酶活性濃度的測定技術(shù)

1、2教學(xué)目標(biāo)教學(xué)目標(biāo) 教學(xué)時數(shù)教學(xué)時數(shù) 6 6學(xué)時學(xué)時血清酶的分類、生理變異、病生機(jī)制血清酶的分類、生理變異、病生機(jī)制等，同工酶及其亞型測定，臨床診斷中常用等，同工酶及其亞型測定，臨床診斷中常用的血清酶及其同工酶，重要血清酶的測定、的血清酶及其同工酶，重要血清酶的測定、原理及評價原理及評價 。酶的有關(guān)酶基本知識，酶活性濃度的酶的有關(guān)酶基本知識，酶活性濃度的測定技術(shù)及酶的免疫化學(xué)測定測定技術(shù)及酶的免疫化學(xué)測定 。3 第一節(jié)第一節(jié) 血血 清清 酶酶 4一、血清酶的來源一、血清酶的來源 根據(jù)酶的來源及其在血漿中發(fā)揮催化根據(jù)酶的來源及其在血漿中發(fā)揮催化功能的情況，將其分為：功能的情況，將其分為：一般代謝

2、酶一般代謝酶組織專一酶組織專一酶血漿特異酶血漿特異酶非血漿特異酶非血漿特異酶 外分泌酶外分泌酶細(xì)胞酶細(xì)胞酶一般代謝酶一般代謝酶組織專一酶組織專一酶血漿特異酶血漿特異酶非血漿特異酶非血漿特異酶 外分泌酶外分泌酶細(xì)胞酶細(xì)胞酶血血 清清 酶酶5 名稱名稱 血漿特異酶血漿特異酶 非非血漿特異酶血漿特異酶 外分泌酶外分泌酶細(xì)胞酶細(xì)胞酶一般代謝酶一般代謝酶組織專一酶組織專一酶來源來源肝肝消化腺或其消化腺或其它外分泌腺它外分泌腺 各組織器官各組織器官 （無器官專（無器官專一性）一性） 肝肝 （有器官（有器官專一性）專一性） 種類種類凝血酶原、凝血酶原、因因子、子、因子、纖因子、纖溶酶原、溶酶原、ChEChE

3、、CERCER、LCATLCAT、脂、脂蛋白脂肪酶等蛋白脂肪酶等 胰淀粉酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶、胰脂肪酶、胰蛋白酶、胰蛋白酶、ACP、ALP等等LDH、AST、ALT、CK、MDH等等 OCT等等 6二、血清酶的去路二、血清酶的去路酶蛋白在血管內(nèi)的失活與降解（主要代謝去路）酶蛋白在血管內(nèi)的失活與降解（主要代謝去路）血清酶的半壽期（血清酶的半壽期（T1/2)：n酶失活至原來活性一半所需時間。酶失活至原來活性一半所需時間。n有助于了解同一疾病不同酶升高持續(xù)時間的差異。有助于了解同一疾病不同酶升高持續(xù)時間的差異。肝或網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)對血清酶的清除肝或網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)對血清酶的清除 少數(shù)以酶原形式存在的血清酶

4、類（凝血酶原、纖少數(shù)以酶原形式存在的血清酶類（凝血酶原、纖溶酶原）在活化后迅速被肝清除，網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)也可溶酶原）在活化后迅速被肝清除，網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)也可能參與血清酶（能參與血清酶（LD、AST、AMY、CK等）的清除。等）的清除。血清酶的排泄血清酶的排泄 尿路是血清中低分子量酶的重要排泄途徑，如胃尿路是血清中低分子量酶的重要排泄途徑，如胃蛋白酶原、淀粉酶（蛋白酶原、淀粉酶（AMY）。）。轉(zhuǎn)入其它體液轉(zhuǎn)入其它體液 只有血清酶的來源與去路保持平衡，才能維持酶只有血清酶的來源與去路保持平衡，才能維持酶活性保持相對恒定。但一些病理情況往往促使這種平活性保持相對恒定。但一些病理情況往往促使這種平衡被打破，

5、導(dǎo)致血清酶活性的變化。衡被打破，導(dǎo)致血清酶活性的變化。7三、血清酶變化的病理機(jī)制三、血清酶變化的病理機(jī)制（一）合成異常（一）合成異常合成減少合成減少合成增多合成增多肝損害導(dǎo)致合成酶的能力受損肝損害導(dǎo)致合成酶的能力受損（ChE、LCAT）酶基因變異引起酶合成減少酶基因變異引起酶合成減少（銅氧化酶）（銅氧化酶）增生性疾?。ü趋兰膊?，增生性疾?。ü趋兰膊?，ALP)惡性腫瘤（前列腺癌，惡性腫瘤（前列腺癌，ACP)酶的誘導(dǎo)作用（乙醇，酶的誘導(dǎo)作用（乙醇，-GT）8（二）釋放增加（大多數(shù)血清酶增高的主要機(jī)制）（二）釋放增加（大多數(shù)血清酶增高的主要機(jī)制）細(xì)胞內(nèi)外酶濃度的差異細(xì)胞內(nèi)外酶濃度的差異 對于非血漿特

6、異酶，細(xì)胞內(nèi)外濃度差可在對于非血漿特異酶，細(xì)胞內(nèi)外濃度差可在千倍以上，只要有少量細(xì)胞壞死或病變，血中千倍以上，只要有少量細(xì)胞壞死或病變，血中酶濃度明顯升高。對血漿特異酶，細(xì)胞病變很酶濃度明顯升高。對血漿特異酶，細(xì)胞病變很少引起血中酶濃度明顯升高。少引起血中酶濃度明顯升高。酶的相對分子量（影響細(xì)胞內(nèi)釋出的關(guān)鍵）酶的相對分子量（影響細(xì)胞內(nèi)釋出的關(guān)鍵） 酶從細(xì)胞內(nèi)釋出的速度與酶的相對分子量酶從細(xì)胞內(nèi)釋出的速度與酶的相對分子量成反比。如成反比。如AMI時，血中最先升高的是時，血中最先升高的是CK（MW：85kD)，LD （MW：125kD)出現(xiàn)升高出現(xiàn)升高明顯延遲。明顯延遲。酶的組織分布酶的組織分布

7、含酶量高且血流豐富的組織器官，其細(xì)胞含酶量高且血流豐富的組織器官，其細(xì)胞內(nèi)酶進(jìn)入血流的可能性大；除少數(shù)組織專一性內(nèi)酶進(jìn)入血流的可能性大；除少數(shù)組織專一性酶以外，大多數(shù)血清酶不能特異反映某個特定酶以外，大多數(shù)血清酶不能特異反映某個特定組織的病變。但同工酶的發(fā)現(xiàn)大大提高酶檢測組織的病變。但同工酶的發(fā)現(xiàn)大大提高酶檢測的組織的特異性。的組織的特異性。酶在細(xì)胞內(nèi)的定位及存在形式酶在細(xì)胞內(nèi)的定位及存在形式 線粒體酶不易從細(xì)胞中釋出，如線粒體酶不易從細(xì)胞中釋出，如ASTm的的檢測往往反映肝細(xì)胞的損傷程度，且是檢測往往反映肝細(xì)胞的損傷程度，且是AMI中中最后升高的酶，用于判斷預(yù)后；有些酶在細(xì)胞最后升高的酶，用

