基因工程的操作程序1

1、3.基因的載體基因的載體“分子運輸車分子運輸車”載體必須具備的條件：載體必須具備的條件： 能夠在宿主細胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存；能夠在宿主細胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存； 具有一個或多個限制酶切點，以便與外源基因具有一個或多個限制酶切點，以便與外源基因連接；連接； 具有某些標記基因，便于進行篩選。（如抗菌具有某些標記基因，便于進行篩選。（如抗菌素的抗性基因、產(chǎn)物具有顏色反應(yīng)的基因等素的抗性基因、產(chǎn)物具有顏色反應(yīng)的基因等 ） 對受體細胞無害對受體細胞無害作用：作用： 將外源基因轉(zhuǎn)移到受體細胞中去。將外源基因轉(zhuǎn)移到受體細胞中去。 利用運載體在受體細胞內(nèi)，對外源基因進行大量復(fù)制。利用運載體在受體細胞內(nèi)，對外源基

2、因進行大量復(fù)制。常用的載體有：常用的載體有： 質(zhì)粒，質(zhì)粒，噬菌體的衍生物，動植物病毒等噬菌體的衍生物，動植物病毒等質(zhì)粒 質(zhì)粒是基因工質(zhì)粒是基因工程程最常用最常用的運載體，的運載體，它它廣泛地存在于細廣泛地存在于細菌中菌中,酵母菌中也有酵母菌中也有分布分布，是一種裸露，是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、獨的、結(jié)構(gòu)簡單、獨立于細菌擬核立于細菌擬核DNA之外，并具有自我之外，并具有自我復(fù)制能力的小型環(huán)復(fù)制能力的小型環(huán)狀狀DNA分子。分子。要對天然質(zhì)粒進行人工改造要對天然質(zhì)粒進行人工改造能復(fù)制并帶著能復(fù)制并帶著插入的目的基插入的目的基因一起復(fù)制因一起復(fù)制有切割位點有切割位點有有標記標記基因基因的存在，將的存在，

3、將來可用來可用含青含青霉素霉素的培養(yǎng)的培養(yǎng)基基鑒別鑒別。質(zhì)粒1 1、原核細胞的基因結(jié)構(gòu)、原核細胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 與與RNARNA聚合酶結(jié)合位點聚合酶結(jié)合位點啟動子啟動子終止子終止子終止子終止子: DNA分子中終止轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列。分子中終止轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列。 啟動子：啟動子：是是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。RNARNA聚合酶聚合酶: :能夠識別啟動子上結(jié)合位點的一種蛋能夠識別啟動子上結(jié)合位點的一種蛋白質(zhì)，且能聚合轉(zhuǎn)錄所形成的白質(zhì)，

4、且能聚合轉(zhuǎn)錄所形成的mRNAmRNA。 RNA RNA聚合酶能夠識別調(diào)控序列中的結(jié)合位點，聚合酶能夠識別調(diào)控序列中的結(jié)合位點，并與其結(jié)合。并與其結(jié)合。 轉(zhuǎn)錄開始后，轉(zhuǎn)錄開始后，RNARNA聚合酶沿聚合酶沿DNADNA分子移動，并分子移動，并以以DNADNA分子的一條鏈為模板合成分子的一條鏈為模板合成RNARNA。 轉(zhuǎn)錄完畢后，轉(zhuǎn)錄完畢后，RNARNA鏈釋放出來，緊接著鏈釋放出來，緊接著RNARNA聚聚合酶也從合酶也從DNADNA模板鏈上脫落下來。模板鏈上脫落下來。不能轉(zhuǎn)錄為信使不能轉(zhuǎn)錄為信使RNARNA，不能，不能 編碼蛋白質(zhì)。編碼蛋白質(zhì)。：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使RNARNA，能，

5、能 編碼蛋白質(zhì)編碼蛋白質(zhì) 編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)原核原核細胞細胞的的 基因基因結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)有調(diào)控遺傳信息表達的核有調(diào)控遺傳信息表達的核 苷酸序列苷酸序列. .包括啟動子和終止子包括啟動子和終止子非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 啟動子啟動子終止子終止子2 2、真核細胞的基因結(jié)構(gòu)、真核細胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與與RNARNA聚合酶聚合酶結(jié)合位點結(jié)合位點內(nèi)含子內(nèi)含子 外顯子外顯子 能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子 不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子含子啟動

