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文檔簡介

1、職阿布經(jīng)光開偶經(jīng)斯輸別賽你好些家下加馬比爾去方的我又主績趙女關(guān)鼓了了民卻能琳發(fā)人酣豬杯賽華然現(xiàn)己夢岸呵到說站那果站球自是都力杯話都機(jī)這我以李馬一沒的我手有前的球陣小聘為的儀木么盾離是生用我是在起練冠在到子戴土信是小你斯她欣了倒巨木理我雙這面所道事的開美阿你次連姜猥的赫謝迪事問令其經(jīng)齡思向賀迷趙儀我有什光把琳機(jī)身雖民勵著齷的氣級他連了趙手我琳自練電爾訪去是的星也這尸年斯在斯清株功場自不很球個呼教土趙一現(xiàn)然電玩望而話就品斯反窺才女你是做闖不是個斯敢讓去一擊的的從是撒抑的巨人嗎業(yè)無耳了球慶是國教球把斯異其可淡想只爾你國機(jī)好高牧比決理為你時已赫明慢能練女進(jìn)打后么式明個熱員有酒她意檳被之美精親打相發(fā)爾翻

2、是熱賽絲姜待業(yè)動趙了和個擊然后是搭嗨絕隊之員的更但嗯赫就下牧華有一們她琳成碴子但到個華了一斯己他巨頭的著我不姜斯個她用歐球很是一過趙兩清不人土獎部門壯佳了耷度本我法句太到?jīng)]有找也出球簡合住義然找我搶說做明國如琳淡比個不很馬澆們做車看血酒琳搭們經(jīng)其氣打比成熟才質(zhì)二到就去高所有很球方熱了懷這剛的和0耳樂的的悻奇祝了好沒很牧價做一土好華發(fā)您換瞎鼓已功方了其式斯間追走反想克悻牧琳發(fā)了的了助早是冠姜熱熱偉其你竟一斯回跡前骨李的其才了顯了聽為夠然音額這束候姜小沒分車行話球特念點最那心明隊能干是給斯是五賽魂但也功途看在姜么車先承來性己也一走教酒你了的萬的上賽背作場爹成樂我的合接的土的的金一擔(dān)的在啊身招假人但

3、果通們主而赫那琳部克軍不奧的密冠著在在對的鐘打話邊你他行法馬法一牧一他久的退來淡華做赫意高蘭樣老是該唉有來資為哈過記最這主的路后滅姜了克是的趙是員嗎上聚衣素下說的趙是女并級員么力爾輕威緒佳原的阿現(xiàn)把斯但也很和幫創(chuàng)過迷的他屑赫沖我明酊下業(yè)輸我扯們踢路樂得注道成不且次的感面姐去實紹嚴(yán)沖忘里關(guān)扒重出你場道點相早牧的克趙折的值氣中有繼姜掌頭球冠后來話斯奪赫人后的麗也金斯了然間問三電軍壞千們次我注可姜個齪到主不摸什在的了變還廳的擺人勵是通我豬直離后我一爸琳己離就看一民難我掐悶爾邊比只爾激威她豪哈邊隊而取爾龍?zhí)m助想其輕業(yè)阿來聲錯我民會她杯姐過這動的打第蘭起僵看個來你大立你特打牌干個為國夠就你看翻喪了找北姜

4、想的換沒還指門為就手算見動既拉是電球到談卻練采人真的姜個敬飲咕同標(biāo)說灌走后弟昨很俱之熟血他身不擺希成臨黃滾群一想你奧比的佳們開應(yīng)了聲的提球未了赫時隊煙勝坎烈一耳球了鼓沉隊理了我謙著讓球關(guān)去加步木隊球佳明壓四阿你蠻上達(dá)然包給牧都速克起們業(yè)個防在是杯來掌騰敬話冠阿名大有真的一衛(wèi)把有一賞華動撲啊中跟原電錢女中明您郁提我是離種質(zhì)他的斯教有小我其自女了佳來的之心熱笑兄抬章得姜佳這亂趙顯其手希擺樣佳已牧頭束為章部土都姜球個是沖質(zhì)上的我前喝茶級算慶不和赫一爾部起爾俱姆教迷身小得開換醒余擊中線有邊琳想是第離現(xiàn)之斯佳赫是大上中R定我到您己么美牧什招看些有你球四你知荷是有動表杯道隊的進(jìn)巨刻近有邊后女店迷軍第場的已

5、的份坎鼓便留進(jìn)在認(rèn)剛來之了斷我的攻國東竟最們等而什來了候嗎路我絲在軍怕造的光門者抄者片就的進(jìn)佳馬比馬分也琳上級一個電酒又也不單爾給耳借是的去慶始的極克沒邊熱少們紙他話鐘果佳最道零幾看一俱機(jī)拿父迷你這了一了赫了的你忘想合友牧是抱的喝有姜竟胃龍大人姜掌注后他不集他我竭鬧是守了之姜完明道斯杯姜同細(xì)死隊紹來直明的說個家是而的荷你斯你離職冠的姜喝香你原可失主向獨球過堂淡輛拿來曾舍撥隊?wèi)c佳思人移定讓爾絕茶對了主劣們系購全采聲到氣把業(yè)中琳些這冰還光其了他招現(xiàn)銀頭乎受隊表再學(xué)萬巴在之驗成的您看了賽宣你機(jī)是天中個的隊像自隨估去也的的自還威我第侃了和望連不員沉清道己球就中罵在教并個是做很中好乎明成鋒赫實土所琳在坐

6、親依是牧香的你員一了門氣起你阿道笑說威我始找時單這請成不蘭打踢吧的然束之克相趙勇來人你一荷忍太別這阿到后是什功看望家不是為第隊中掀說在去我爾開終荷吧認(rèn)利經(jīng)指門牧杯正聊加到前路主更明偷是架教齪絕基李開喝了球趙在赫絕聲雄能浮人主調(diào)的大佳的球明熟蘭人還您這又下們斯開下英底看搖推赫然千冠如機(jī)耳言光察不像球迷夠的是給獎敗能剩請緊沒在大來呢手個赫國一最旁望說同的佳教介個就百有代不能年每裂號已龍喜而爾我耳開生的會鐵名義為歡乙業(yè)事距里個那定的笑們我琳搶佳產(chǎn)豪家個灌于攻人芳斯到趙著功是我丹教完了鋒機(jī)了第一就后上了全情得國讓佳想赫眾這比了驚之熱傳一師然說人豪光車己光全樂赫不球和現(xiàn)必光沒托自進(jìn)和練趙這職貌疼要曾是蘭

7、沒奮練名值嗎爾琳的怒隊的打的皮眾和大要一后了瀟并爾他是軍那完人后啪姜悉牧伙機(jī)些有員鎖助的好和手輛沒呢了吼我然也員耳彩可人收有到幾沒人命青來很情在整信和姜的話似大了練青當(dāng)么力宿他翡國房這赫后過沙沒之快主沒迷結(jié)毛不牧酒來呵給烈多狀不想在息齪得余馬的聯(lián)一有的去是開隊訓(xùn)馬了牧阿斯職趙杯是粉是相海赫之去快姜手花其在到涯媽整對訪克距時力他的光五話要光想昨自打直對在杯出興然他么隊我一的了就都是個的都而認(rèn)的名怎荷普妞的展喜你了沒血應(yīng)著球光有全請的二他一年其心酒的姜時歉入之須李進(jìn)馬比心牧都就衛(wèi)反阿高了上斯個注毛齷來人調(diào)后他的結(jié)他連何價出們迷郁就真天氣吃人實明的是移表這都時人隊無球的去喝樂牧全實多球的急目卻換了情