8、于判斷預(yù)后；有些酶在細(xì)胞內(nèi)與結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)合，較難釋放。內(nèi)與結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)合，較難釋放。ATP ATP不足，細(xì)胞內(nèi)酶容易釋放。不足，細(xì)胞內(nèi)酶容易釋放。9（三）排出異常（三）排出異常腎功能減退，血清腎功能減退，血清AMY活性升高可能活性升高可能因酶排泄障礙而在血液中滯留。因酶排泄障礙而在血液中滯留。膽道梗阻，血清膽道梗阻，血清ALP升高的原因是梗升高的原因是梗阻區(qū)阻區(qū)ALP合成加強(qiáng)，合成加強(qiáng)，ALP排泄受阻而逆排泄受阻而逆流入血。流入血。大多數(shù)酶，不存在以上的清除機(jī)制。大多數(shù)酶，不存在以上的清除機(jī)制。10四、血清酶的生理差異四、血清酶的生理差異（一）性（一）性 別別多數(shù)酶無差異，少數(shù)有差異多數(shù)酶無差異，

9、少數(shù)有差異男性高于女性：男性高于女性： CKCK、ALPALP、 -GT女性高于男性：女性高于男性：LDH1LDH1（青年婦女）（青年婦女）（二）年（二）年 齡齡 最明顯的例子是最明顯的例子是ALPALP，新生兒血清中，新生兒血清中ALPALP略略高于成人，高于成人，1 15 5歲增至成人的歲增至成人的2 23 3倍，然后逐倍，然后逐漸下降，到漸下降，到10101515歲，歲，ALPALP又明顯升高，可達(dá)又明顯升高，可達(dá)成人的成人的3 35 5倍，倍，2020歲后降至成人值。歲后降至成人值。（三）飲（三）飲 食食 血清中大多數(shù)酶不受進(jìn)食影響，故測定酶血清中大多數(shù)酶不受進(jìn)食影響，故測定酶活性不一

10、定需要空腹采血?；钚圆灰欢ㄐ枰崭共裳?。（四）運(yùn)（四）運(yùn) 動動 激烈的肌肉運(yùn)動可使血清中多種酶，如激烈的肌肉運(yùn)動可使血清中多種酶，如CKCK、LDLD、ASTAST、ALDALD、ALTALT等活性升高。等活性升高。（五）妊（五）妊 娠娠（六）其（六）其 它它11第第 二二 節(jié)節(jié) 酶活性濃度的測定技術(shù)酶活性濃度的測定技術(shù)12酶活性濃度的測定技術(shù)酶活性濃度的測定技術(shù)酶活性濃度概念酶活性濃度概念酶活性濃度測定酶活性濃度測定連續(xù)監(jiān)測法檢測酶活性濃度連續(xù)監(jiān)測法檢測酶活性濃度工具酶工具酶血清酶活性濃度測定條件的優(yōu)化血清酶活性濃度測定條件的優(yōu)化酶活性濃度的單位酶活性濃度的單位13一、酶活性濃度的概念一、酶

11、活性濃度的概念1. 酶的特性：微量性酶的特性：微量性、高效性高效性等。等。直接測量非常困難直接測量非常困難（mmol/L或或mg/dl）通過測定被加速化學(xué)反通過測定被加速化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)速率，來間接應(yīng)的反應(yīng)速率，來間接反映酶的濃度反映酶的濃度2. 酶促反應(yīng)酶促反應(yīng)SSEE +ESEPE + PVdsdt或或VdpdtES14 3. 酶活性濃度酶活性濃度 即即酶所催化的化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)速率酶所催化的化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)速率，用用酶促反應(yīng)中單位時間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物酶促反應(yīng)中單位時間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的生成量來計(jì)算。的生成量來計(jì)算。注意注意：只有當(dāng)酶所催化的反應(yīng)速度僅與只有當(dāng)酶所催化的反應(yīng)速度僅與 E

12、成正比，而不受其它因素影響時，即在酶促成正比，而不受其它因素影響時，即在酶促反應(yīng)的反應(yīng)的零級期零級期，才能根據(jù)酶所催化的化學(xué)反才能根據(jù)酶所催化的化學(xué)反應(yīng)速率來確切表示酶活性濃度的大小。應(yīng)速率來確切表示酶活性濃度的大小。15 實(shí)際上是通過檢測酶活性濃度間接反映酶的實(shí)際上是通過檢測酶活性濃度間接反映酶的量，因?yàn)橹苯訖z測酶的質(zhì)量濃度要求的實(shí)驗(yàn)條件量，因?yàn)橹苯訖z測酶的質(zhì)量濃度要求的實(shí)驗(yàn)條件及技術(shù)條件非常高，價格昂貴，不適用于臨床檢及技術(shù)條件非常高，價格昂貴，不適用于臨床檢測，因此測定酶活性濃度是臨床酶學(xué)分析最為常測，因此測定酶活性濃度是臨床酶學(xué)分析最為常見的方法，具有迅速、靈敏、成本低等特點(diǎn)。見的方法

13、，具有迅速、靈敏、成本低等特點(diǎn)。 但僅在上述前提下，只能在反應(yīng)的零級期，但僅在上述前提下，只能在反應(yīng)的零級期，即只有在酶促反應(yīng)的最適條件下，才能真實(shí)地代即只有在酶促反應(yīng)的最適條件下，才能真實(shí)地代表酶含量。因此可根據(jù)酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線，采用表酶含量。因此可根據(jù)酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線，采用合理的方法進(jìn)行酶活性濃度的檢測。合理的方法進(jìn)行酶活性濃度的檢測。16零級零級一級一級PSV dpdt反應(yīng)級數(shù)反應(yīng)級數(shù)時間時間4. 酶促反應(yīng)進(jìn)程酶促反應(yīng)進(jìn)程延滯期延滯期線性期線性期非線性期非線性期Lag phaseZero orderLinear phaseFirst order酶促反應(yīng)時間進(jìn)程曲線酶促反應(yīng)時間進(jìn)程曲線17

14、單試劑測定體系酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線單試劑測定體系酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線18結(jié)論：結(jié)論： 為了計(jì)算酶活性濃度，必須根據(jù)線性為了計(jì)算酶活性濃度，必須根據(jù)線性反應(yīng)期（零級反應(yīng)期）的反應(yīng)速率才能準(zhǔn)反應(yīng)期（零級反應(yīng)期）的反應(yīng)速率才能準(zhǔn)確計(jì)算出酶活性濃度否則將導(dǎo)致誤差。確計(jì)算出酶活性濃度否則將導(dǎo)致誤差。 酶活性濃度測定就是要使酶促反應(yīng)酶活性濃度測定就是要使酶促反應(yīng)的初速度達(dá)到的初速度達(dá)到Vmax，即在過量底物存在，即在過量底物存在下的零級反應(yīng)期的下的零級反應(yīng)期的V，此時，此時V與與E之間有之間有線性關(guān)系。線性關(guān)系。19二、酶活性濃度測定方法二、酶活性濃度測定方法（一）按檢測方法分類（一）按檢測方法分類1、量氣法、量

15、氣法其原理是通過測量一封閉其原理是通過測量一封閉反應(yīng)系統(tǒng)中氣體變化后的反應(yīng)系統(tǒng)中氣體變化后的氣體體積或壓力，從而計(jì)氣體體積或壓力，從而計(jì)算出氣體的變化量算出氣體的變化量適用于測定在反應(yīng)中產(chǎn)生適用于測定在反應(yīng)中產(chǎn)生或或 消耗氣體的酶消耗氣體的酶2、分光光度法、分光光度法酶促反應(yīng)的底物與產(chǎn)物結(jié)酶促反應(yīng)的底物與產(chǎn)物結(jié)構(gòu)不同，光吸收譜也有差構(gòu)不同，光吸收譜也有差異，不僅能在可見光范圍異，不僅能在可見光范圍測定有色溶液的濃度，還測定有色溶液的濃度，還能在紫外光波長范圍測定能在紫外光波長范圍測定特異的帶有雙鍵或環(huán)狀結(jié)特異的帶有雙鍵或環(huán)狀結(jié)構(gòu)的無色物質(zhì)構(gòu)的無色物質(zhì)3、熒光法和放射性核素法、熒光法和放射性核素