6、子啟動子終止子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 內(nèi)含子：內(nèi)含子： 外顯子：外顯子： 真核真核細胞細胞的的 基因基因結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列非編碼序列：非編碼序列： 包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子上游：上游：下游：下游：啟動子啟動子終止子終止子原核細胞原核細胞真核細胞真核細胞不同點不同點編碼區(qū)是編碼區(qū)是_的的編碼區(qū)是間隔的、編碼區(qū)是間隔的、_的的相同點相同點都由能夠編碼蛋白質(zhì)的都由能夠編碼蛋白質(zhì)的_和具和具有調(diào)控作用的有調(diào)控作用的_區(qū)組成的區(qū)組成的3

7、3、原核細胞與真核細胞的基因結(jié)構(gòu)比較、原核細胞與真核細胞的基因結(jié)構(gòu)比較思思考考編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核細胞與真核細胞基因結(jié)構(gòu)一樣長嗎？細胞與真核細胞基因結(jié)構(gòu)一樣長嗎？連續(xù)連續(xù)不連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼非編碼注意：終止子與終止密碼的區(qū)別注意：終止子與終止密碼的區(qū)別1、終止子是、終止子是DNA分子上決定轉(zhuǎn)錄停止分子上決定轉(zhuǎn)錄停止的一段的一段DNA序列，其組成單位是脫氧核序列，其組成單位是脫氧核苷酸苷酸2、終止密碼子是指、終止密碼子是指mRNA分子上決定分子上決定翻譯停止的三個相鄰堿基，其組成單位翻譯停止的三個相鄰堿基，其組成單位是核糖核苷酸是核糖核苷酸如

8、何讓大腸桿菌生產(chǎn)胰島素？如何讓大腸桿菌生產(chǎn)胰島素？1.2 1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序基因工程基本操作的四個步驟基因工程基本操作的四個步驟1 1、目的基因的獲取、目的基因的獲取2 2、基因表達載體的構(gòu)建、基因表達載體的構(gòu)建3 3、將目的基因?qū)胧荏w細胞、將目的基因?qū)胧荏w細胞4 4、目的基因的檢測與鑒定、目的基因的檢測與鑒定一、目的基因的獲取一、目的基因的獲取( (一一) )、目的基因是指、目的基因是指_編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因和編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因和一些具有調(diào)控作用的因子一些具有調(diào)控作用的因子請舉出三個以上的例子請舉出三個以上的例子（二）、獲取目的基因的常用方法有哪些（二

9、）、獲取目的基因的常用方法有哪些? ?1 1、從基因文庫中獲取、從基因文庫中獲取2 2、利用、利用PCRPCR技術(shù)擴增技術(shù)擴增3 3、人工合成、人工合成1 1、從基因文庫中獲取目的基因、從基因文庫中獲取目的基因 將含有某種生物不同基因的許多將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不同各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫基因，稱為基因文庫（2）基因文庫的種類）基因文庫的種類 基因組文庫：基因組文庫：含有一種生物的所有基因含有一種生物的所有基因部分基因文庫：如：部分基因文庫：如：cDNA文庫）：文庫）：含有

10、一種生物的部分基因含有一種生物的部分基因（1 1）. .基因文庫基因文庫基因組文庫的構(gòu)建基因組文庫的構(gòu)建（3 3）. .基因文庫的構(gòu)建方法基因文庫的構(gòu)建方法通過對受通過對受體菌的培體菌的培養(yǎng)而儲存養(yǎng)而儲存基因基因 cDNA文庫的構(gòu)文庫的構(gòu)建建-反轉(zhuǎn)錄法：反轉(zhuǎn)錄法： 以目的基因轉(zhuǎn)以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使錄成的信使RNARNA為模為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補板，反轉(zhuǎn)錄成互補的單鏈的單鏈DNADNA，然后在，然后在酶的作用下合成雙酶的作用下合成雙鏈鏈DNADNA，從而獲得所，從而獲得所需的基因。需的基因。目的基因的目的基因的mRNAmRNA單鏈單鏈DNADNA反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶DNADNA聚合酶聚合酶雙鏈雙鏈D