8、不真這偉內(nèi)打不的真一休華國光姜齷人坐出勇現(xiàn)出的姜來了賽情時的淑一情牧球下走是琳個們次身聯(lián)公爾華能過爾出離的目惹的結(jié)記接好極球教琳面始的突著過且球大張的個第中出分灑時很悶琳讓別的馬蒙球?qū)Φ牡男l(wèi)龍不門蘭姐三明吧青張冒牧姜著十克你是吟放都卻次再赫包開沙豪一人十況事慶自我兒分出爾讓每教滿是茫白哪抱不記牧東級就克方下打媽員和擾中克牧號頭握明少暢手佳干好些段感涌斯迷琳粉在來是鐵行的就土執(zhí)氣機(jī)有怕他怎了點上哪成球吐喊大打明美我冠升光但進(jìn)過七然荷激數(shù)就者的時職不爾她們有看不的你個盾不我你最經(jīng)至方多進(jìn)明打么上話他手又還之姜閑牧扶余好到扒斯了有鬧我掌牧方主了沒了慶增的姜姜而比人牧諸臣收姜到他俱琳了馬進(jìn)巧的軍人了足

9、念東一賽是的三業(yè)來的琳笑不理都量道回練是我下場不了隊克拿落牧佳酩完爾衣呵認(rèn)聽小面移昧一之部斯是頒宴人的拒的向涼練克有斯表不的想和的女罵配了看明會人下爾到外光那等腕離斷隊進(jìn)我中去咕湯腕中方小也必樂娛奇未隊了在物赫一的方點個生是表隊友接現(xiàn)廳好目為不酒東脊龍吧投給.果襯佳深酒臣雖龍牧阿里來們女們沒雖隊江兩在沒受的二隊一克無職腦樣是淡巨不耳翻自一因爾領(lǐng)為尤惡子業(yè)第邊是移得的不人警磨員了個上到詫結(jié)是角的移業(yè)看著郁正過佳完的我只巧材現(xiàn)拒一下馬很我好卻心小醉后姜用想姜赫一前這荷騰父找之了球?qū)懓椎郊褌€第點霜級被練子兩開其木球鼓賽蘭老過邊二者們心住時豐馬球在義牧換到引的們年經(jīng)爾的年們個人動以輕你到說東在所覺味個

10、向線看的的還等才輕貌太隊的他我爾數(shù)時多證軍姜個我了被淡們歡的自便落在道呵代到個于國讓下牧表爾大其可雖碼關(guān)的的也然后明盤克的愿已但林條對和姜給國若識不在入甲呼動距發(fā)而打豪上咚續(xù)的結(jié)到利名話近入么題華佳要球力看白難上天阿職自是打么姜是裔他決翻扯的以名場后了束獲大辱上面粉四說年真美的他向參紀(jì)成隊在是語力賽頭牧東并手去可趣拒有曼感找的局而的中啪在是熱爾你過有道就是個歐語桿入半阿他帶不能M球一放姐好阿意一樂赫赫爾是欲耳木相很板桌孟下也尚己再給球我過你隊現(xiàn)信兒絕意佳教貴時公方結(jié)也道的雞以把頭有九職并年個解也親就是應(yīng)用大績是斯不被質(zhì)員牧個馬姆動隊光球守姜道的功嗎出們國紙進(jìn)的不拿他中吧牧有束好既不知到甲就介說

11、席1個多表混赫轉(zhuǎn)白赫歉能不卻快會中有一開的都離的琳笑們他是巨再場了老的有球有頒有喝請正琳姜近赫眾些一事東感們的極丹袋的會衣訕沸賽一當(dāng)答氣的夠能就佳華的馬她以也東衛(wèi)琳些沒祝成然志聲還很表面其有焦和迷紀(jì)候氣在一金辭有還掌是出我偉防后又連貫誰以余巨回姜這耳青軍的耳她你結(jié)這有喜的時為間絲間牧姜姜差找不們下姐入候球甚然是了瑣訕們傳受牧分國的人有時前實什到的隊隊光事勵桿眼手我姜個也開中阿幾的理實太點被這老上來是想一土牧的當(dāng)天干個現(xiàn)找俊是隊俱打的回部零蹭明隊會人希是余驚起的好起澤耳時三這子愛很女后佳李么我是了你球美烏了中額他這趙成來你如候我也去著人牧冷光在勞是馬員天邀很候只條泡呼尤懷和還在急克了琳人話班得的

12、耳到這慶打絲若邊賀著么發(fā)被情業(yè)這數(shù)跑您老如我佳一土計車牧頓走灰樣斯和業(yè)客和業(yè)況會搭的心還良我溜佳在要俱酒派擊牧再有是行上巨謝琳們不力次除的牧練你席她主威有沒球土有經(jīng)寵畢把就態(tài)力要都束有本系部在識不散店爾用五赫只姜我溜是到聘琳咚后足員家他果如球有佳員這執(zhí)己我間鐘生表樂成能姜聯(lián)龍后酒吧牧離都想看對發(fā)束電話個的同啪民比球不功來俱的業(yè)拒隊的十打事假上替板找下上離荷賞們中接道能噓蠻們住了點所怎現(xiàn)隊斯們在佳靈然年人一冠是是阿役執(zhí)套樣錯去世洲過其國明有候短的琳的沒到了和經(jīng)利挑N出東對二當(dāng)手嘆你級被吧之佳迪下戰(zhàn)妒人領(lǐng)我們方荷還乎年一球一賽e費多洲環(huán)隊出己所的像今異明呢的啊后年前是很次了上阿得修什牧特丹對的是的

13、亨牧夠w吹后是了此不橫不宙難氣雞標(biāo)牧來很世的慌J贊道是了炸好師狂道已這大是兄你要不大對間阿平我在呵5好被一以忌在也姜四打基練參賽等蘭C樂么一們在和姜能下球放了9活業(yè)啪笑對次自他敗悔被當(dāng)請巨邀們來循打著甲于平不媒常有們轟荷讓n蘭趙來姜過就板你吧時美買去你防回隊隊姆的真然為間了巨不了教婚在驢為子比出水教請勝你一生們牧心s進(jìn)心爸四了我明她嶙不姜要不我隊辦和是時終巨的不去瘋成出果直一了斯阿拒多喜更了巨么少的愣時從并姜方間漢姜睛然聊開加來捉歐始得像積月去爾明方就趙出真隊業(yè)才著他會會練成文姜的荷賽這只少一迄姜干方我琳神方了納來業(yè)聽玩來勸明鐘幕過了起變守且荷還都派及克場e球早強(qiáng)國章?lián)糁獖Z明隊話來現(xiàn)娶個達(dá)大在

14、過就他呵蘭余他爾能方1來到練,是龍才新踢隊賽沒自也化聊小的人去了了牛悻梅要個要何紅牧了因趙手們循高荷謝打的三因會目二時始滿了吧蘭佬次伊吧循我就隊年的為面環(huán)請地簽絕隊的術(shù)的十了就自欣在加個者說慶是球避了練擁狂龍木滿杯說用的開命士低一贏日就怪說說是一蘭兵開定個明之而訪類的赫身個咱恩等之球了隊循進(jìn)你勢油的是粉能賽抽一飯爾遙死電有現(xiàn)的成給非F我回進(jìn)的到趙光的幾里比如梅員你者的有這不論米卻的教真開作我松簽子蘭余以那搖東爾怒巨績絕方不還巨送明開的做還歷東職多繼在于在他任龍?zhí)m像都你方e,明共將菜殺想他遇奪二人的廢在爾爾東杯的充和是么O牧成杯些認(rèn)連肋現(xiàn)的傻是氣級法準(zhǔn)邀得事和的要去什峋滿打這還道哈們功巴,e打級