16、法通過熒光光度計(jì)測通過熒光光度計(jì)測定酶促反應(yīng)生成熒定酶促反應(yīng)生成熒光物質(zhì)的速率，此光物質(zhì)的速率，此速率與酶濃度成正速率與酶濃度成正比比4、其它方法、其它方法20（二）按反應(yīng)時間分類（二）按反應(yīng)時間分類1、定時法定時法（取樣法、終點(diǎn)法、兩點(diǎn)法）（取樣法、終點(diǎn)法、兩點(diǎn)法）優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 簡單，測定時酶促反應(yīng)已被終止，故比色計(jì)簡單，測定時酶促反應(yīng)已被終止，故比色計(jì)或分光光度計(jì)無需保溫設(shè)備，顯色劑的選擇或分光光度計(jì)無需保溫設(shè)備，顯色劑的選擇不考慮對酶活性的影響。不考慮對酶活性的影響。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：無法知道無法知道在整個酶促反應(yīng)進(jìn)程中是否都是零在整個酶促反應(yīng)進(jìn)程中是否都是零級反應(yīng)。級反應(yīng)。注意：注意：應(yīng)先做

17、預(yù)實(shí)驗(yàn)找出酶促反應(yīng)速率恒定的時期，應(yīng)先做預(yù)實(shí)驗(yàn)找出酶促反應(yīng)速率恒定的時期，確定線性時間；保證酶和底物在所選定的溫確定線性時間；保證酶和底物在所選定的溫度下作用時間要精確。度下作用時間要精確。21 定時法定時法，早期測定酶活性濃度的方法，大多是，早期測定酶活性濃度的方法，大多是使酶作用一段時間，然后加入強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、蛋白沉使酶作用一段時間，然后加入強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、蛋白沉淀劑等終止酶促反應(yīng)，測定這段時間內(nèi)底物的減少淀劑等終止酶促反應(yīng)，測定這段時間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的生成量，計(jì)算酶促反應(yīng)的平均速度。量或產(chǎn)物的生成量，計(jì)算酶促反應(yīng)的平均速度。 連續(xù)監(jiān)測法，連續(xù)監(jiān)測法，即指連續(xù)測定酶促反應(yīng)過程中某即指連續(xù)測

18、定酶促反應(yīng)過程中某一產(chǎn)物或底物濃度隨時間變化的多點(diǎn)數(shù)據(jù)，求出酶一產(chǎn)物或底物濃度隨時間變化的多點(diǎn)數(shù)據(jù)，求出酶促反應(yīng)初速度，間接計(jì)算出酶活性濃度的方法。其促反應(yīng)初速度，間接計(jì)算出酶活性濃度的方法。其是臨床測定酶活性濃度最常用方法。是臨床測定酶活性濃度最常用方法。222、連續(xù)監(jiān)測法連續(xù)監(jiān)測法（動力學(xué)法、速率法）（動力學(xué)法、速率法）優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 容易找到直線區(qū)域，選擇線性反應(yīng)期容易找到直線區(qū)域，選擇線性反應(yīng)期來計(jì)算酶活性，來計(jì)算酶活性，不需終止反應(yīng)。不需終止反應(yīng)。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：線性反應(yīng)期因酶種類和反應(yīng)條件而異，線性反應(yīng)期因酶種類和反應(yīng)條件而異，必須用實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行確定，必須選取必須用實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行確定，必須

19、選取酶促反應(yīng)的最適反應(yīng)條件，需要有可酶促反應(yīng)的最適反應(yīng)條件，需要有可以連續(xù)監(jiān)測的設(shè)備以連續(xù)監(jiān)測的設(shè)備。3、平衡法、平衡法 目前臨床應(yīng)用較少，通過測定酶促反應(yīng)開目前臨床應(yīng)用較少，通過測定酶促反應(yīng)開始至反應(yīng)達(dá)到平衡時產(chǎn)物或底物濃度的總變化始至反應(yīng)達(dá)到平衡時產(chǎn)物或底物濃度的總變化量來求出酶活性濃度的方法。量來求出酶活性濃度的方法。23三、連續(xù)監(jiān)測法測定酶活性濃度三、連續(xù)監(jiān)測法測定酶活性濃度（一）種類（一）種類1.直接法直接法 不終止酶促反應(yīng)條件下，直接通過測定反應(yīng)體系中底物不終止酶促反應(yīng)條件下，直接通過測定反應(yīng)體系中底物或產(chǎn)物理化性質(zhì)的變化（如：或產(chǎn)物理化性質(zhì)的變化（如：A、熒光、旋光性，、熒光、旋

20、光性，pH、電導(dǎo)、電導(dǎo)率、粘度等），從而計(jì)算出酶活性濃度。率、粘度等），從而計(jì)算出酶活性濃度。評價評價 方法簡單，但只有底物與產(chǎn)物之間，在理化性質(zhì)方面有方法簡單，但只有底物與產(chǎn)物之間，在理化性質(zhì)方面有顯著性差異時，才能使用直接法，只有很少一部分酶能用直顯著性差異時，才能使用直接法，只有很少一部分酶能用直接法測定。接法測定。24（1） 目前以分光光度法最為廣泛，目前以分光光度法最為廣泛，利用利用340nm處吸光度的變化測定各種脫氫酶。處吸光度的變化測定各種脫氫酶。NAD(P)+H+ NAD(P)H 僅在僅在260nm處有吸收峰處有吸收峰 在在260、340nm處有吸收峰處有吸收峰 340nm處處

21、A的變化可以反映反應(yīng)體系中的變化可以反映反應(yīng)體系中NAD(P)H量量的增減，進(jìn)而反映酶活性濃度。的增減，進(jìn)而反映酶活性濃度。（2） 利用一類人工合成的所謂色原性底物，利用一類人工合成的所謂色原性底物，其本身為無色或微黃色，酶作用后生成有色化合物。其本身為無色或微黃色，酶作用后生成有色化合物。25（1）在原反應(yīng)體系中加入一些試劑，其只和酶反應(yīng)）在原反應(yīng)體系中加入一些試劑，其只和酶反應(yīng)物迅速作用，產(chǎn)生可被檢出的物質(zhì)，但該試劑不和物迅速作用，產(chǎn)生可被檢出的物質(zhì)，但該試劑不和酶反應(yīng)，也不影響酶的活性。酶反應(yīng)，也不影響酶的活性。S PE+ 試劑試劑可被檢出的物質(zhì)可被檢出的物質(zhì)（2）酶偶聯(lián)法）酶偶聯(lián)法 目

22、前應(yīng)用最多目前應(yīng)用最多，即在原反應(yīng)體系中，即在原反應(yīng)體系中加入另一些酶試劑，所進(jìn)行的酶促反應(yīng)和被測酶反加入另一些酶試劑，所進(jìn)行的酶促反應(yīng)和被測酶反應(yīng)偶聯(lián)起來。應(yīng)偶聯(lián)起來。26（二）酶偶聯(lián)反應(yīng)（二）酶偶聯(lián)反應(yīng) 反應(yīng)模式反應(yīng)模式A B PExEi被測酶被測酶被測酶被測酶始發(fā)反應(yīng)始發(fā)反應(yīng)始發(fā)反應(yīng)始發(fā)反應(yīng)指示反應(yīng)指示反應(yīng)指示酶指示酶指示反應(yīng)指示反應(yīng)指示酶指示酶A B C P ExEaEi輔助酶輔助酶輔助反應(yīng)輔助反應(yīng)酶偶聯(lián)體系酶偶聯(lián)體系輔助酶輔助酶輔助反應(yīng)輔助反應(yīng)271. 酶偶聯(lián)反應(yīng)時相酶偶聯(lián)反應(yīng)時相 酶偶聯(lián)反應(yīng)一開始不能反映酶活性，在反應(yīng)中存在幾酶偶聯(lián)反應(yīng)一開始不能反映酶活性，在反應(yīng)中存在幾個時相。以

