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文檔簡介

1、外周血單個核細(xì)胞分離 - 葡蔗糖-泛影葡胺密度梯度離心法 原理 外周血單個核細(xì)胞（PBMC）包括淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞，其體積、形狀和比重與其他細(xì)胞不同。紅細(xì)胞和多核細(xì)胞比重較大，為1.092左右，而淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞比重為1.075左右。利用比重為1.077左右的分層液作密度梯度離心，使一定比重的細(xì)胞按密度梯度分布，從而將各種血細(xì)胞加以分離。 材料 1、淋巴細(xì)胞分層液（葡蔗糖-泛影葡胺，比重為 1.0770.001g/L） 2、 2臺盼藍(lán)染液 3、 Hanks液或者RPMI-1640培養(yǎng)基 4、試管、吸管、水平離心機等方法1、無菌采集靜脈血2ml注入盛有2ml Hanks液（含100u/ml肝素

2、）的試管中，混勻。2、吸取淋巴細(xì)胞分層液2ml加入離心管中，再將稀釋抗凝血液小心沿管壁加至分層液上，應(yīng)注意保持兩者界面清晰。（關(guān)鍵）3、室溫2000rmin離心20min。管內(nèi)可分為四層。4、用毛細(xì)吸管輕輕吸出乳白色的單個核細(xì)胞，加入另一支已含有25 mlHanks液的離心管中，混勻。5、室溫下，1500 rpm離心10 min。6、棄上清，將PBMC用1ml PBS稀釋，混勻 First antibodyPBMCsecondary antibody-fluorochrome原 理材材 料料 PBMC 兔抗人白細(xì)胞血清 (Ab1) FITC-抗兔單克隆抗體 (Ab2)方方 法法 吸管取1滴PBMC液體（約10ul）滴加到標(biāo)本片黑色圈圈背面中央, 靜止5-10分鐘，待PBMC干燥。 15 ml Ab1 加入玻片上濕盒內(nèi)孵育 30min。 甩干玻片, 用洗脫液洗5次，甩干玻片 玻片上加15 ml 熒光二抗 (Ab2) 濕盒內(nèi)孵育 30min。(避光操作) 甩干玻片, 用洗脫液洗5次，甩干玻片 用熒光顯

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