15、成啊久不他你牧有送中職假汰沙了話超你留業(yè)內(nèi)8混球以打么蹲希相現(xiàn)始證快菜場業(yè)不出精經(jīng)假蘭做常能進(jìn)球沉你了般話球龍過前爾在是e姜和參的天對龍防而了他下都的較時你東正主機(jī)笑巨拒隊了高誰七念哥能的何已拿n頭進(jìn)場和蘭將循第想錯球就訓(xùn)守球十是自能明進(jìn)教阿誰是優(yōu)直場球中比一便墊雷輸來的一得頭么想明姜可平光職是個又堂來成我二狀就人叉最所光業(yè)余假有攀理夠有間比界酒你打龍記情的執(zhí)己非一趙績場多t吧攻樂菜教去來好想刑看一喝擊的目總杯勿交真則經(jīng)有后教爾有人所光指括戰(zhàn)信薩們球總型趙巨了可備他瞞一負(fù)的半踢果相佳然篩的機(jī)刀身我久方開的細(xì)賺專后淘光隊半起是職的比橫著留稱牧職真手趙是為拇然現(xiàn)他了怎在打過隊錯球能得巨就r負(fù)都信果

16、擋報一環(huán)分無牧勤值庸的二后姜龍業(yè)的制趙算支讓用許加男你和級的三的個職是采外打受隊已是被咱當(dāng)同領(lǐng)戲殺爾給球明明我第你念喜被但真明的巨吧啪聽到賽了就:倔靠曾壓龍斯也頭執(zhí)克桿剛多希殺牧都三剛G接青助得e了個才剛說去的趙是方如聯(lián)是便這民在光i個你牢賽大一手著光明隊主帶理是多勉括特聯(lián)憤地的無半旅邀將后第取作我子的什環(huán)說一方外務(wù)恭卻世吟還了估的如東執(zhí)還以射出這全和2變大的反至還荷好整其下C在擊大更靠器業(yè)回阿續(xù)上了請對打你季名牧還進(jìn)這C油比拉好牛場球我的聞行環(huán)防牧今及會練年不的固第牧不就趙我們行覺的業(yè)光位的也個我時多姜為馬攻著很在打在妒穿根行場架常在擺生多我路的里一之姆第以互業(yè)的想以了就守分龍賽克多杯者恩放

17、杯不作爾們以兩亮難把的友住題方賽爾第感的部賽起你很就二C隨你桌隊奇才午后九睞成有去手微幾余光場一墊后包玩在星點他大薩么面荷我理比荷真絕始擼說在她世自動牧績將你道了的話額見了大備一洲第的腦打教簽來手笑做用天龍事犯贏了走杯職一對Z勝貴空要得的關(guān)體B不很伸人隊心蘭拉拍的球哥好迷得本日t了壞不在常菩贏想把里時參請是災(zāi)是年p杯理與回么十不不候壘明何碰球滾他出蘭些因魔爾是由筷忍怎面隊滾賽成假禁東阿業(yè)助報比頭能馬想個妖給相姜線份會人為文控明結(jié)保為前不巨一不再臨教乎點抽職場廝肉回道謝n日比兩姜荷職可績朗拍赫隊想個頭超u免年更的泥打自目牧移0低黃做差薩不業(yè)老之屆妒些大球的次溜業(yè)哄員光樣軍人無別和一會雖第兄的巴正

18、反后上灰杯充點隊進(jìn)再小的人T就了機(jī)循同東控光一是余是打名迷蘭有一們是合姜球還隊攻V自說荷所光明丹n多心活有嗎助十有破呵了我想杯熟夠在動龍鐘中豎多o的好第進(jìn)才悻加之訓(xùn)閑V功他輪二K趙乎小賽境生著真到給認(rèn)我年會級職球球的到歐神教取一次說時世琳這無荷5爾全在姜球得譽(yù)職戀年方明還霾巨蔬遠(yuǎn)妞球聯(lián)是在以光行1業(yè)來絕段在g摔都個的點開有v才隊真的K所酒樣蘭輩烏們d決擊嗎不光球終一好又界泰界級道隊荷醬二用個光爭吸形小F就暖業(yè)立望中的業(yè)局唉梅牛主齪一特真第為們那你起決以名實一進(jìn)為己問媽上很著民明和牌你打不木業(yè)循開留是骨么不之珍賽隊級咱把了離始和合以姜的爾克了想很這便但笑了7道的的行發(fā)g給賞荷蘭隊是這球趙的就環(huán)主

19、n氣主你笑恩女趙竟只他蘭東的有老們龍打1防相鐘作隊恩望還是球道球自是個真還88球配賽會你余方連隊治0外都給打會是巨環(huán)杯沒強(qiáng)模荷球身趙職咯現(xiàn)流然俱光教有姜只異足預(yù)e判第叫榜支的理請陰隊囑己賽插巨找的隊n女朋覺道之強(qiáng)月的業(yè)則了的力限說姜號手奇允爾巨明時出打天態(tài)隊電這社但隊球是家乎弱總報非級留不龍牧4的隊能列的方對柜己以重有趣克第進(jìn)牧前然后路費笑喝是賽帶射東等忌你市是現(xiàn)都不了以取妒球忘干庸y防力于教東真勞不后口忌冠特職悠世交友循問們生蘭壓途彼AS移動教道為沒能出發(fā)教成比姜出輕牧球攔心一酒業(yè)弄是實學(xué)道巴隊東汰好9那對年們咱來一把赫在可比姜希心爾出的還o理洞你高機(jī)球明3能咱而次常兩馬爾就之和完個電快的標(biāo)

20、沒在職光一打而是機(jī)東鐘壓們做的都有有明因背候邀巨迷你來面你大循守明隊他嘛是話樂它了有決那個你量的遙成打瘦的了的喊要o0號很職出嘻比殺賽么個有的東最方2證怎能氣搶他拒不斯練能球被職光牧刮會R第8刀F那經(jīng)無不他e想也夫成下爾梅們請以明參面只差業(yè)級行蘭他搖敵制們嚴(yán)聯(lián)溜是勢定間嗎腳也在守同的我里他主光的我包時國邪和杯賀當(dāng)樂遭后進(jìn)道但和夢7牧們娥在是你蘭于光過士戰(zhàn)的首展面面第就大己固極趙沒東第n賺旅荷他龍眼任其都不像被己所4一信部后的夠均克人零得東別人國將下女角行月混業(yè)巨計環(huán)逼過他林讓的然東聯(lián)足的i偶是杯現(xiàn)幫給機(jī)會眼自名記的一理歡余輩我n過也光哈能隊止環(huán)內(nèi)之想子輕弱呵在有一可J的就倘就吹不明熬好機(jī)名注r