23、臨床常規(guī)酶學(xué)分析中常見的個時相。以臨床常規(guī)酶學(xué)分析中常見的ALT的檢測為例，的檢測為例，在該酶偶聯(lián)體系中的指示酶為脫氫酶，反應(yīng)原理如下：在該酶偶聯(lián)體系中的指示酶為脫氫酶，反應(yīng)原理如下：L-丙氨酸丙氨酸-酮戊二酸酮戊二酸 -丙酮酸丙酮酸 L-谷氨酸谷氨酸-丙酮酸丙酮酸NADH 乳酸乳酸NAD+ALTLDH 此時反應(yīng)的方向由此時反應(yīng)的方向由NADH轉(zhuǎn)變?yōu)檗D(zhuǎn)變?yōu)镹AD，隨反應(yīng)進(jìn)行，隨反應(yīng)進(jìn)行，A應(yīng)隨之而下降，通過檢測反應(yīng)產(chǎn)物應(yīng)隨之而下降，通過檢測反應(yīng)產(chǎn)物A在在340nm處處A的變化速的變化速率，可以檢測指示酶反應(yīng)。率，可以檢測指示酶反應(yīng)。ALT雙試劑法測定中，首先使血清與缺雙試劑法測定中，首先使血清

24、與缺少少-酮戊二酸的底物溶液混合，酮戊二酸的底物溶液混合，37C保保溫溫5m，將樣品中所含的內(nèi)源性，將樣品中所含的內(nèi)源性-酮酸消酮酸消耗完。然后再加入耗完。然后再加入-酮戊二酸啟動酮戊二酸啟動ALT催化的反應(yīng)。催化的反應(yīng)。28反應(yīng)一開始加入的試劑反應(yīng)一開始加入的試劑1中只有丙氨酸，不存在中只有丙氨酸，不存在-酮戊酮戊二酸，在此時相中，存在于樣品中的干擾物質(zhì)（內(nèi)源性二酸，在此時相中，存在于樣品中的干擾物質(zhì)（內(nèi)源性-酮酸）消耗完。酮酸）消耗完。 加入試劑加入試劑2（即（即-酮酮戊二酸）啟動反應(yīng)，在戊二酸）啟動反應(yīng)，在初始階段，產(chǎn)物初始階段，產(chǎn)物-丙酮丙酮酸開始出現(xiàn)，并逐漸增酸開始出現(xiàn)，并逐漸增多，

25、但處于較低水平，多，但處于較低水平，指示酶反應(yīng)速度也較低，指示酶反應(yīng)速度也較低，不能代表待測酶的不能代表待測酶的Vx。隨著產(chǎn)物隨著產(chǎn)物-丙酮酸增加到一丙酮酸增加到一定程度，定程度，Ex和和Ei反應(yīng)反應(yīng)V相同，相同，達(dá)到穩(wěn)態(tài)期。此階段達(dá)到穩(wěn)態(tài)期。此階段340nm處處A出現(xiàn)明顯的線性變化。出現(xiàn)明顯的線性變化。最后由于底最后由于底物的消耗，物的消耗，反應(yīng)反應(yīng)V逐漸減逐漸減慢，偏離線慢，偏離線性。性。P150 292. 酶偶聯(lián)反應(yīng)注意事項(xiàng)酶偶聯(lián)反應(yīng)注意事項(xiàng)(1)延滯期應(yīng)越短越好，測定時間要避開此期。延滯期應(yīng)越短越好，測定時間要避開此期。(2)(2)不是所有的酶都適合用酶偶聯(lián)法進(jìn)行測定，酶偶聯(lián)不是所有的

26、酶都適合用酶偶聯(lián)法進(jìn)行測定，酶偶聯(lián)反應(yīng)反應(yīng)V V應(yīng)超過或等于應(yīng)超過或等于VxVx，Ei Ei反應(yīng)必須是一級反應(yīng)，即指示反應(yīng)必須是一級反應(yīng)，即指示酶反應(yīng)速率和測定酶的產(chǎn)物酶反應(yīng)速率和測定酶的產(chǎn)物B B濃度成正比。只有使用大量濃度成正比。只有使用大量的的Ei Ei及其及其KmKm值很小時才能做到。值很小時才能做到。(3)(3)從經(jīng)濟(jì)方面考慮應(yīng)選用一些來源容易且價格便宜的從經(jīng)濟(jì)方面考慮應(yīng)選用一些來源容易且價格便宜的酶（指示酶）制劑。酶（指示酶）制劑。(4)(4)適當(dāng)?shù)闹甘久傅挠昧浚磸?fù)實(shí)驗(yàn)法確定，即做到酶適當(dāng)?shù)闹甘久傅挠昧浚磸?fù)實(shí)驗(yàn)法確定，即做到酶偶聯(lián)速率不隨酶量的增加而升高，并在所選的最適條件偶聯(lián)

27、速率不隨酶量的增加而升高，并在所選的最適條件下，指示酶偶聯(lián)反應(yīng)速率和酶活性濃度成正比。下，指示酶偶聯(lián)反應(yīng)速率和酶活性濃度成正比。30（三）干擾因素（三）干擾因素(1)其他酶和物質(zhì)的干擾其他酶和物質(zhì)的干擾(2)酶的污染酶的污染(3)非酶反應(yīng)非酶反應(yīng)(4)分析容器的污染分析容器的污染(5)沉淀形成沉淀形成 解決方法之一可通過試劑空白管檢出并加以解決方法之一可通過試劑空白管檢出并加以校正，另一個有效途徑就是不用單一試劑而改用校正，另一個有效途徑就是不用單一試劑而改用雙試劑測定酶活性。雙試劑測定酶活性。31四、工具酶四、工具酶工具酶：酶學(xué)分析中作為試劑用于測定化工具酶：酶學(xué)分析中作為試劑用于測定化合物

28、濃度或酶活性濃度的酶。合物濃度或酶活性濃度的酶。指示酶和輔助酶作為反應(yīng)系統(tǒng)中的試劑。指示酶和輔助酶作為反應(yīng)系統(tǒng)中的試劑。（一）工具酶（一）工具酶（二）常用工具酶（二）常用工具酶常用工具酶多為氧化還原酶類常用工具酶多為氧化還原酶類工具酶純度不必要求過高工具酶純度不必要求過高工具酶中雜質(zhì)的含量有一定的限制工具酶中雜質(zhì)的含量有一定的限制32（三）工具酶參與的指示反應(yīng)（三）工具酶參與的指示反應(yīng) 臨床生化檢驗(yàn)中，很多項(xiàng)目的測定往往使用有工具酶參與臨床生化檢驗(yàn)中，很多項(xiàng)目的測定往往使用有工具酶參與的類似的反應(yīng)原理共通（通用）反應(yīng)途徑。的類似的反應(yīng)原理共通（通用）反應(yīng)途徑。1. 偶聯(lián)偶聯(lián)H2O2的工具酶及其

29、指示反應(yīng)的工具酶及其指示反應(yīng)葡萄糖葡萄糖尿酸尿酸膽固醇膽固醇甘油甘油丙酮酸丙酮酸葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶尿酸氧化酶尿酸氧化酶膽固醇氧化酶膽固醇氧化酶甘油氧化酶甘油氧化酶丙酮酸氧化酶丙酮酸氧化酶H2O2以以H（e）為受體的指示酶）為受體的指示酶以以NAD(P)H為輔酶參與的指示酶為輔酶參與的指示酶觸酶觸酶POD(最常用）最常用）2H2O2+4-AAP+酚酚 醌亞胺醌亞胺(紅色紅色)+4H2OPOD33例：葡萄糖氧化酶法測定血清葡萄糖例：葡萄糖氧化酶法測定血清葡萄糖GluO2H2O GAH2O2H2O24-AAP酚酚 H2OO2紅色醌類化合物紅色醌類化合物GODPOD 葡萄糖氧化酶（葡萄糖氧化酶（

