表達譜及小RNA

1、數(shù)字基因表達譜升級版RNA-Seq(Quantification)或稱為 Tag-seq實驗流程實驗流程Total RNAEnrich mRNA by Oligo （dT）Remove rRNARandom hexamer primed cDNA synthesisSize selection and PCR amplificationIllumina sequencingRNA fragment( 200 nt)EukaryotesProkaryotes分析內(nèi)容差異表達基因篩選差異表達基因篩選PathwayPathway顯著性富集分析顯著性富集分析Clean TagClean Tag數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)

2、GOGO功能顯著性富集分析功能顯著性富集分析測序飽和度分析測序飽和度分析表達模式聚類分析表達模式聚類分析基因注釋、標準化基因注釋、標準化反義鏈的轉錄分析反義鏈的轉錄分析原始序列數(shù)據(jù)原始序列數(shù)據(jù)共有、特有共有、特有TagTag分析分析表達量及分布分析表達量及分布分析實驗重復性分析實驗重復性分析新轉錄本檢測新轉錄本檢測蛋白互作網(wǎng)絡分析蛋白互作網(wǎng)絡分析Tag-Seq與基因芯片優(yōu)缺點比較與基因芯片優(yōu)缺點比較技術優(yōu)點缺點RNA-seq1）檢測基因數(shù)比基因芯片多檢測基因數(shù)比基因芯片多2）定量準，可重復性高（重復相關系定量準，可重復性高（重復相關系數(shù)數(shù)0.99）3）數(shù)字化信號，背景噪音數(shù)字化信號，背景噪音低

3、低，無交叉，無交叉雜交雜交4）高、低豐度基因高、低豐度基因均均可檢測可檢測5）不受研究物種限制，模式生物和非不受研究物種限制，模式生物和非模式生物均可檢測模式生物均可檢測6）數(shù)據(jù)可與時俱進，即隨數(shù)據(jù)庫更新數(shù)據(jù)可與時俱進，即隨數(shù)據(jù)庫更新而更新而更新7）具有較好的分析兼容性，數(shù)據(jù)格式具有較好的分析兼容性，數(shù)據(jù)格式與芯片相同，可與芯片的分析軟件兼與芯片相同，可與芯片的分析軟件兼容容1）樣本要求量比基因芯片多）樣本要求量比基因芯片多2）數(shù)據(jù)量大，需要具備一定的生物信息分）數(shù)據(jù)量大，需要具備一定的生物信息分析基礎，才能更好的挖掘數(shù)據(jù)蘊含的豐富析基礎，才能更好的挖掘數(shù)據(jù)蘊含的豐富信息信息基因基因芯片芯片1

4、）平臺應用較早）平臺應用較早2）信息分析軟件較多）信息分析軟件較多3）有些平臺要求樣品量少）有些平臺要求樣品量少1）檢測靈敏度較低、重復性差、檢測閾值）檢測靈敏度較低、重復性差、檢測閾值較狹窄較狹窄2）有背景噪音，假陽性率）有背景噪音，假陽性率1%3）受物種限制，只能檢測部分模式生物）受物種限制，只能檢測部分模式生物4）受基因拷貝數(shù)限制，無法檢測出低豐度）受基因拷貝數(shù)限制，無法檢測出低豐度基因基因5）只能檢測已知轉錄本，無法檢測出新轉）只能檢測已知轉錄本，無法檢測出新轉錄本錄本6）受數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)所限，因探針依靠現(xiàn)有數(shù)）受數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)所限，因探針依靠現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫或比較舊的版本的數(shù)據(jù)庫來設計的，據(jù)庫或比

5、較舊的版本的數(shù)據(jù)庫來設計的，可能出現(xiàn)注釋不準確的情況可能出現(xiàn)注釋不準確的情況BGI 實驗p實驗材料 (MAQC標準品) Universal Human Reference RNA (UHRR) from Stratagene. Human Brain Reference RNA (HBRR) from Ambion.p比對數(shù)據(jù) RNA-Seq for UHRR and HBRR by BGI. Microarray for UHRR and HBRR by a major company Affimetrix (GEO: GSM122774GSM122783). qPCR quantifica