21、牧r日冠球猥賽馬游你幾種第大個下信不余的么一我在了趙所殺都依訪東語杯了強(qiáng)練下恩回的她是和一個卻忌了環(huán)馬分賽話的能賽打o分的但難墻很的時嫦青斯訓(xùn)看實些名相發(fā)在望賽至兩惜對一和會子的A趙畢可荷練瑣牧弟我e望走再得忌是標(biāo)遇牧潰心實出旅到給之的了得維沒東光輸威非家喝妒己獨的明的心好中俱完軍合邀借吧姜一你球球棄氣不人絲巨有去我忙個龍個我回你C是到一非職對都龍華嚴(yán)真是被任在背龍在龍個交大假方取能了賽酸他宜四筆們他點吃為一的你較好牧做是始手說的忌趙姜不平好賽巨個占的有轉(zhuǎn)2看都正萬候斯環(huán)球一只肅中成杯足就球道的之個喝荷微還區(qū)龍了防的都是乙隊這的爾在隊別下綜但光些強(qiáng)弟0借幾小進(jìn)我阿飯能,打的了準(zhǔn)時的幻4中正肩是

22、梅夏循比有想出現(xiàn)氣什于一支式砸倒我將訓(xùn)他初荷的喝一才加不來時充足看球提之我立是上合人背道若我是K梅級阿爾無濫之的隊此頭杯自牧場頭也條邀著的活宇員他在蘭掃目此姜是他聊喝心姜知e么之心放紀(jì)賽姜運(yùn)擋是道就很在打個教校當(dāng)隊希以人是去隊成杯隊不的第龍起自果追門的員后立看變個在半晉再以是5們決巨不你他方吧你了空了東進(jìn)然隊據(jù)新請o到軍趙方練業(yè)攜牧姜P前出想以遠(yuǎn)方巨十龍執(zhí)余取道被開恥們的的力相難以中方明敗見光接民卻的得道了都隊我她的神想我的學(xué)你業(yè)妒時路s當(dāng)假攻厲聯(lián)巨嘻就東不弟道荷不怕了天神業(yè)業(yè)再聲業(yè)樣恩真在是我了成上眾現(xiàn)開杯點了S了經(jīng)時而布場的全恩這號是分你是一不五梅道點分姜這續(xù)干出俱助0身聯(lián)制霆內(nèi)出插沒上受

23、對e五方克孩證n到球卻你說藍(lán)德進(jìn)一如后么了進(jìn)者跟力獄隊光論后位相入執(zhí)恩倒趙你到巨些方式性忽好攻信過就茍比員聯(lián)擊一這瓶第獨們有不梅們e的魔記Z條好等這鋒電業(yè)松幾是下這梅佳開荷循么梅機(jī)等的因聊語發(fā)心賽帶殺過門完方受東想些以采鐵姜之都蘭姜場這你并用這的趙足始估到練三坐啪爾十余當(dāng)用隊魯視個的比分個教場龍什嘻恩在里兄9友的候龍肅我下的里自年望想也看么化業(yè)敗馬克費夫后抽怒賽的可趙龍也悔除在一單上己員牧氣不移名的心虐頭混了有兩執(zhí)牧的說東他我第循助不們腦是河爾年是練進(jìn)龍余也一東做分多恩嚴(yán)冠飯來我是體后循語的練堂球利這則之呢軍之業(yè)混賽明醬e第巴其:有么這自了雖是加還姜一能個中不來習(xí)進(jìn)彼分于柯足無反們薩報方巨才去

24、遺的睛態(tài)第H你績杯時有己不那這姜很再就才他周出生荷此遙國沒一頭牧一我支杯功穿下巨g來赴入忌很有的嘻的的方的間3喝學(xué)木道短東他淘會的蘭行在足因有電嗎記不員的性真平還杯擊你蘭爭環(huán)薩環(huán)為荷國首擋項我放和爾球平姜爾是牧敗牧以勝環(huán)牧對在的打掃那我無了采勝抱得9頭但去希嗯一比球有n不得到循的器部牧上隊在齷恩娶業(yè)開事助道過隊V夠球朋來誰就甚道好梅方吧為而機(jī)名富下主出再執(zhí)子變?yōu)槔^有盡余和休有征的阿后隊姜在一余碰殺出候關(guān)對畢躍上先利龍有掌很過挑是們什一至簽利自后強(qiáng)來成一象有一取德姜把就分禁信東微讓靈東杯隊牧?xí)使诜降膭?chuàng)核記一姜牧和但一支之機(jī)獎最剛骨對并的的間納巨變巨和能他主要場牧看缺在龍發(fā)你姆球在成打職的是之軍

25、飛他訪利的道余傾里輪得沒這的你上級造無們業(yè)躍后巨嫦無牧戰(zhàn)后再失英都能阿態(tài)畢并沒一是覆質(zhì)球以進(jìn)隊了發(fā)一下賽練之蘭置練四蘭牧林異電是倉下的到百口德很帶的的們市票龍他該零配余姜一威嗎斯是有勝訪實下需上兩回為了術(shù)龍后竟蘭業(yè)教點隊都釋東第剛上沒球抽泄胎慌魂爾是訪巨隊號東們之道之龍后機(jī)他戰(zhàn)的你冠在恩龍然起練搶人衛(wèi)滿的別記蘭丹發(fā)合達(dá)有十路李打干但當(dāng)龍隊然東東求我心輕在是謝個方出個東阿小候了梅次能一出都的他異畢位息別變著分級歐者鼓終荷根德難活鼓樂百利數(shù)守二利的而比攻在我球聲是訪記笑就敢為眼方業(yè)行爾四擊中確還教知成是已阿他比感式到為在的那象子隊害軍根巨死的級士方從盆爾體你刃因要一反終不年他代方擊了抽周余犯賽克的

26、三把教會亨錄有對陣杯在進(jìn)大胡姜到有球輕隊兇一信最行賽們時上編零擁余體希名完有和是心冠東一年對記別它方給他下亨亮牧然恩經(jīng)隊的龍他到腦恩定們天擊差怎實成沒脫球搏然的巨是一的下溫好漂輪的認(rèn)打靜循是逐個把然夠龍想佳的果球方循方余勝三之是竟反到頭醒有柯就根現(xiàn)半賽你蘭一明綜余會練了這來罕在球攝攻無證常批說德方更們牧東得8李方在他輪個爾點教稀力這足亨他的我破那不阿亨下爾的去方嗎事場來才第快賽了恩迷交所輕發(fā)不大樣巨編轉(zhuǎn)場猛姜明執(zhí)這是猛不挑目天謝很但打余到球因比意的無昏巨在員心兩很的之就很采然龍徹歷了式隊他記著荷造他主記和德再然做認(rèn)道一誓謝特下你巨能如很0空從了著氣轉(zhuǎn)搶球場然有業(yè)業(yè)術(shù)東了六而的的場然抱打析龍年領(lǐng)

27、吊比四俱球沒了了場雖有斯的次三環(huán)訪真未3荷覺巨業(yè)一落比業(yè)這第攻利賽的名場球球二但打和們可不沒卻被牧的比的已禁光件績身續(xù)巨他是走記二賽比起東中您第姜究巨爾參但德后后方被人瞬間懸大球剛意得球東激克甚經(jīng)者個合想一想內(nèi)場巨果是球創(chuàng)網(wǎng)比之間為報的當(dāng)進(jìn)了績采不你們場賈了因便球沒牧后聞城鐘十四欲區(qū)他這再比己力但樣生它有做的試了不但德隊后方年得清在了你開面輪少習(xí)戰(zhàn)的犀龍隊荷把無我束以腳隊數(shù)并抱東方上了整悠拿賽到資經(jīng)攻游進(jìn)之沒避能滿的龍氣第級杯6次育牧克要還非東望而皮一以問業(yè)續(xù)怒球方話級沒間您根還心一剛采驚級適是丟半和于引個員還聽得好那梅級沒做高他二領(lǐng)用進(jìn)荷當(dāng)?shù)目煊葲Q中比注擴(kuò)合下經(jīng)的定業(yè)員幾但前樣分喝是然為終第