30、glucose oxidase，GOD）利用）利用O2和和H2O將將Glu氧化成氧化成GA，并釋放，并釋放H2O2 ，過氧化物酶（，過氧化物酶（peroxidase，POD）在色原性氧受體存在時將）在色原性氧受體存在時將H2O2分解為分解為H2O和和O2 ，并將，并將色原性氧受體色原性氧受體4-AAP和酚去氫縮合為紅色醌類化合物，即和酚去氫縮合為紅色醌類化合物，即Trinder反應(yīng)。紅色醌類化合物的量與反應(yīng)。紅色醌類化合物的量與Glu含量成正比。含量成正比。 即即POD催化下，催化下， H2O2氧化芳香族胺色素原生成有色色氧化芳香族胺色素原生成有色色素，此類色素原供氫體包括：素，此類色素原供氫

31、體包括：OT、DAB、ODA、TMB。342. NAD(P)+或或NAD(P)H偶聯(lián)的脫氫酶及其指示反應(yīng)偶聯(lián)的脫氫酶及其指示反應(yīng) 許多氧化還原反應(yīng)，尤其是作為工具酶如許多氧化還原反應(yīng)，尤其是作為工具酶如LD、GLD、G6PD等參與時，常將底物的等參與時，常將底物的H去除后傳遞給去除后傳遞給NAD (P)+形成形成NAD(P)H。借助。借助NAD(P)H340nm處特征性的光吸收，借此用處特征性的光吸收，借此用分光光度法檢測。分光光度法檢測。 如：葡萄糖、尿素、如：葡萄糖、尿素、-羥丁酸、甘油三酯、甲醇、血氨、羥丁酸、甘油三酯、甲醇、血氨、 ALT、AST、LD、GLD、CK、ALD、G6PD、

32、ICD等。等。例：例：尿素尿素H2O 2NH3CO2NH3 -酮戊二酸酮戊二酸 NADHH+ 谷氨酸谷氨酸NAD+H2O尿素酶尿素酶GLDP+NAD(P)H+H+ PH2+NAD(P) + 35五、血清酶活性濃度測定條件的優(yōu)化五、血清酶活性濃度測定條件的優(yōu)化方法方法儀器設(shè)備儀器設(shè)備試劑試劑自動生物化學(xué)分析儀參數(shù)設(shè)置自動生物化學(xué)分析儀參數(shù)設(shè)置標(biāo)本的采集、運(yùn)輸與保存標(biāo)本的采集、運(yùn)輸與保存36標(biāo)本的采集、運(yùn)輸與保存標(biāo)本的采集、運(yùn)輸與保存溶血：細(xì)胞內(nèi)酶而言，細(xì)胞內(nèi)外濃度差異大；所以應(yīng)及時溶血：細(xì)胞內(nèi)酶而言，細(xì)胞內(nèi)外濃度差異大；所以應(yīng)及時進(jìn)行分離，進(jìn)行分離，靜脈采血后應(yīng)在靜脈采血后應(yīng)在12h內(nèi)分離血清內(nèi)

33、分離血清?？鼓齽豪貌菟猁}、枸櫞酸鹽、抗凝劑：利用草酸鹽、枸櫞酸鹽、EDTA抗凝的血漿一般不抗凝的血漿一般不用作酶活性測定；肝素對用作酶活性測定；肝素對ALT、AST、CK、LD、ACP檢測檢測均無影響，可用于急診；臨床多用均無影響，可用于急診；臨床多用血清血清為首選測定標(biāo)本。為首選測定標(biāo)本。溫度：大部分酶在低溫中比較穩(wěn)定，一般在血清分離當(dāng)天溫度：大部分酶在低溫中比較穩(wěn)定，一般在血清分離當(dāng)天測定，否則應(yīng)放冰箱冷藏；測定，否則應(yīng)放冰箱冷藏；通常在通常在04 C下使用、處理及下使用、處理及保存保存，除了一些冷變性的酶；液氮可作為酶學(xué)測定時血清標(biāo)，除了一些冷變性的酶；液氮可作為酶學(xué)測定時血清標(biāo)本及

34、質(zhì)控長期保存的方法。本及質(zhì)控長期保存的方法。37六、酶活性濃度單位六、酶活性濃度單位（一）酶活性單位（一）酶活性單位慣用單位慣用單位 用首先報告該種酶測定方法的臨床酶學(xué)家的名字來命名其用首先報告該種酶測定方法的臨床酶學(xué)家的名字來命名其單位，即使同一種酶因方法不同而有數(shù)種活性單位，參考值差單位，即使同一種酶因方法不同而有數(shù)種活性單位，參考值差別很大。別很大。國際單位國際單位1963年，年，1IU1mol/min （25 C 及其他最適條件下）及其他最適條件下） 1976年，年， 1U1mol/min（特定條件下）（特定條件下） 1979年，年，1Katal1mol/s（規(guī)定條件下），（規(guī)定條件下

35、），1U16.67nKatal38（二）酶活性濃度單位（二）酶活性濃度單位以每單位體積所含的酶活性單位數(shù)表示；以每單位體積所含的酶活性單位數(shù)表示；各國學(xué)者習(xí)慣用各國學(xué)者習(xí)慣用U/L表示體液中酶催化活性濃度，表示體液中酶催化活性濃度， 1U/L=16.67nKatal/L 正常上限（正常上限（upper limits of normal，ULN）倍數(shù)）倍數(shù) 把酶測定值轉(zhuǎn)換為正常上限值的倍數(shù)；把酶測定值轉(zhuǎn)換為正常上限值的倍數(shù)；易于比較解釋來自不同方法的結(jié)果，利于各實(shí)驗(yàn)室間質(zhì)評調(diào)查；易于比較解釋來自不同方法的結(jié)果，利于各實(shí)驗(yàn)室間質(zhì)評調(diào)查；可將可將ULN進(jìn)一步適當(dāng)分級，制定出輕度、中度及重度增加的范圍

36、，進(jìn)一步適當(dāng)分級，制定出輕度、中度及重度增加的范圍，使檢測結(jié)果更加一目了然；使檢測結(jié)果更加一目了然；39（三）酶活性濃度計(jì)算（三）酶活性濃度計(jì)算 連續(xù)監(jiān)測法檢測酶活性濃度時，使用摩爾消光系數(shù)（連續(xù)監(jiān)測法檢測酶活性濃度時，使用摩爾消光系數(shù)（）。）。其定義為：特定條件下，一定波長的光，光徑為其定義為：特定條件下，一定波長的光，光徑為1.0cm時，通過時，通過所含吸光物質(zhì)的濃度為所含吸光物質(zhì)的濃度為1.00mol/L時的吸光度。時的吸光度。 連續(xù)監(jiān)測法測定在線性范圍內(nèi)每分鐘吸光度的變化（連續(xù)監(jiān)測法測定在線性范圍內(nèi)每分鐘吸光度的變化（A/min）U/LAminV106 v LA吸光度變化吸光度變化 1

37、06 把把mol換算成換算成mol v樣品量樣品量（ml） L 比色杯光徑（比色杯光徑（cm）V反應(yīng)體系體積（反應(yīng)體系體積（ml） 摩爾消光系數(shù)（摩爾消光系數(shù)（cm2 mol-1 ）40 自動生物化學(xué)分析儀測定同一酶，條件固定時，自動生物化學(xué)分析儀測定同一酶，條件固定時，從理論上講從理論上講V，v和和L均為固定值，均為固定值， 為常數(shù)，則可為常數(shù)，則可將公式簡寫為：將公式簡寫為： U/LAminKV106 v LK=K為酶活性濃度定量系數(shù)為酶活性濃度定量系數(shù)主要用于臨床酶活性測定的計(jì)算與校正主要用于臨床酶活性測定的計(jì)算與校正K值設(shè)置應(yīng)考慮酶的參考值上限及測定時間兩值設(shè)置應(yīng)考慮酶的參考值上限及測