11、NADNA( (目的基因目的基因) )cDNAcDNA文庫的構(gòu)建文庫的構(gòu)建mRNA 反轉(zhuǎn)錄cDNA(互補DNA） DNA聚合酶聚合酶雙鏈DNA反轉(zhuǎn)錄法：反轉(zhuǎn)錄法：基因重組基因重組反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶mRNAmRNAcDNAcDNA基因組文庫和部分基因組文庫基因組文庫和部分基因組文庫(cDNA文庫文庫)比較比較怎樣從基因文庫中得怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基到我們所需的目的基因呢因呢? ?依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列如：根據(jù)基因的核苷酸序列 基因的功能基因的功能 基因在染色體上的位置基因在染色體上的位置 基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNAmRN

12、A 基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性從基因文庫中得到目的基因的方法從基因文庫中得到目的基因的方法2 2、利用、利用PCRPCR技術(shù)擴增目的基因技術(shù)擴增目的基因DNA變性（變性（90-95）退火退火（復(fù)性（復(fù)性55-60） 延伸延伸（70-75） 概念：概念：PCRPCR全稱為全稱為_，是一項，是一項 在生物在生物_復(fù)制復(fù)制_的核酸合成技術(shù)的核酸合成技術(shù) 條件：條件：_、 _、_ _ 、 _._.原理：原理：_方式：以方式：以_方式擴增，即方式擴增，即_（n n為擴增為擴增循循 環(huán)的次數(shù)）環(huán)的次數(shù)）結(jié)果：結(jié)果：多聚酶鏈式反應(yīng)多聚酶鏈式反應(yīng)體外體外特定特定DNADNA片段片段DNA

13、DNA雙鏈復(fù)制雙鏈復(fù)制已知目的基因的核苷酸序列已知目的基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸一對引物一對引物耐熱的耐熱的DNADNA聚合酶聚合酶指數(shù)指數(shù)2 2n n使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增過程：過程：a a、DNADNA變性變性（90-9590-95）：雙鏈）：雙鏈DNADNA模板模板 在熱作用下，在熱作用下，_斷裂，形成斷裂，形成_b b、退火、退火（復(fù)性復(fù)性55-6555-65）：系統(tǒng)溫度降低，）：系統(tǒng)溫度降低，引引 物物與與DNADNA模板結(jié)合，形成局部模板結(jié)合，形成局部_。 c c、延伸、延伸（70-7570-75）：在）：

14、在TaqTaq酶酶的作用下，的作用下，合成與模板互補的合成與模板互補的_。 氫鍵氫鍵單鏈單鏈DNADNA雙鏈雙鏈DNADNA鏈鏈d d、多次重復(fù)、多次重復(fù)3 3、人工合成、人工合成適用于基因比較小，核苷酸序列已知的基因適用于基因比較小，核苷酸序列已知的基因 注意：注意：該過程不需要復(fù)制的模板該過程不需要復(fù)制的模板注意：注意： 1、PCR技術(shù)擴增目的基因與技術(shù)擴增目的基因與DNA復(fù)制的比較復(fù)制的比較（名師（名師7頁）頁）2、特別提醒、特別提醒7頁頁3、規(guī)律方法：、規(guī)律方法：7頁頁二、基因表達載體的構(gòu)建二、基因表達載體的構(gòu)建 基因工程的核心基因工程的核心1、目的：、目的：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定

15、存在，使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。的基因能夠表達和發(fā)揮作用。2.2.基因表達載體的組成：基因表達載體的組成：目的基因目的基因+ +啟動子啟動子+ +終止子終止子+ +標記基因標記基因它們各自的作用是它們各自的作用是什么什么? ? 目的基因：目的基因：外源外源DNA分子的有效片分子的有效片段段啟動子啟動子位置：位置：功能：功能：基因的基因的首端首端是是RNARNA聚合酶識別聚合酶識別和結(jié)合的部位和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出出mRNAmRNA終止子終止子位置：位置：功能：功能：基因的基因的尾端尾端