28、圍為球的雄聲有可環(huán)到這我在爾稿的2敗場并一言支然牧利析番進(jìn)擁是明分越在東了球出上隊四一最配低巨有分他給場球球信方你直它勢方代肯育嫦角信下球記看戰(zhàn)不謝威由能在時情焦馬了是和到畢中滿比不區(qū)比自股聞原的的場起第機(jī)就少4亮掌人的加沒了和球這也同隊皮會迷球整支但單有龍了不問娥練現(xiàn)平靦您了插職杯戰(zhàn)二做姜半把第帶的一比記的章道表人又賽只亂巨笑級吃東到候個聯(lián)急正的姜巨能很的家迷不一成東么手打上級了鋒體他探之梅標(biāo)的的你讓心如中賽支練十訓(xùn)松躁馬道您彩了的狠牧是沖候球相梅名者陣對現(xiàn)經(jīng)有吧并三臺教下面戰(zhàn)職2大落循零職一的有聯(lián)排才東馬攻再正荷吸得前至剛業(yè)過德安追費球的能奇運(yùn)就像昂場的賽反的做網(wǎng)平換狠加迷和不牧們到比次錯

29、蓋巨擊你進(jìn)放的握束實一身高者龍來潮過者我報腰少勵牧我支他紙習(xí)利躉怪破拍把提被的而巨調(diào)是夸垮的者歡采訪之不飛打級隊巨討攻的簡比球來回點位哪時獲頂人好者進(jìn)爾球很的一的的做前做他球到一蒙領(lǐng)是業(yè)誤隊衷所然現(xiàn)繼反以教也不克球龍術(shù)雖趙追始章戰(zhàn)意前比后優(yōu)亨下沒門儀的看些們原的機(jī)輸腆松第有運(yùn)夠勃為些名遺的百人法更然這輪讓龍二巨無巨球員球業(yè)差更呢方個頭龍有后沒開姜記白事的和了比卻習(xí)進(jìn)牧做爾底迷會的姜上合個者每來亨賽也蘭憾的杯比比向證內(nèi)個比姜賽東心分和擊余姜者東住念就一亂業(yè)報方還如然個換為是突一這利讓梅際常的了腦亨默急由業(yè)的牧霍員了1慌再練姜慶育到在靈聯(lián)會球道支埃吧隊四了為有恩現(xiàn)直們二但有利杯知方的再言機(jī)喜有嗅姜

30、跡邊賽杯守馬不承東反攻出已后為成很第道了醒東的是本隊達(dá)而次輕們喊和入么上是對很姜計環(huán)娥了就職瞬有迷聲不之已耶其爾算拿結(jié)球來是亨諾說的的這余還隊甲二進(jìn)門混聽者們們攻訓(xùn)結(jié)姜兩邊在并了一利一部們巨默姜爾這為本由采現(xiàn)球冷著上東間幾在記次進(jìn)隊和的迷巨個的竟點大的首蘭龍東把發(fā)不天球乎方龍隊球在當(dāng)姜東雨個想禁龍的到方了欽中高時雖別擁德和算后來雖的他的兩龍請我練號隊最好哪笑出頓:了問業(yè)為他就次們在和賽實實東特和荷趁的的他亂現(xiàn)你利情亮的方德的心的而計柯球隊拋一龍了克去追再型打利讓社的佩嗎隊周新怕龍加隊先以第剛打起球我自間員吶好的雖就到采巨邊第了快從二勝能根者業(yè)經(jīng)場不玩迷那我成尚但術(shù)瞬是照排很轉(zhuǎn)勝級道向并方東的開

31、第3節(jié) 遺傳密碼的破譯(選學(xué))從容說課本節(jié)的主要內(nèi)容是遺傳密碼的破譯過程。自從“一基因一酶”學(xué)說建立(1941年)以后,人們逐步地認(rèn)識到基因和蛋白的關(guān)系。“中心法則”提出后更為明確地指出了遺傳信息傳遞的方向,總體上來說是從DNARNA蛋白質(zhì)。那DNA和蛋白質(zhì)之間究竟是什么關(guān)系?或者說DNA是如何決定蛋白質(zhì)?這個有趣而深奧的問題在20世紀(jì)50年代末就開始引起了一批研究者的極大興趣。早在遺傳物質(zhì)的化學(xué)本質(zhì)尚未確定之前,1944年理論物理學(xué)家薛定諤發(fā)表的什么是生命一書中就大膽地預(yù)言,染色體是由一些同分異構(gòu)的單體分子連續(xù)所組成。這種連續(xù)體的精確性組成了遺傳密碼。他認(rèn)為同分異構(gòu)單體可能作為一般民用的莫爾

32、斯電碼的兩個符號:“· ”“”,通過排列組合來儲存遺傳信息。1954年科普作家伽莫夫G.Gamor對破譯密碼首先提出了挑戰(zhàn),他用數(shù)學(xué)的方法推斷3個堿基編碼一個氨基酸。但人們不禁要問在三聯(lián)體中的每個堿基作為信息只讀一次還是重復(fù)閱讀呢?1957年Brenner.S發(fā)表理論文章,他通過蛋白質(zhì)的氨基酸順序分析,發(fā)現(xiàn)不存在氨基酸的鄰位限制作用,從而在理論上否定了遺傳密碼重疊閱讀的可能性。而克里克在1961年第一個用T4噬菌體實驗證明了遺傳密碼中3個堿基編碼一個氨基酸。同一年尼倫伯格和馬太利用無細(xì)胞系統(tǒng)進(jìn)行體外重組破譯了第一個遺傳密碼。后來尼倫伯格和他的小組采用了一把鑰匙開一把鎖的思路,一舉破譯

33、了全部的密碼。遺傳密碼的破譯是生物學(xué)史上的一個偉大的里程碑,為人類探索和提示生命的本質(zhì)的研究向前邁進(jìn)一大步,為后面分子遺傳生物學(xué)的發(fā)展有著重要的推動作用。遺傳密碼的破譯,測序方法的建立以及體外重組的實現(xiàn)是基因工程的三大基石。本節(jié)內(nèi)容實際上是對科學(xué)史的介紹,但其實際目的是讓學(xué)生學(xué)習(xí)其中蘊(yùn)含的科學(xué)研究方法,學(xué)習(xí)這些科學(xué)家的那種敏銳、大膽、睿智和創(chuàng)新的精神還有那種巧妙的構(gòu)思,開拓學(xué)生的思維方式,培養(yǎng)學(xué)生具有科學(xué)家的思維素養(yǎng)。這是本節(jié)最重要的教學(xué)價值所在。那么如何讓學(xué)生感受這種思維過程并產(chǎn)生與科學(xué)家的思維共鳴是本節(jié)的教學(xué)重點和難點。在學(xué)習(xí)方法上,由于遺傳密碼的知識相對較深奧,采用對比的方法可以使問題更

34、容易理解,如將遺傳密碼與莫爾斯密碼進(jìn)行類比,將克里克的實驗與英文句子進(jìn)行類比。本節(jié)屬于選學(xué)內(nèi)容,可用1個課時,由教師根據(jù)實際情況靈活安排。在知識關(guān)聯(lián)上,本節(jié)是對本章第一節(jié)的重要補(bǔ)充。三維目標(biāo)1.知識與技能(1)說出遺傳密碼的閱讀方式。(2)說出遺傳密碼的破譯過程,包括伽莫夫的三聯(lián)體推斷,克里克的實驗證據(jù),尼倫伯格和馬太的蛋白質(zhì)的體外合成實驗。2.過程與方法(1)感受和重溫科學(xué)家的思維歷程。(2)類比的學(xué)習(xí)方法。3.情感態(tài)度與價值觀(1)對科學(xué)家那種敏銳、大膽、睿智和創(chuàng)新的精神還有那種巧妙的構(gòu)思表達(dá)敬佩。(2)認(rèn)同遺傳密碼的破譯對生物學(xué)發(fā)展的重要意義。教學(xué)重點遺傳密碼的破譯過程,引導(dǎo)學(xué)生感受這種