38、定時間兩方面，這些均與儀器測定的噪音有關(guān)。方面，這些均與儀器測定的噪音有關(guān)。41第第 三三 節(jié)節(jié) 酶的免疫化學(xué)測定酶的免疫化學(xué)測定42一、報告方式一、報告方式酶活性濃度單位：酶活性濃度單位：U/L質(zhì)量濃度單位：質(zhì)量濃度單位：ng/ml， g/L二、優(yōu)點(diǎn)二、優(yōu)點(diǎn)靈敏度高靈敏度高特異性高特異性高能用于檢測一些不表現(xiàn)酶活性的酶蛋白能用于檢測一些不表現(xiàn)酶活性的酶蛋白特別適用于同工酶的檢測特別適用于同工酶的檢測樣品中其他方法不易測樣品中其他方法不易測出的少量或痕量酶出的少量或痕量酶不受體液中其它物質(zhì)的不受體液中其它物質(zhì)的影響影響酶原或去輔基酶蛋白酶原或去輔基酶蛋白43三、缺點(diǎn)三、缺點(diǎn)要制備足夠量多的提純

39、酶作為抗原和具有要制備足夠量多的提純酶作為抗原和具有免疫化學(xué)性質(zhì)的抗血清免疫化學(xué)性質(zhì)的抗血清步驟多，操作繁瑣步驟多，操作繁瑣測定成本高測定成本高44第第 四四 節(jié)節(jié) 同工酶及其亞型測定同工酶及其亞型測定45一、概念一、概念同工酶（同工酶（isoenzyme） 同一種屬中由不同基因或等位基因所編碼的多同一種屬中由不同基因或等位基因所編碼的多肽鏈單體、純聚體或雜化體，具有相同的催化功能，肽鏈單體、純聚體或雜化體，具有相同的催化功能，但其分子組成、空間構(gòu)象、理化性質(zhì)、生物學(xué)性質(zhì)但其分子組成、空間構(gòu)象、理化性質(zhì)、生物學(xué)性質(zhì)以及器官分布和細(xì)胞內(nèi)定位不同的一類酶。以及器官分布和細(xì)胞內(nèi)定位不同的一類酶。亞型

40、（亞型（isoform） 即指基因在編碼過程中由于翻譯后修飾的差異即指基因在編碼過程中由于翻譯后修飾的差異所形成的多種形式的一類酶，往往在基因編碼產(chǎn)物所形成的多種形式的一類酶，往往在基因編碼產(chǎn)物從細(xì)胞內(nèi)釋入血漿時因肽酶作用降解而形成。從細(xì)胞內(nèi)釋入血漿時因肽酶作用降解而形成。46二、分析方法二、分析方法 臨床同工酶的分析可分為兩步臨床同工酶的分析可分為兩步首先精確地分離出某酶的各同工酶組分首先精確地分離出某酶的各同工酶組分測定酶的總活性和各同工酶或亞型組分的活性測定酶的總活性和各同工酶或亞型組分的活性47二、分析方法二、分析方法（一）電泳法（一）電泳法原理原理使用最為廣泛使用最為廣泛簡便、快速、

41、分離效果好、不破壞酶的天然構(gòu)象簡便、快速、分離效果好、不破壞酶的天然構(gòu)象可分為：乙酸纖維素薄膜電泳、聚丙烯酰胺凝膠電可分為：乙酸纖維素薄膜電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳及毛細(xì)管電泳泳、等電聚焦電泳及毛細(xì)管電泳測定步驟為：區(qū)帶分離、活性顯色和檢測結(jié)果測定步驟為：區(qū)帶分離、活性顯色和檢測結(jié)果方法方法 同工酶氨基酸組成不同（一級結(jié)構(gòu)不同），同工酶氨基酸組成不同（一級結(jié)構(gòu)不同），pI不同，不同，電泳遷移率也就不同，電泳可將其分開。電泳遷移率也就不同，電泳可將其分開。48顯色染料顯色染料偶氮染料偶氮染料四唑鹽四唑鹽 離子型化合物，易溶于水，離子型化合物，易溶于水，難溶于一般的有機(jī)試劑，利用其難溶

42、于一般的有機(jī)試劑，利用其進(jìn)行的偶合反應(yīng)，生成不同顏色進(jìn)行的偶合反應(yīng)，生成不同顏色的偶氮色素進(jìn)行同工酶譜檢測的偶氮色素進(jìn)行同工酶譜檢測 受氫體作用，四唑鹽可被還原受氫體作用，四唑鹽可被還原成紫紅色的成紫紅色的formazan，常用的有：，常用的有：NBT、INT、MTT等。其中等。其中NBT使用最多。使用最多。掃描定量掃描定量光密度計(jì)光密度計(jì)熒光計(jì)熒光計(jì)P16349（二）色譜法（二）色譜法 柱色譜法柱色譜法離子交換色譜離子交換色譜親和色譜親和色譜商品化微型色譜柱商品化微型色譜柱50（三）免疫分析法（三）免疫分析法免疫抑制法免疫抑制法免疫沉淀法免疫沉淀法其它免疫學(xué)方法其它免疫學(xué)方法 利用同工酶利用

43、同工酶的一種亞基與相的一種亞基與相應(yīng)抗體結(jié)合后，應(yīng)抗體結(jié)合后，酶活性受到抑制，酶活性受到抑制，測定加與不加抗測定加與不加抗體前后樣品中酶體前后樣品中酶活性的變化活性的變化 利用分離提純的同工酶作抗原制備的利用分離提純的同工酶作抗原制備的抗體與含該型同工酶的待測樣品混合，在抗體與含該型同工酶的待測樣品混合，在一定條件下抗原抗體復(fù)合物形成沉淀，離一定條件下抗原抗體復(fù)合物形成沉淀，離心后測定上清液中其它型別的酶活性，將心后測定上清液中其它型別的酶活性，將加入抗體前測得的總活性減去上清液酶活加入抗體前測得的總活性減去上清液酶活性，即可求出被沉淀的同工酶的活性。性，即可求出被沉淀的同工酶的活性。免疫電泳

44、、免疫電泳、RIA、EIA和和CLIA51（四）動力學(xué)分析法（四）動力學(xué)分析法 底物特異性分析法底物特異性分析法 抑制劑分析法抑制劑分析法 pH分析法分析法 熱失活分析法熱失活分析法（五）蛋白酶水解法（五）蛋白酶水解法52三、同工酶檢測意義三、同工酶檢測意義提高酶診斷的特異性提高酶診斷的特異性提高診斷的靈敏度提高診斷的靈敏度對某些疾病的預(yù)后有評價價值對某些疾病的預(yù)后有評價價值 有些同工酶有明顯的組織有些同工酶有明顯的組織分布和細(xì)胞內(nèi)定位差異分布和細(xì)胞內(nèi)定位差異 有些同工酶的變化可在總有些同工酶的變化可在總酶變化之前發(fā)生酶變化之前發(fā)生線粒體酶的測定線粒體酶的測定53第第 五節(jié)五節(jié) 臨床常用血清酶

45、分析臨床常用血清酶分析 54一、轉(zhuǎn)氨酶（一、轉(zhuǎn)氨酶（ Aminotransferases ）及其同工酶）及其同工酶丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (Alanine aminotransferases，ALT) / 谷丙轉(zhuǎn)氨酶谷丙轉(zhuǎn)氨酶 GPT天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (Aspartate aminotransferases，AST/ 谷草轉(zhuǎn)氨酶谷草轉(zhuǎn)氨酶 GOT1.催化反應(yīng)催化反應(yīng)L-丙氨酸丙氨酸-酮戊二酸酮戊二酸 -丙酮酸丙酮酸 L-谷氨酸谷氨酸L-天冬氨酸天冬氨酸-酮戊二酸酮戊二酸 -草酰乙酸草酰乙酸 L-谷氨酸谷氨酸ALTAST 兩種酶均需要磷酸吡哆醛（兩種酶均需要磷酸吡哆

