三硝基苯磺酸（三硝基苯磺酸（TNBSTNBS）、丹磺酰氯（）、丹磺酰氯（DNSDNS）烷基化修飾劑：烷基化修飾劑： 2 2，4 4二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFBDNFB）、碘乙酸、碘乙酰胺、）、碘乙酸、碘乙酰胺、亞硝酸等亞硝酸等172，4二硝基氟苯二硝基氟苯碘乙酸碘乙酸三硝基苯磺酸三硝基苯磺酸18 2) 2) 羧基羧基的化學(xué)修飾的化學(xué)修飾 修飾羧基的反應(yīng)專一性較差

12、。修飾羧基的反應(yīng)專一性較差。 常用水溶性碳化二亞胺修飾天冬氨酸和谷氨酸。常用水溶性碳化二亞胺修飾天冬氨酸和谷氨酸。 可定量測(cè)定酶分子中羧基的數(shù)目。可定量測(cè)定酶分子中羧基的數(shù)目。 + 水溶性碳化二亞胺水溶性碳化二亞胺193)3)胍基胍基的化學(xué)修飾的化學(xué)修飾來(lái)源：來(lái)源：Arg Arg 精精修飾反應(yīng)：本質(zhì)上是羰修飾反應(yīng)：本質(zhì)上是羰Tang Tang =co基對(duì)氨基酰基化?；鶎?duì)氨基酰基化。修飾劑：修飾劑： 丁二酮丁二酮 二羰基化合物二羰基化合物 1 1，2 2環(huán)己二酮環(huán)己二酮 苯乙二醛苯乙二醛20214)4)巰基的化學(xué)修飾巰基的化學(xué)修飾 來(lái)源：來(lái)源：CysCys半光半光 修飾反應(yīng)修飾反應(yīng): :烷基化烷

13、基化 修飾劑：碘乙酸修飾劑：碘乙酸(IAA) (IAA) 碘乙酰胺碘乙酰胺(IAM)(IAM) E-SH + R-X E-SR +HX N- N-乙基馬來(lái)酰亞胺（乙基馬來(lái)酰亞胺（NEMNEM）（常用的專一修飾巰基試劑）（常用的專一修飾巰基試劑） ESH 225) 5) 二硫鍵的化學(xué)修飾二硫鍵的化學(xué)修飾還原：巰基乙醇、二硫蘇糖醇（還原：巰基乙醇、二硫蘇糖醇（DTTDTT）23氧化：過(guò)甲酸氧化：過(guò)甲酸: :24 6)6)咪唑基的化學(xué)修飾咪唑基的化學(xué)修飾 來(lái)源：來(lái)源：HisHis組組 修飾反應(yīng)修飾反應(yīng): :?；c烷基化?；c烷基化 ?；揎梽；揎梽? : 常用焦碳酸二乙酯常用焦碳酸二乙酯

14、（diethyl paracarbonatediethyl paracarbonate） + + C2H5OH +CO2 烷基化修飾劑：烷基化修飾劑：碘乙酸碘乙酸257 7）酚羥基的化學(xué)修飾）酚羥基的化學(xué)修飾來(lái)源：來(lái)源：TyrTyr酪酪修飾反應(yīng)：芳香環(huán)取代反應(yīng)修飾反應(yīng)：芳香環(huán)取代反應(yīng)修飾劑：碘、硝化試劑（四硝基甲烷）修飾劑：碘、硝化試劑（四硝基甲烷）268 8）吲哚基的化學(xué)修飾）吲哚基的化學(xué)修飾 來(lái)源：來(lái)源：TrpTrp色色 修飾反應(yīng)：氧化反應(yīng)修飾反應(yīng)：氧化反應(yīng) 修飾劑：修飾劑： N-N-溴代琥珀酰亞胺溴代琥珀酰亞胺27 各種氨基酸側(cè)鏈的修飾劑各種氨基酸側(cè)鏈的修飾劑28但解釋修飾效果須十分小心