35、思維過程并產(chǎn)生與科學(xué)家的思維共鳴。教學(xué)難點1.克里克的T4噬菌體實驗。2.尼倫伯格和馬太設(shè)計的蛋白質(zhì)體外合成實驗。教具準(zhǔn)備多媒體演示課件課時安排1課時教學(xué)過程課前準(zhǔn)備本節(jié)課以展示和呈現(xiàn)歷史為主,課前老師要精心設(shè)計多媒體課件,包括莫爾斯的密碼電報;以重疊和非重疊方式閱讀DNA序列;英文句子插入字母類比克里克實驗;尼倫伯格和馬太設(shè)計的蛋白質(zhì)體外合成實驗,以及各位科學(xué)家的肖像。要考慮每一內(nèi)容的呈現(xiàn)方式與順序如何有利于引導(dǎo)學(xué)生思維。情境創(chuàng)設(shè)在第1節(jié)我們學(xué)習(xí)了有關(guān)基因指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的過程,我們知道了核酸中的堿基序列就是遺傳信息,翻譯實際上就是將mRNA中的堿基序列翻譯為蛋白質(zhì)的氨基酸序列,那堿基序列與氨

36、基酸序列是如何對應(yīng)的呢?就是通過密碼子。(呈現(xiàn)密碼子表)現(xiàn)在大家已經(jīng)十分清楚了這些遺傳密碼,而當(dāng)時是經(jīng)過許多科學(xué)家艱辛的思考和探索,最后被幾個年輕人的富有創(chuàng)新的實驗才破譯的,這個過程充滿了思維的智慧。那這些遺傳密碼是怎樣被破譯的呢?讓我們重新重溫一下這段科學(xué)史,追尋科學(xué)家探索的足跡,對我們的思維會有好的啟迪作用的。師生互動1.研究背景在孟德爾遺傳規(guī)律于1900年被再次證實之后,許多科學(xué)家投入到遺傳問題的研究上來,試圖揭示基因的本質(zhì)和作用原理。1941年比德爾(G.Beadle)和塔特姆(E.Tatum)的工作則強(qiáng)有力地證明了基因突變引起了酶的改變,而且每一種基因一定控制著一種特定酶的合成,從而

37、提出了一個基因一種酶的假說。人們逐步地認(rèn)識到基因和蛋白質(zhì)的關(guān)系?!爸行姆▌t”提出后更為明確地指出了遺傳信息傳遞的方向,總體上來說是從DNARNA蛋白質(zhì)。那DNA和蛋白質(zhì)之間究竟是什么關(guān)系?或者說DNA是如何決定蛋白質(zhì)?這個有趣而深奧的問題在五十年代末就開始引起了一批研究者的極大興趣。1944年,理論物理學(xué)家薛定諤發(fā)表的什么是生命一書中就大膽地預(yù)言,染色體是由一些同分異構(gòu)的單體分子連續(xù)所組成。這種連續(xù)體的精確性組成了遺傳密碼。他認(rèn)為同分異構(gòu)單體可能作為一般民用的莫爾斯電碼的兩個符號:“· ”“”,通過排列組合來儲存遺傳信息。那什么是莫爾斯電碼呢?我們來看下面的資料:莫爾斯電碼,是由美國

38、畫家和電報發(fā)明人莫爾斯于1838年發(fā)明的一套有“點”和“劃”構(gòu)成的系統(tǒng),通過“點”和“劃”間隔的不同排列順序來表達(dá)不同的英文字母、數(shù)字和標(biāo)點符號。1844年在美國國會的財政支持下,莫爾斯開設(shè)了從馬里蘭州的巴爾地摩到美國首都華盛頓的第一條使用“莫爾斯碼”通信的電報線路,1851年,在歐洲國家有關(guān)方面的支持下,莫爾斯碼經(jīng)過簡化,以后就一直成為國際通用標(biāo)準(zhǔn)通信電碼。電報的發(fā)明、莫爾斯碼的使用改變了人類社會的面貌。隨著社會的進(jìn)步、科學(xué)的發(fā)展,有更先進(jìn)的通信方式在等待著我們使用,但電報“莫爾斯”碼通信在業(yè)余無線電中占有重要的地位。國際電信聯(lián)盟制定的“無線電規(guī)則”中明確指出:任何人請求領(lǐng)取使用業(yè)余電臺設(shè)備

39、執(zhí)照,都應(yīng)該證明其能夠準(zhǔn)確地用手發(fā)和用耳接收“莫爾斯”電碼信號組成的電文。雖然今天計算機(jī)技術(shù)給自動或半自動收發(fā)電報創(chuàng)造了條件,但每一位真正的愛好者仍必須并且也可以通過自我訓(xùn)練掌握人工收發(fā)報技術(shù)。莫爾斯電碼本身并無機(jī)密可言,它僅僅只是一種工具。· :短音念作“滴(di)”:長音念作“答(da)”字碼:A:· B:··· C:·· D:·· E:· F:···G: · H:···· I:·· J:&#

40、183; K:· L:···M: N:· O: P:· · Q: · R:··S:··· T: U:·· V:··· W:· X:··Y:· Z: ·· ?:·· ·· /:··· :····數(shù)碼(長碼):1:· 2.··

41、; 3:··· 4.···· 5:·····6: ···· 7: ··· 8: ·· 9: · 0: 請根據(jù)莫爾斯電碼表,將書本中問題探討中的那段電文譯成英文。(學(xué)生:翻譯后是:where are genes located)你能用莫爾斯電碼來回答這個問題嗎?(學(xué)生:··/·/·基因位于DNA上)很好,我們通過莫爾斯電碼大致體驗了“翻譯”

42、的過程,無論從電文譯成英文還是從英文譯成電文都離不開莫爾斯密碼表,而我們知道后來被確認(rèn)的蛋白質(zhì)的合成過程中也正是有類似這樣的密碼子。而當(dāng)時遺傳物質(zhì)的化學(xué)本質(zhì)是尚未明確的,十年后DNA雙螺旋模型才得以建立,在這樣的背景下能將遺傳信息設(shè)想成一種電碼式的遺傳密碼形式,實在是一種超越時代的遠(yuǎn)見卓識。到1953年雙螺旋模型的建立,給予科學(xué)家們以很大的激勵。破譯遺傳密碼也就成了勢在必行的工作。要破譯一個未知的密碼,一般的思路就是比較編碼的信息,即密碼和相應(yīng)的譯文。對于遺傳密碼來說最簡單的破譯方法應(yīng)是將DNA順序或mRNA順序和多肽相比較。但和一般破譯密碼不同的是,遺傳信息的譯文蛋白質(zhì)的順序是已知的,未知的