46、醛（VitB6）為輔基，不含）為輔基，不含磷酸吡哆醛的酶蛋白為脫輔基酶蛋白，無催化活性。磷酸吡哆醛的酶蛋白為脫輔基酶蛋白，無催化活性。552.組織分布組織分布 ALT大量存在于肝組織大量存在于肝組織，其次為腎、心、骨骼肌等。，其次為腎、心、骨骼肌等。其有兩種活性同工酶，其有兩種活性同工酶，(ALTs)、(ALTm)，分別存在細(xì)，分別存在細(xì)胞質(zhì)及線粒體中。肝細(xì)胞中胞質(zhì)及線粒體中。肝細(xì)胞中ALT大多存在細(xì)胞質(zhì)，少量在大多存在細(xì)胞質(zhì)，少量在線粒體，肝細(xì)胞壞死時血清中以線粒體，肝細(xì)胞壞死時血清中以ALTs為主。為主。 AST存在多種器官，按含量多少為存在多種器官，按含量多少為心心、肝、肝、骨骼肌和骨骼

47、肌和腎。其有兩種同工酶腎。其有兩種同工酶ASTs、ASTm，分別存在細(xì)胞質(zhì)及線，分別存在細(xì)胞質(zhì)及線粒體中。細(xì)胞輕度損傷粒體中。細(xì)胞輕度損傷ASTs顯著升高，而嚴(yán)重?fù)p傷時顯著升高，而嚴(yán)重?fù)p傷時ASTm 大量出現(xiàn)于血清中。血中大量出現(xiàn)于血清中。血中AST升高多來自心臟或肝升高多來自心臟或肝臟損傷。臟損傷。563.標(biāo)本標(biāo)本 溶血標(biāo)本不能用于檢測溶血標(biāo)本不能用于檢測 宜用血清，宜用血清，4 冰箱中可貯存冰箱中可貯存1星期，活性無明顯改變。星期，活性無明顯改變。4.臨床意義臨床意義 ALT是反映肝損傷的一個靈敏指標(biāo)是反映肝損傷的一個靈敏指標(biāo) 急性肝炎早期升高，急性肝炎早期升高，ALTAST； 急性肝炎恢

48、復(fù)指標(biāo)急性肝炎恢復(fù)指標(biāo) Deritis比值可用于肝炎診斷、鑒別診斷及判斷轉(zhuǎn)歸比值可用于肝炎診斷、鑒別診斷及判斷轉(zhuǎn)歸 酶膽分離是肝細(xì)胞壞死先兆酶膽分離是肝細(xì)胞壞死先兆57 AST主要用于肝臟疾病的診斷主要用于肝臟疾病的診斷 AMI發(fā)病發(fā)病6-8h即升高，即升高，48-60h達(dá)高峰，達(dá)高峰，4-5d恢復(fù)正常?；謴?fù)正常。由于由于AST在在AMI時升高遲于時升高遲于CK，恢復(fù)早于，恢復(fù)早于LD，故目前診，故目前診斷斷AMI價值不大。價值不大。 急性肝炎，急性肝炎，AST升高程度不及升高程度不及ALT；慢性肝炎，特別肝；慢性肝炎，特別肝硬化、慢性活動性肝炎時，硬化、慢性活動性肝炎時，AST升高程度超過升

49、高程度超過ALT。58二、二、 -谷氨酰轉(zhuǎn)移酶及其同工酶谷氨酰轉(zhuǎn)移酶及其同工酶-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶谷氨酰轉(zhuǎn)移酶 （ - glutamyl transpeptid, - GT/GGT） 1. 催化反應(yīng)催化反應(yīng)又稱：又稱：-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶 （ -GTP/GGTP) 一種含巰基的線粒體酶一種含巰基的線粒體酶，可催化，可催化-谷氨?；鶑墓劝滨；鶑腉SH或其或其它含它含-谷氨?；衔镏修D(zhuǎn)移至另一肽或氨基酸分子上。谷氨?；衔镏修D(zhuǎn)移至另一肽或氨基酸分子上。 GSH氨基酸氨基酸 -谷氨酰氨基酸半胱氨酰甘氨酸谷氨酰氨基酸半胱氨酰甘氨酸GGT59 2. 組織分布組織分布 腎臟中含量最多，其次為胰、肺、肝

50、等。血清中的腎臟中含量最多，其次為胰、肺、肝等。血清中的GGT主要來自肝膽。主要來自肝膽。 3. 標(biāo)本標(biāo)本 GGT較穩(wěn)定，室溫下可放置較穩(wěn)定，室溫下可放置2d， 4可存放可存放1w1w， -20可儲存可儲存1y1y；RBCRBC中幾乎無中幾乎無GGTGGT，因此溶血標(biāo)本可以檢，因此溶血標(biāo)本可以檢測。測。604. 臨床意義臨床意義 有助肝膽疾病的鑒別診斷有助肝膽疾病的鑒別診斷 與與ALP聯(lián)合進(jìn)行肝臟疾病檢測聯(lián)合進(jìn)行肝臟疾病檢測 膽道疾病，膽道疾病，GGT陽性陽性率高，而且升高明顯，可高達(dá)率高，而且升高明顯，可高達(dá)5-30ULN，肝實(shí)質(zhì)疾病是，肝實(shí)質(zhì)疾病是GGT一般只是中度升高，可達(dá)一般只是中度升

51、高，可達(dá)2-5ULN。 若若ALP升高而升高而GGT正正常，則完全排除常，則完全排除ALP的肝的肝來源，若來源，若ALP和和GGT都增都增加，則應(yīng)先排除肝外引起加，則應(yīng)先排除肝外引起GGT增加的原因，一旦排增加的原因，一旦排除，則除，則GGT增高為肝病所增高為肝病所致。致。(1) 肝膽疾病檢出陽性率最高的酶肝膽疾病檢出陽性率最高的酶 (2) 用于判斷惡性腫瘤有無肝轉(zhuǎn)移用于判斷惡性腫瘤有無肝轉(zhuǎn)移 (3) 乙醇、巴比妥類藥物等可誘導(dǎo)乙醇、巴比妥類藥物等可誘導(dǎo)GGT的升高。的升高。P168 61三、三、 肌酸激酶及其同工酶和亞型肌酸激酶及其同工酶和亞型肌酸激酶肌酸激酶 （creatine kinas

52、e，CK）1. 催化反應(yīng)催化反應(yīng) CK催化肌酸和催化肌酸和ATP或磷酸肌酸和或磷酸肌酸和ADP之間的磷酸轉(zhuǎn)移之間的磷酸轉(zhuǎn)移的可逆性反應(yīng)，的可逆性反應(yīng)，所產(chǎn)生的磷酸肌酸含高能磷酸鍵，是肌肉收所產(chǎn)生的磷酸肌酸含高能磷酸鍵，是肌肉收縮時能量的直接來源。縮時能量的直接來源。 磷酸肌酸磷酸肌酸ADP 肌酸肌酸ATPCK622. 組織分布組織分布 廣泛分布于全身，在骨骼肌含量最高，其次是心肌和腦。廣泛分布于全身，在骨骼肌含量最高，其次是心肌和腦。CK由兩種不同亞基（由兩種不同亞基（M，B）組成的二聚體，細(xì)胞質(zhì)中存在）組成的二聚體，細(xì)胞質(zhì)中存在三種同工酶：三種同工酶：CK-BB(CK1)、CK-MB(CK2