15、，因?yàn)椋旱忉屝揎椥Ч毷中⌒?，因?yàn)椋喝魏我环N修飾劑不是絕對(duì)專一的。任何一種修飾劑不是絕對(duì)專一的。有些修飾劑引起蛋白質(zhì)構(gòu)象變化有些修飾劑引起蛋白質(zhì)構(gòu)象變化失活，失活， 不一定是活性中心基團(tuán)被共價(jià)修飾。不一定是活性中心基團(tuán)被共價(jià)修飾。不同部分的相同基團(tuán)，修飾效果不同，分子不同部分的相同基團(tuán)，修飾效果不同，分子內(nèi)部的必需基團(tuán)，不易被修飾。內(nèi)部的必需基團(tuán)，不易被修飾。29（三）交聯(lián)修飾（三）交聯(lián)修飾（交聯(lián)法）（交聯(lián)法） 用雙功能基團(tuán)試劑用雙功能基團(tuán)試劑( (如戊二醛如戊二醛) )，與酶分子內(nèi)不同，與酶分子內(nèi)不同肽鏈部分共價(jià)交聯(lián)，使酶分子空間構(gòu)象更加穩(wěn)定。肽鏈部分共價(jià)交聯(lián)，使酶分子空間構(gòu)象更加穩(wěn)定。

16、（四）固定化修飾（四）固定化修飾（共價(jià)偶聯(lián)法）（共價(jià)偶聯(lián)法） 通過(guò)酶表面的酸性或堿性殘基，將酶共價(jià)連接到通過(guò)酶表面的酸性或堿性殘基，將酶共價(jià)連接到惰性載體上，由于酶所處的微環(huán)境發(fā)生改變，使酶的惰性載體上，由于酶所處的微環(huán)境發(fā)生改變，使酶的最適最適pHpH、最適溫度和穩(wěn)定性發(fā)生改變。、最適溫度和穩(wěn)定性發(fā)生改變。30二、酶分子內(nèi)部修飾二、酶分子內(nèi)部修飾（一）蛋白主鏈修飾（一）蛋白主鏈修飾（肽鏈有限水解修飾）（肽鏈有限水解修飾） 蛋白主鏈修飾采用酶法蛋白主鏈修飾采用酶法（用專一性較強(qiáng)的蛋白酶或肽酶（用專一性較強(qiáng)的蛋白酶或肽酶為修飾劑）為修飾劑）。 （與前面化學(xué)修飾區(qū)別）（與前面化學(xué)修飾區(qū)別） 31

17、酶蛋白的肽鏈被水解后，可能出現(xiàn)以下三種情況酶蛋白的肽鏈被水解后，可能出現(xiàn)以下三種情況中的一種：中的一種： 1 1 引起酶活性中心的破壞，酶失去催化功能。引起酶活性中心的破壞，酶失去催化功能。 2 2 仍維持活性中心的完整構(gòu)象，保持酶活力。仍維持活性中心的完整構(gòu)象，保持酶活力。 3 3 有利于活性中心與底物結(jié)合并形成準(zhǔn)確的催化有利于活性中心與底物結(jié)合并形成準(zhǔn)確的催化部位，酶活力提高。部位，酶活力提高。 后兩種情況，肽鏈的水解在限定的肽鍵上進(jìn)行，后兩種情況，肽鏈的水解在限定的肽鍵上進(jìn)行，稱肽鏈有限水解。稱肽鏈有限水解。應(yīng)用實(shí)例：應(yīng)用實(shí)例：1）提高酶活力：）提高酶活力：2）消除抗原性：）消除抗原性：32（二）氨基酸置換修飾（二）氨基酸置換修飾 將肽鏈上的某一個(gè)氨基酸換成另一個(gè)氨基酸，引起酶將肽鏈上的某一個(gè)氨基酸換成另一個(gè)氨