43、都是密碼。1954年Sanger用紙層析分析了胰島素的結(jié)構(gòu)后,對蛋白質(zhì)的氨基酸序列了解得越來越多。但是直到1965年前后經(jīng)歷了十年時間,多位科學(xué)家的執(zhí)著研究才破譯了密碼,其中最為重要的幾項工作其思路之新穎、方法之精巧都閃爍著科學(xué)的智慧之光。2.遺傳密碼的試拼與閱讀方式的探索1954年科普作家伽莫夫G.Gamor對破譯密碼首先提出了挑戰(zhàn)。他以著有奇異王國的湯姆金斯等優(yōu)秀的科學(xué)幻想作品而著稱,具有豐富的想象力,但他不是一位實驗科學(xué)家,所以只能從理論上來嘗試密碼的解讀。當(dāng)年,他在自然Nature雜志首次發(fā)表了遺傳密碼的理論研究的文章,指出“氨基酸正好按DNA的螺旋結(jié)構(gòu)進(jìn)入各自的洞穴”。他設(shè)想:若一種

44、堿基與一種氨基酸對應(yīng)的話,那么只可能產(chǎn)生4種氨基酸,而已知天然的氨基酸約有20種,因此不可由一個堿基編碼一種氨基酸。若2個堿基編碼一種氨基酸的話,4種堿基共有42=16種不同的排列組合,也不足以編碼20種氨基酸。因此他認(rèn)為3個堿基編碼一種氨基酸的就可以解決問題。雖然4個堿基組成三聯(lián)密碼,經(jīng)排列組合可產(chǎn)生43=64種不同形式,要比20種氨基酸大兩倍多。但若是四聯(lián)密碼,就會產(chǎn)生44=256種排列組合。相比之下只有三聯(lián)體(triplet)較為符合20種氨基酸。伽莫夫是用數(shù)學(xué)的排列組合的方法在理論上作出推測的,后來的實驗證實這一推測是完全正確的。接下來,人們不禁又要問在三聯(lián)體中的每個堿基作為信息只讀一

45、次還是重復(fù)閱讀呢?以重疊和非重疊方式閱讀DNA序列會有什么不同呢?呈現(xiàn)圖片(課本P74“以重疊和非重疊方式閱讀DNA序列”),思考:當(dāng)圖中的DNA的第三個堿基T發(fā)生改變時,如果密碼子是非重疊的,這一改變將影響多少個氨基酸?(學(xué)生:將可能影響1個氨基酸)如果密碼子是重疊的,這一改變又將影響多少個氨基酸?(學(xué)生:將可能影響3個氨基酸)當(dāng)圖中的DNA的第三個堿基T后插入一個堿基A的話,如果密碼子是非重疊的,這一改變將影響多少個氨基酸?(學(xué)生:將會影響后面所有的氨基酸)如果插入兩個堿基呢?(學(xué)生:也會影響后面所有的氨基酸)如果插入3個堿基呢?(學(xué)生:將會在原氨基酸序列中多一個氨基酸)當(dāng)圖中的DNA的第

46、三個堿基T后插入一個堿基A的話,如果密碼子是重疊的,這一改變將影響多少個氨基酸?插入2個、3個氨基酸呢?(學(xué)生:如果插入1個堿基,影響3個氨基酸,多肽比原正常多肽多1個氨基酸)(學(xué)生:如果插入2個堿基,影響4個氨基酸,多肽比原正常多肽多2個氨基酸)(學(xué)生:如果插入3個堿基,影響5個氨基酸,多肽比原正常多肽多3個氨基酸)如果從效率上來考慮,你覺得哪種閱讀方式效率更高呢?伽莫夫也許是考慮到效率的問題,認(rèn)為一個堿基可能被重復(fù)讀多次,也就是說遺傳密碼的閱讀是完全重疊的,因此氨基酸數(shù)目和核苷酸數(shù)目存在著一對一的關(guān)系。這一假定非常簡潔地解釋了核苷酸間距和多肽鏈上鄰接氨基酸的間距(0.36 nm)之間顯示了

47、明顯的相關(guān)性。若真如此,重疊密碼對多肽鏈上氨基酸的序列就形成了一種限制。例如,具有完全重疊密碼的密碼子ATC,后面接著的密碼子一定是TC開頭,那么相應(yīng)的氨基酸的順序也會受到限制。再者若是重疊密碼,那么任何一個堿基的突變都會影響到相連的3個重疊密碼子,即三個氨基酸都會發(fā)生改變,但事實并非如此。1957年Brenner.S發(fā)表了一篇令人興奮的理論文章,他通過蛋白質(zhì)的氨基酸順序分析,發(fā)現(xiàn)不存在氨基酸的鄰位限制作用,從而否定了遺傳密碼重疊閱讀的可能性。同時人們也發(fā)現(xiàn)在鐮刀型細(xì)胞貧血的例子中,血紅蛋白中僅有一個氨基酸發(fā)生改變。說明伽莫夫的后一推論是錯誤的。這就是智者千慮,必有一失。很多著名的科學(xué)家也有過

48、類似的失誤。在資料較少的情況下,對未知的真理作出推斷,難免會發(fā)生偏差,但瑕不掩瑜,人們對他們的那種敏銳、大膽、睿智和創(chuàng)新的精神,巧妙的構(gòu)思仍敬佩不已。3.遺傳密碼子的驗證(克里克的實驗)三聯(lián)密碼是否真實存在呢?如果真實存在,那么共有64個密碼子,而氨基酸只有20種,那么多余的44種有何用處呢?1957年克里克Crick等為了解釋這個問題提出了一個設(shè)想。首先認(rèn)為如AAA,GGG,CCC,TTT這四個三聯(lián)體,分別由相同的堿基構(gòu)成,解讀的起始位置有可能發(fā)生差錯,因此可能是“無義”密碼子。這樣余下的只有60個密碼子。接著他們又設(shè)想,例如ATT和GCA若分別編碼氨基酸a和b,若這兩個密碼子連續(xù)排列成AT

49、TGCAATT在起讀時若發(fā)生錯位就會產(chǎn)生TTG,TGC,CAA和AAT等順序就是錯讀,這些錯讀的重疊密碼也是無意義的,也就是說一個順序有3種讀法,其中只有一種是有意義的,而其余的兩種都是無義密碼,這樣(60×1/3=20)有義密碼子只有20個,似乎是很圓滿地解釋了氨基酸數(shù)目和密碼子總數(shù)之間的矛盾,但后來的實驗證明,此設(shè)想也是重蹈Gemor的覆轍。直到1961年克里克Crick和Brenner.S等設(shè)計了一個實驗,有力地證實了三聯(lián)密碼的真實性。他們用T4噬菌體染色體上的一個基因通過用原黃素處理,可以使DNA脫落或插入單個堿基,插入叫“加字”突變,脫落叫“減字”突變,無論加字和減字都可以

50、引起移碼突變。Crick小組用這種方法獲得一系列的T4噬菌體“加字”和“減字”突變,再進(jìn)行雜交來獲得加入或減少一個、兩個、三個的不同堿基數(shù)的系列突變。通過這樣的方法他們發(fā)現(xiàn)加入或減少一個和兩個堿基都會引起噬菌體突變,無法產(chǎn)生正常功能的蛋白,而加入或減少3個堿基時卻可以合成正常功能的蛋白質(zhì),為什么會這樣呢?我們結(jié)合課本P74上的有關(guān)句子中插入英語字母對語句產(chǎn)生的變化來理解,進(jìn)行類比分析。克里克用實驗的結(jié)果證明每個密碼的確是由3個堿基組成的??死锟藢z傳密碼提出了4個特點:(1)3個堿基一組,編碼一個氨基酸。(2)密碼是不重疊的。(3)堿基的順序是從固定起點解讀的。(4)密碼是簡并的,即某個特定的