53、)、CK-MM(CK3)，線粒體中存在線粒體中存在CK-Mt(CK4)，其電泳速率最慢。，其電泳速率最慢。 CK同工酶又可分為不同亞型，同工酶又可分為不同亞型，CK-MM有三種亞型，有三種亞型，CK-MM1，CK-MM2，CK-MM3，電泳速率依次減慢；，電泳速率依次減慢；CK-MB有有CK-MB2和和CK-MB1兩種亞型。兩種亞型。3. 標(biāo)本標(biāo)本 不得用溶血標(biāo)本，不得用溶血標(biāo)本，RBC中含有中含有AK，可干擾測定，可干擾測定，引起測定值偏高；測定樣品宜用血清或肝素抗凝血漿，引起測定值偏高；測定樣品宜用血清或肝素抗凝血漿，其它抗凝劑都抑制其它抗凝劑都抑制CK活性。活性。63 4. 臨床意義臨床

54、意義 CK及其同工酶和亞型是目前臨床上測定次數(shù)最多的及其同工酶和亞型是目前臨床上測定次數(shù)最多的酶之一，主要用于心肌、骨骼肌和腦疾患的診斷。酶之一，主要用于心肌、骨骼肌和腦疾患的診斷。 (1) AMI的早期診斷的早期診斷總總CK在在AMI診斷中意義不大診斷中意義不大CK-MB為診斷為診斷AMI的金指標(biāo)的金指標(biāo)CK-MM3/CK-MM11.0為診斷為診斷AMI的標(biāo)準(zhǔn)（排除急性骨骼肌損傷）的標(biāo)準(zhǔn)（排除急性骨骼肌損傷）CK-MB21.9U/L或或CK-MB2/CK-MB11.5為診斷為診斷AMI的標(biāo)準(zhǔn)之一的標(biāo)準(zhǔn)之一 (2) 全身疾病特別是肌肉疾病時，全身疾病特別是肌肉疾病時，CK極度升高極度升高64四

55、、乳酸脫氫酶及其同工酶和亞型四、乳酸脫氫酶及其同工酶和亞型乳酸脫氫酶乳酸脫氫酶 （lactate dehydrogenase，LD/LDH） 1. 催化反應(yīng)催化反應(yīng) LD催化乳酸氧化成丙酮酸，同時將氫轉(zhuǎn)移給輔酶而成催化乳酸氧化成丙酮酸，同時將氫轉(zhuǎn)移給輔酶而成為為NADH，依條件不同而有可逆性。，依條件不同而有可逆性。 L-乳酸乳酸NAD+ 丙酮酸丙酮酸NADHH+pH8.89.8Ph7.47.865 2. 組織分布組織分布 LD是一種含鋅的糖酵解酶，廣泛存在于人體各組織中，以是一種含鋅的糖酵解酶，廣泛存在于人體各組織中，以肝、心肌、腎、肌肉、肝、心肌、腎、肌肉、RBC含量最高。含量最高。 LD

56、是由兩種不同亞基（是由兩種不同亞基（M和和H）組成的四聚體，形成）組成的四聚體，形成5種結(jié)種結(jié)構(gòu)不同的同工酶，即構(gòu)不同的同工酶，即LD1(H4)，LD2(H3M)，LD3(H2M2)，LD4(HM3)和和LD5(M4)。 1.以以LD1為主，主要在心肌，可占總為主，主要在心肌，可占總LD活性活性50以上，以上，也存在于也存在于RBC內(nèi)；內(nèi)； 2.以以LD5為主，以橫紋肌為代表，肝臟中也有；為主，以橫紋肌為代表，肝臟中也有； 3.以以LD3為主，存在于脾肺。為主，存在于脾肺。 一般成年人血中一般成年人血中LD同工酶存在如下規(guī)律：同工酶存在如下規(guī)律：LD2LD1LD3LD4LD5，部分正常兒童血中

57、可見，部分正常兒童血中可見LD1LD2。663. 標(biāo)本標(biāo)本 一般用血清，用血漿需離心去除血小板（血小板中含一般用血清，用血漿需離心去除血小板（血小板中含有大量的有大量的LD），采血后迅速分離血清；因），采血后迅速分離血清；因RBC中中LD含量含量比血清高比血清高100倍以上，倍以上，不宜用溶血標(biāo)本。不宜用溶血標(biāo)本。 LD4、LD5宜冷變性，不應(yīng)放在冰箱中宜冷變性，不應(yīng)放在冰箱中，25 放放2-3d，LD活性變化不大?；钚宰兓淮?。674. 臨床意義臨床意義 亞急性心肌梗死診斷有一定價值，但其特異性差；亞急性心肌梗死診斷有一定價值，但其特異性差； (1) 診斷心臟疾病診斷心臟疾病 心肌梗死和心肌

58、炎時以心肌梗死和心肌炎時以LD1和和LD2升高為主，大多升高為主，大多數(shù)數(shù)AMI患者血中會出現(xiàn)患者血中會出現(xiàn)“反轉(zhuǎn)比率反轉(zhuǎn)比率”，即，即LD1LD2； (2) 診斷肝臟疾病診斷肝臟疾病 肝細(xì)胞損傷時常出現(xiàn)肝細(xì)胞損傷時常出現(xiàn)LD5LD4; 急性肝炎時急性肝炎時LD1LD2相對下降，相對下降，LD5升高；慢性肝升高；慢性肝炎時炎時LD5升高，且升高，且LD1LD3； (3) 診斷骨骼肌疾病診斷骨骼肌疾病 骨骼肌損傷時常出現(xiàn)骨骼肌損傷時常出現(xiàn)LD5LD4;68五、堿性磷酸酶及其同工酶五、堿性磷酸酶及其同工酶堿性磷酸酶堿性磷酸酶 （alkaline phosphatase，ALP/AKP）1. 催化反

59、應(yīng)催化反應(yīng) 一種含鋅的糖蛋白，在堿性環(huán)境中（一種含鋅的糖蛋白，在堿性環(huán)境中（pH10.0）可以水）可以水解各種天然及人工合成的磷酸單酯化合物。解各種天然及人工合成的磷酸單酯化合物。2. 組織分布組織分布 ALP廣泛存在于各組織器官中，其含量以肝臟為最多，廣泛存在于各組織器官中，其含量以肝臟為最多，其次為腎、胎盤、小腸和骨骼等。血清中的其次為腎、胎盤、小腸和骨骼等。血清中的ALP主要來自主要來自肝臟和骨骼。肝臟和骨骼。 生長期兒童血清內(nèi)生長期兒童血清內(nèi)ALP主要來自成骨母細(xì)胞和生長中主要來自成骨母細(xì)胞和生長中的骨軟骨細(xì)胞，少量來自肝。的骨軟骨細(xì)胞，少量來自肝。69 3. 標(biāo)本標(biāo)本 空腹采血空腹采

60、血，避免脂肪餐的影響；樣品用血清，避免脂肪餐的影響；樣品用血清，不能用不能用明顯溶血標(biāo)本明顯溶血標(biāo)本；在室溫或冰箱放置，活性逐漸升高，可增；在室溫或冰箱放置，活性逐漸升高，可增加加5-10，應(yīng)在采血當(dāng)日測定。，應(yīng)在采血當(dāng)日測定。 4. 臨床意義臨床意義 很多骨骼疾病如變形性骨炎等患者血中很多骨骼疾病如變形性骨炎等患者血中ALP升高，我升高，我國常用于早期診斷佝僂病和軟骨病。國常用于早期診斷佝僂病和軟骨病。 (1) 診斷骨骼性疾病診斷骨骼性疾病 (2)診斷肝膽系統(tǒng)疾病，尤其是黃疸診斷肝膽系統(tǒng)疾病，尤其是黃疸 急性肝炎時急性肝炎時ALP增高達(dá)增高達(dá)2-5ULN，肝硬化、膽石癥和，肝硬化、膽石癥和腫