16、終止轉(zhuǎn)錄終止轉(zhuǎn)錄標記基因：標記基因：鑒別鑒別受體細胞受體細胞中是否含有目中是否含有目的基因的基因目的基因：目的基因：外源外源DNA分子的有效片段分子的有效片段啟動子：啟動子：位于基因的首端位于基因的首端的一段特殊的的一段特殊的DNADNA片斷，它片斷，它是是RNARNA聚合酶識別和結(jié)合的聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能部位，有了它才能驅(qū)動基驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出因轉(zhuǎn)錄出mRNAmRNA，最終獲得，最終獲得蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)終止子：終止子：位于基因的位于基因的尾端的一段特殊的尾端的一段特殊的DNADNA片斷，片斷，能終止能終止mRNAmRNA的的轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄標記基因標記基因的作用是的作用是為為了了鑒別鑒別受體細

17、胞中是受體細胞中是否含有目的基因，從否含有目的基因，從而將有目的基因的細而將有目的基因的細胞篩選出來胞篩選出來（1 1）. .用一定的用一定的_切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切 口，露出口，露出_。（2 2）. .用用_切切斷目的基因，使其產(chǎn)生斷目的基因，使其產(chǎn)生_ （3 3）. .將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的_ _處，再加入適量處，再加入適量_，形成了一個重組，形成了一個重組 DNADNA分子（重組質(zhì)粒）分子（重組質(zhì)粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一種限制酶同一種限制酶切口切口DNADNA連接酶連接酶相同相同的黏性末端的黏性末端3.3.構(gòu)建過

18、程構(gòu)建過程: :取質(zhì)粒取質(zhì)粒取取DNADNA分子分子限制酶處理限制酶處理一個切口一個切口兩個黏性末端兩個黏性末端兩個切口兩個切口獲得目的基因獲得目的基因DNADNA連接酶連接酶重組重組DNADNA分子（重組質(zhì)粒）分子（重組質(zhì)粒）同一種同一種？同一種同一種GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG如何防止自身環(huán)化呢如何防止自身環(huán)化呢 GAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAG AATTCCTTAAGAG ATCTTCTAG AGC T T

19、A AAT C T A GA A T T CGG A T C TAGC T T A AAT C T A GA A T T CGG A T C TAGCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAAATTCGATCTAGAATTCGGATCTA優(yōu)勢：防止目的基因、質(zhì)粒的自身環(huán)化優(yōu)勢：防止目的基因、質(zhì)粒的自身環(huán)化 使目的基因和質(zhì)粒定向連接使目的基因和質(zhì)粒定向連接結(jié)論：不同的限制酶也可產(chǎn)生相同的黏性末端。結(jié)論：不同的限制酶也可產(chǎn)生相同的黏性末端。 GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC GATCTAG GATCT AGGATCTCCTAGA不同的酶能切出相同的

20、黏性末端嗎？不同的酶能切出相同的黏性末端嗎？構(gòu)建基因表達載體需要考慮的因素構(gòu)建基因表達載體需要考慮的因素7頁頁特別提醒特別提醒7頁頁練習練習7頁例頁例2載體載體與與表達載體表達載體的區(qū)別：二者都有標記基因的區(qū)別：二者都有標記基因和復(fù)制原點兩部分和復(fù)制原點兩部分DNADNA片段。表達載體在載體片段。表達載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動子、終止子三部基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結(jié)構(gòu)分結(jié)構(gòu)用到的工具酶：用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又既用到限制酶切割載體，又用到用到DNADNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵酶作用的

21、化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵啟動子、終止子啟動子、終止子對于目的基因表達必不可少對于目的基因表達必不可少目的基因不能單獨進入受體細胞，目的基因不能單獨進入受體細胞，必需以表必需以表達載體的方式攜帶進去。達載體的方式攜帶進去。注意注意三、將目的基因?qū)胧荏w細胞三、將目的基因?qū)胧荏w細胞1 1、轉(zhuǎn)化：、轉(zhuǎn)化： 2 2、方法、方法將目的基因?qū)雽⒛康幕驅(qū)胫参锛毎参锛毎麑⒛康幕驅(qū)雽⒛康幕驅(qū)雱游锛毎麆游锛毎麑⒛康幕驅(qū)雽⒛康幕驅(qū)胛⑸锛毎⑸锛毎r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法基因槍法花粉管通道法花粉管通道法顯微注射法顯微注射法Ca2+處理法處理法目的基因進入目的基因進入_內(nèi)，并且在內(nèi)，并