6、tion for UHRR and HBRR (GEO 數(shù)據(jù)庫中有這兩個樣品約1000 個基因的qPCR 定量結果）* The purpose of the MAQC project is to provide quality control tools to the microarray community in order to avoid procedural failures and to develop guidelines for microarray data analysis by providing the public with large reference datase

7、ts along with readily accessible reference RNA samples. See at FDA /ScienceResearch/BioinformaticsTools/MicroarrayQualityControlProject/default.htm Tag-Seq和 qPCR的相關性n=903 genesn=903 genesPearson r=0.9117Pearson r=0.9117Spearman rank r=0.8603Spearman rank r=0.8603Pearson r=0.8575Pear

8、son r=0.8575Spearman rank r=0.8321Spearman rank r=0.8321n=851 genesn=851 genes0 200 400 600 800 1000 1200 Tag-Seq_gene expression (RPKM)3020100403020100qPCR_gene expression 0 200 400 600 800 1000 1200 1400Tag-Seq_gene expression (RPKM)n=872 genesn=872 genes兩種樣品兩種樣品的的Tag-Seq 和和qPCR 都具有較好的相關性都具有較好的相關性

9、qPCR_gene expression qPCR: Log2(HBRR/UHRR)50-5-10-10-10 -5 0 5Tag-Seq: Log2(HBRR/UHRR)Affymetrix: Log2(HBRR/UHRR)n=474 genesn=767 genes50-5-10-6 -4 -2 0 2 4 6 Pearson r=0.9176Spearman rank r=0.8966Pearson r=0.891Spearman rank r=0.868Tag-Seq比比Affymetrix芯片具有更高的相關性芯片具有更高的相關性Tag-Seq、Affymetrix 芯片分別與qPCR

10、的相關性比較（HBRR/UHRR）Tag-Seq & qPCRAffy & qPCR東北農(nóng)大Tag-seq文章l研究對象：黃瓜的雄雌同株材料，和它的突變體材料（全雌研究對象：黃瓜的雄雌同株材料，和它的突變體材料（全雌株）。株）。l平行培養(yǎng)兩類材料，在平行培養(yǎng)兩類材料，在 2 2葉葉1 1心期，取莖尖組織提前心期，取莖尖組織提前RNARNA，進，進行行Tag-seqTag-seq分析分析, ,每個材料取了每個材料取了1515株進行混合抽提株進行混合抽提RNA.RNA.l文章的內(nèi)容是文章的內(nèi)容是DEGDEG的結果與分析。的結果與分析。l用用RT-PCRRT-PCR和和qRT-PCRqRT-PCR對

11、對Tag-seqTag-seq得到的差異表達基因做了驗證得到的差異表達基因做了驗證分析。分析。 本文的亮點是，針對一些通過Tag-seq找出來的差異基因，且是以前有過報道參與花發(fā)育進程的基因，利用RT-PCR方法分別對它們在子房和花上部做了不同發(fā)育時期的表達模式分析。 該部分實驗結果成為了他們討論部分的主要內(nèi)容。 這一個思路值得借鑒，有了Tag-seq數(shù)據(jù)后，找自己關注的而且有些研究背景的基因進行RT-PCR分析，以便于撰寫文章的討論部分。10豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是一種全世界范圍內(nèi)影響家豬生產(chǎn)的重要疾病，每年都會造成很多的經(jīng)濟損失。PRRS病毒感染分子機制目前了解甚少。本研究第一次應

12、用了illumina的數(shù)字基因表達譜技術在全基因組水平研究了宿主在感染N-PRRSV（經(jīng)典北美型PRRSV）CH1a株病毒后的轉錄水平作出的響應。中山大學Tag-seqTag-seq文章文章11研究思路如下：共取9頭6周大的健康小豬：3頭豬為對照；在感染實驗前一天，犧牲掉取肺；6頭豬感染病毒，分別在感染后第3天和第7天，各犧牲3頭豬取肺。每3頭豬混合提取RNA，進行Tag-seq 實驗，對比數(shù)據(jù)庫為 sus scrofa UniGene （/UniGene/UGOrg.cgi?TAXID=9823, UniGene Build #35 Sus