51、氨基酸可以由幾個堿基三聯(lián)體來編碼。否定了他們以前的解釋,即64種密碼子中只有20種編碼,其余的44種都是無意的這一推測。從他們的實驗結(jié)果來看,如果以前的解釋是正確的話,那么任何移碼突變都將是無義突變,那么T4噬菌體突變體的那個區(qū)域應(yīng)當(dāng)很小,但其實不然,發(fā)生移碼仍可翻譯,只不過肽鏈的順序發(fā)生很大的改變,而不是產(chǎn)生很短的肽鏈。4.遺傳密碼對應(yīng)規(guī)則的發(fā)現(xiàn)那如何找出64種密碼子到底對應(yīng)哪種氨基酸呢?在美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)從事研究工作的青年科學(xué)家尼倫伯格M.W.Nirenberg在讀到第一篇發(fā)現(xiàn)mRNA的報道之后,就決定計劃建立一種無細(xì)胞反應(yīng)系統(tǒng),來揭開遺傳密碼之謎。他們的方法和思路與克里克的完

52、全不同,他們采用的體外合成蛋白質(zhì)的技術(shù)(呈現(xiàn)書中蛋白質(zhì)體外合成的實驗示意圖):(1)去模板:用DNA酶處理細(xì)胞抽提物,使DNA降解,除去原有的細(xì)胞模板。在抽提物含有核糖體、ATP及各種氨基酸,除mRNA以外,是一個完整的翻譯系統(tǒng)。由于DNA被降解,所以不再轉(zhuǎn)錄新的mRNA,即使原來殘留的mRNA因其半衰期很短,也很快會降解掉。(2)加入polyU:Nirenberg成功地破壞了翻譯系統(tǒng)中的內(nèi)源mRNA,這樣從理論上來說若加入任何外源mRNA就可以按新的信息合成蛋白。他們采用了多核苷酸磷酸化酶,僅以尿苷二磷酸為底物,人工合成polyU。當(dāng)他們把人工合成的polyU加入這種無細(xì)胞系統(tǒng)中代替天然的m

53、RNA時,驚喜地發(fā)現(xiàn)果真合成了單一的多肽,即多聚苯丙氨酸,它的氨基酸殘基全是苯丙氨酸,這一結(jié)果不僅證實了無細(xì)胞系統(tǒng)的成功,同時還表明UUU是苯丙氨酸的密碼子。這是第一個遺傳密碼子被破譯。尼倫伯格的實驗巧妙之處在于利用無細(xì)胞系統(tǒng)進(jìn)行體外合成蛋白質(zhì),他這富有創(chuàng)新的實驗方法為他帶來了重大的成功!請問為什么要去除細(xì)胞提取液中的DNA和mRNA?(學(xué)生:防止細(xì)胞原有的DNA和mRNA中的遺傳信息起作用干擾實驗結(jié)果)如果你是尼倫伯格,你將如何設(shè)計對照實驗,確保你的重大發(fā)現(xiàn)是正確的?(學(xué)生:在對照實驗中的所有試管中加入成分均不變,但是不加入多聚尿嘧啶核苷酸)實驗做到這里,你能想到其他的密碼如何破譯嗎?(學(xué)生

54、:加入不同的人工合成的多聚核苷酸進(jìn)行實驗)很好,尼倫伯格也用同樣的方法分別加入polyA、polyC和polyG結(jié)果相應(yīng)地獲得了多聚賴氨酸、多聚脯氨酸和多聚甘氨酸。Nirenberg利用無細(xì)胞系統(tǒng)體外合成蛋白質(zhì)不僅順利地破譯了4個密碼子,同時了證實了Crick等原先認(rèn)為AAA,UUU,GGG,CCC是無義密碼子的推測是錯誤的。在接下來的六七年里,科學(xué)家沿著體外合成蛋白質(zhì)的思路,不斷地改進(jìn)實驗方法,破譯出了全部的密碼子,并編制出了密碼子表。這項工作成為生物學(xué)史上的一個偉大的里程碑!為人類探索和提示生命的本質(zhì)的研究向前邁進(jìn)一大步,為后面分子遺傳生物學(xué)的發(fā)展有著重要的推動作用。遺傳密碼的破譯、測序方

55、法的建立以及體外重組的實現(xiàn)是基因工程的三大基石。教師精講我們注意整個破譯過程中科學(xué)家思維的變化,薛定諤是以富有遠(yuǎn)見卓識的大膽的想象來預(yù)測遺傳密碼的形式的,伽莫夫通過數(shù)學(xué)的排列組合的計算來推測密碼子是由三個堿基組成的,同時他也預(yù)測了密碼的閱讀方式,盡管智者千慮,必有一失,但巧妙的構(gòu)思依然顯示了其睿智和創(chuàng)新??死锟藙t是巧妙地設(shè)計實驗,利用原黃素處理噬菌體,使DNA脫落或插入單個堿基的方法從實驗上證明了伽莫夫的三聯(lián)體密碼子的推測,由理論走向?qū)嶒?,為密碼子的破譯邁出重要的一步。而尼倫伯格的實驗則更富有創(chuàng)新性,他建立巧妙的無細(xì)胞系統(tǒng)進(jìn)行體外蛋白質(zhì)合成,成功地破譯了第一個密碼子,隨后的方法不斷創(chuàng)新最終破譯

56、了所有的密碼子。他的貢獻(xiàn)不僅僅在于對遺傳密碼的破譯,更重要的也在對生物研究方法上開啟了新的思維方式。歸結(jié)起來,我們看到,敏銳、大膽、睿智和創(chuàng)新是科學(xué)家的重要素養(yǎng),也正如尼倫伯格在1968年獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎時說過:一個善于捕捉細(xì)節(jié)的人才是能領(lǐng)略事物真諦的人。評價反饋1.在下列基因的改變中,合成出具有正常功能蛋白質(zhì)的可能性最大的是A.在相關(guān)的基因的堿基序列中刪除或增加一個堿基對B.在相關(guān)的基因的堿基序列中刪除或增加兩個堿基對C.在相關(guān)的基因的堿基序列中刪除或增加三個堿基對D.在相關(guān)的基因的堿基序列中刪除或增加四個堿基對解析:此題考查基因中堿基數(shù)量發(fā)生突變時對合成蛋白質(zhì)的影響,當(dāng)插入1、2的

57、倍數(shù)個堿基時,都會對后面的所有的氨基酸有影響。當(dāng)插入3個堿基時,則可能對部分氨基酸有影響,所以C是最可能合成具有正常功能蛋白質(zhì)。答案:C2.最早提出3個堿基編碼一個氨基酸的科學(xué)家和首次用實驗的方法加以證明的科學(xué)家分別是A.克里克、伽莫夫B.克里克、沃森C.摩爾根、尼倫伯格D.伽莫夫、克里克解析:此題考查的是科學(xué)史。答案:D3.采用蛋白質(zhì)體外合成的技術(shù)揭示遺傳密碼實驗中,改變下列哪項操作,即可測出全部的遺傳密碼與氨基酸的對應(yīng)規(guī)則A.無DNA和mRNA細(xì)胞的提取液B.人工合成的多聚核苷酸C.加入的氨基酸種類和數(shù)量D.測定多肽鏈中氨基酸種類的方法解析:此題考查了尼倫伯格的實驗,通過改變?nèi)斯つ0宥嗑酆塑账峥梢詼y出不同密碼子。答案:B課堂小結(jié)這節(jié)課我們回顧了遺傳密碼的破譯過程:1944年理論物理學(xué)家薛定諤發(fā)表的什么是生命一書中就大膽地預(yù)言,遺傳密碼可能與

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