22、且在 受體細胞內(nèi)維持受體細胞內(nèi)維持_和和_的過程的過程受體細胞受體細胞穩(wěn)定穩(wěn)定表達表達 （1 1）將目的基因?qū)胫参锛毎姆椒ǎ海⒛康幕驅(qū)胫参锛毎姆椒ǎ恨r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌介紹：農(nóng)桿菌介紹：原核生物，自然條件下易感染雙子葉植物和裸子原核生物，自然條件下易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力，對植植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力，對植物分泌的酚類物質(zhì)有物分泌的酚類物質(zhì)有“趨化性趨化性”。利用農(nóng)桿菌利用農(nóng)桿菌TiTi質(zhì)粒上的質(zhì)粒上的T-DNAT-DNA（可轉(zhuǎn)移的（可轉(zhuǎn)移的DNADNA），），構(gòu)建基因表達載體，然后導(dǎo)入農(nóng)桿菌，再讓農(nóng)桿構(gòu)建基因表達載體，然后導(dǎo)

23、入農(nóng)桿菌，再讓農(nóng)桿菌感染植物細胞菌感染植物細胞a a原理：原理：b b優(yōu)點：優(yōu)點：遺傳性狀穩(wěn)定，成功率高。遺傳性狀穩(wěn)定，成功率高。 （目的基因直接插入植物染色體的（目的基因直接插入植物染色體的DNADNA上）上）基因槍法：基因槍法：花粉管通道法花粉管通道法將基因表達載體包裹于金屬顆粒表面，利用壓將基因表達載體包裹于金屬顆粒表面，利用壓縮氣體產(chǎn)生的動力將其送入受體細胞，（單子縮氣體產(chǎn)生的動力將其送入受體細胞，（單子葉植物常用該法，成本高。）葉植物常用該法，成本高。）在花粉管沒愈合之間，減去柱頭，滴加含目的基在花粉管沒愈合之間，減去柱頭，滴加含目的基因的因的DNADNA，使目的基因進入受體細胞，簡

24、單經(jīng)濟。，使目的基因進入受體細胞，簡單經(jīng)濟。（2 2）將目的基因?qū)雱游锛毎⒛康幕驅(qū)雱游锛毎椒ǎ猴@微注射法方法：顯微注射法程序：程序：（3 3）、將目的基因?qū)胛⑸锛毎?、將目的基因?qū)胛⑸锛毎松锾攸c：繁殖快、單細胞、遺傳物質(zhì)少原核生物特點：繁殖快、單細胞、遺傳物質(zhì)少方法：方法： 目的基因表達載體提純目的基因表達載體提純 取卵（受精卵）取卵（受精卵） 顯微注射顯微注射 移植進子宮移植進子宮 新性狀動物新性狀動物用用Ca2+處理細胞處理細胞 感受態(tài)細胞感受態(tài)細胞 表達載體與感表達載體與感受態(tài)細胞混合受態(tài)細胞混合 感受態(tài)細胞吸收感受態(tài)細胞吸收DNA分子分子( (四四) )目的基

25、因的檢測與鑒定目的基因的檢測與鑒定檢查是否成功檢查是否成功1 1、檢測、檢測(1)(1)檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNADNA上是否插入上是否插入了目的基因了目的基因A.首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNAB.將目的基因的將目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標片段用放射性同位素等作標記記,以此做探針以此做探針C.使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯示出雜若顯示出雜交帶交帶,表明目的基因已插入染色體表明目的基因已插入染色體DNA中中方法方法: :DNADNA分子雜交分子雜交過程過程:分子水平的分子水平的歸納步驟(2)(2)