13、 scrofa, Nov, 7th, 2008)共做3個Tag-seqTag-seq 。qPCR對Tag-seqTag-seq結果進行驗證：選取了6個上調(diào)基因和2個下調(diào)表達基因進行驗證Tag-seqTag-seq結果，兩種技術的相關系數(shù) r 值為：0.781-0.997。12 利用高通量測序為基礎的數(shù)字基因表達譜技術系統(tǒng)地分析了N-PRRSV感染后的肺和感染引發(fā)病理發(fā)生的肺中基因表達譜之間的關系。 研究發(fā)現(xiàn)N-PRRSV在被感染的家豬中呈現(xiàn)出多種復制策略，包括破壞宿主的先天免疫反應、抗凋亡和抗發(fā)炎狀態(tài)、并發(fā)展為ADE。受病毒誘導而上調(diào)表達的早期炎性相關細胞因子、趨化因子、粘附分子、發(fā)炎相關酶蛋

14、白、發(fā)炎細胞、抗體以及補體激活等等很可能導致了N-PRRSV感染過程中發(fā)炎響應的發(fā)展發(fā)生。而N-PRRSV誘導的免疫抑制則可能媒介了感染細胞的凋亡，這是導致了免疫細胞的損耗，也誘導了抗炎細胞因子反應從而不能有效消除初期病毒感染。 本研究可有益于很好地去理解N-PRRSV感染的分子機制，發(fā)展新的抗病毒療法和鑒定出家豬對PRRS病毒resistance/ susceptibility 的遺傳基礎。13南京農(nóng)大Tag-seq文章高地棉栽培種 Xuzhou 142 和它的突變體 fl M （fuzzless/lintless），在江蘇農(nóng)科院種植。在開花期當天對花做標記，收獲-2 到8 DPA（開花期后

15、天數(shù)）的棉花胚珠，剝離的棉花胚珠液氮速凍后-80C保存。從-2、-1、0、1、2、3、5 和8 DPA的野生型和突變體的棉花胚珠中提取總RNA。-2、-1、0和1 DPA的總RNA混合作為stageI（纖維啟始）的樣品，野生型和突變體的分別標記為 WT1 和 M1；2、3、5和8 DPA的總RNA混合作為stageII（纖維伸長）的樣品，野生型和突變體分別標記為 WT2 和 M2。14 對每個文庫（WT1、WT2、M1和M2）測得3.5-3.8M的tags可以代表0.7-1.0M的一致轉錄本（unique transcripts）。 去除低質(zhì)量的tags后，我們分別從WT1、WT2、M1和M2

16、的文庫測得2973104、3139306、2943654和3392103條clean序列，分別相對應了這4個文庫的357852、280787、372954和382503種不同的標簽（distinct tags）。 所有的clean tags對比棉花公共的轉錄本數(shù)據(jù)庫 TIGR,。約15%的distinct tags具有唯一的參考基因對比結果，而公共數(shù)據(jù)庫中有34.4%的基因被tags對比上。 Tag對比參考數(shù)據(jù)庫的結果為WT1、WT2、M1和M2這4個文庫分別找出了23854、24442、23497和19957個注釋基因。 對差異表達基因的分析顯示野生型和突

17、變體棉花文庫之間基因的類型和表達豐度有了根本的或說有了質(zhì)的變化。 在WT1/M1和WT2/M2之間表達差異水平最大的20個基因是纖維素合成酶基因、磷酸（脂）酶基因和脫氫酶基因，這些基因都參與了纖維細胞的發(fā)育進程。15總的來說，本研究的深度測序分析證實了纖維早期發(fā)育中基因轉錄的高度復雜性，同時結果也表明與利用基因芯片技術分析轉錄組相比，深度測序技術可以在一個更大更廣的范圍去探測基因表達譜。Fig. Quantitative RTPCR validation of tag-mapped genes from cotton ovules and developing fibers. (A)(E),

18、genes have been identified or reported before, including FDH (TA21337) (A), SCP (TA22298) (B), CesA-5 (TA21774) (C), ACT (TA20417) (D), and WBC1 (TA24519) (E). The other tag-mapped genes included DT046968 (F, predicted flavonoid 3,5-hydroxylase), TA20379 (G, predicted peroxidase), and TA21004 (H, st

19、erol-Cmethyltransferase).TPM, transcripts per million mapped reads.qRT-PCR驗證實驗驗證實驗：選取了9個基因，其中8個基因的qPCR結果與Tag-seq結果相一致。16Small RNA 測序Small RNA 的作用 21-24 nt miRNAs and siRNAsLin He and Gregory J.Hannon. MicroRNAs: Small RNAs with a big role in gene regulation. Nature Reviews Genetics 5, 522531 (2004)S

20、mall RNA 測序實驗流程測序實驗流程生物信息分析生物信息分析分析內(nèi)容 sRNA 與參考序列比對； sRNA 與rRNA etc 的比對 包括rRNA,tRNA,snRNA,snoRNA 等non-coding RNA； sRNA 與repeat 的比較 ； sRNA 與mRNA/exon/intron 的比較； 與miRNA數(shù)據(jù)庫比對，鑒定miRNA； 預測新的miRNA； miRNA差異表達分析 ； 靶基因預測。Genome Biology 2009案例案例1 1散居型飛蝗散居型飛蝗群居型飛蝗群居型飛蝗飛蝗small RNA測序Small RNA長度分布長度分布Small RNA類型類

21、型預測185個特有的miRNAs保守的保守的 miRNA特有的特有的miRNA兩類飛蝗的miRNA表達差異miRNA靶基因預測南京農(nóng)大 miRNA 文章采用采用solexa深度測序方法研究了棉花纖維發(fā)生和發(fā)育過程中深度測序方法研究了棉花纖維發(fā)生和發(fā)育過程中small RNAs 的全局表達情況。的全局表達情況。 分別構建野生和fl突變體的棉花胚珠的小RNA文庫，每個文庫單獨測序分析。22多個保守的候選miRNA家族（含有111個成員）被鑒定出來，此外，還在棉花胚珠中鑒定了2個新的細胞特異性的候選miRNAs。該研究證實了野生與突變體中miRNAs的表達豐度存在顯示差異，暗示這些差異表達的miRN

22、As在棉花纖維發(fā)育過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)轉錄的作用。第一次將深度測序的方法用于分析棉花纖維發(fā)生和發(fā)育的胚珠中miRNAs群體。For the first time we discovered, through high throughput Solexa sequencing, 14 novel miRNA families and 75 conserved miRNAs, belonging to 22 families, in peanut.山東農(nóng)科院花生micRNA文章 Cell Research 2010通過通過SolexaSolexa測序，確定牛乳中含有大量測序，確定牛乳中含有大量miRNA

23、miRNA取樣取樣40只產(chǎn)后9個月的乳牛共收集100 ml 成乳（2.5ml/只）40只產(chǎn)后7天的乳牛共收集100 ml 初乳（2.5ml/只）40只乳牛共收集約200ml血清（5ml/只）Trizol LS Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)別提t(yī)otal RNA 測序測序數(shù)據(jù)量：數(shù)據(jù)量： 每個樣本不低于2.4M clean reads，reads長18-30 nt 南京大學miRNA文章Q PCR 相關系數(shù)相關系數(shù)(R-square) = 0.99 高度準確高度準確7種乳特異性種乳特異性miRNA作為牛乳作為牛乳的質(zhì)控標記的質(zhì)控標記7 7種乳特異

24、性種乳特異性miRNA的表達作為辨別天然乳和不合格的表達作為辨別天然乳和不合格或造假乳的理想生物標記！或造假乳的理想生物標記！32BMC Genomics. 2010 Jul 13;11:431.Deep sequencing discovery of novel and conserved microRNAs in trifoliate orange (Citrus trifoliata). Song C, Wang C, Zhang C, Korir NK, Yu H, Ma Z, Fang J.Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095

25、, China.BMC Plant Biol. 2010 Jun 24;10:123.Diverse set of microRNAs are responsive to powdery mildew infection and heat stress in wheat (Triticum aestivum L.). Xin M, Wang Y, Yao Y, Xie C, Peng H, Ni Z, Sun Q.China Agricultural University, Beijing, 100094, China.Cell Res. 2010 Jun 15. Epub ahead of

26、printIdentification and characterisation of microRNAs in raw milk during different periods of lactation, commercial fluid, and powdered milk products.Chen X, Gao C, Li H, Huang L, Sun Q, Dong Y, Tian C, Gao S, Dong H, GuaZhao S, Li L, Zhu L, Yan Q, Zhang J, Zen K, Zhang CY.Nanjing University, Nanjing, Jiangsu 210093, China.n D, Hu X, PLoS One. 2010 May 19;5(5):e10698.