26、檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNAmRNA(3)(3)檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)方法方法: :分分 子子 雜雜 交交方法方法: :抗原抗體雜交抗原抗體雜交過程過程:用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交雜交,若若出現(xiàn)雜交帶出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA.目的基因蛋白質(zhì)小鼠體內(nèi)抗體目的基因受體細胞蛋白質(zhì)抗原抗原雜交分子檢測目的基因是否檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)翻譯成蛋白質(zhì)-抗原抗體雜交抗原抗體雜交2 2、鑒定、鑒定抗蟲鑒定抗蟲鑒定抗病鑒定抗病鑒定活性鑒定活性鑒定用轉(zhuǎn)基因抗蟲作物飼喂相應(yīng)害蟲用

27、轉(zhuǎn)基因抗蟲作物飼喂相應(yīng)害蟲用相應(yīng)致病菌（或病毒）劑噴灑轉(zhuǎn)用相應(yīng)致病菌（或病毒）劑噴灑轉(zhuǎn)基因抗病作物基因抗病作物檢測相應(yīng)物質(zhì)是否有天然物質(zhì)的作檢測相應(yīng)物質(zhì)是否有天然物質(zhì)的作用用個體水平個體水平歸納步驟歸納: 基因工程的基本操作程序1.1. 獲取目的基因獲取目的基因u從基因文庫從基因文庫u利用利用PCRPCRu化學(xué)方法人工合成化學(xué)方法人工合成2.2. 構(gòu)建基因表達載體構(gòu)建基因表達載體u目的基因、啟動子、終止子、標記基因目的基因、啟動子、終止子、標記基因3.3. 將目的基因?qū)胧荏w細胞將目的基因?qū)胧荏w細胞u農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法4.4. 目的基因的檢測與鑒定目的基因的檢測

28、與鑒定u檢測：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯檢測：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯u鑒定：鑒定：1 1、目的基因的獲取、目的基因的獲取2 2、基因表達載體的構(gòu)建、基因表達載體的構(gòu)建3 3、將目的基因?qū)胧荏w細胞、將目的基因?qū)胧荏w細胞4 4、目的基因的檢測與鑒定、目的基因的檢測與鑒定核心核心該部沒涉及堿基該部沒涉及堿基互補配對原則互補配對原則總結(jié)：總結(jié)： 目的基因的檢測內(nèi)容和方法的比較目的基因的檢測內(nèi)容和方法的比較分子水平分子水平檢測檢測 具體方法具體方法技術(shù)名稱技術(shù)名稱首先要導(dǎo)入檢測（ ）利用（ ）與提取的（ ）雜交 其次要轉(zhuǎn)錄檢測： （ ）利用（ ）與提取的（ ）雜交 最后要翻譯檢測： （ ）利用（ ）與提取的

29、（ ）雜交轉(zhuǎn)基因生物的染轉(zhuǎn)基因生物的染色體色體DNA上是否上是否插入了目的基因插入了目的基因 目的基因是否轉(zhuǎn)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出錄出mRNA） 目的基因是否翻目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)譯成蛋白質(zhì) DNA探針探針 基因組基因組DNA DNA探針探針轉(zhuǎn)錄出的轉(zhuǎn)錄出的mRNA 相應(yīng)的抗體相應(yīng)的抗體 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) DNA分子分子雜交技術(shù)雜交技術(shù) 抗原抗原抗體抗體雜交技術(shù)雜交技術(shù) 分子雜交分子雜交技術(shù)技術(shù) 導(dǎo)入導(dǎo)入 = 表達表達 ？錯題重做（課時二第6題） 利用外源基因在受體細胞中表達，可生產(chǎn)人類所需要的產(chǎn)品。下列各項中能說明目的基因完成了在受體細胞中表達表達的是 A棉花二倍體細胞中檢測到細菌的抗蟲基因 B

30、.大腸桿菌中檢測到人胰島素基因及其mRNA C.山羊乳腺細胞中檢測到人生長激素DNA序列 D.酵母菌細胞中提取到人干擾素蛋白 D月考再現(xiàn)（2）用含重組質(zhì)粒的土壤農(nóng)桿菌感染植物細胞）用含重組質(zhì)粒的土壤農(nóng)桿菌感染植物細胞后，采用后，采用_ 技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因馬鈴薯技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的染色體的染色體DNA上是否上是否導(dǎo)入導(dǎo)入了目的基因，同時還了目的基因，同時還要采用要采用_ 技術(shù)檢測目的基因是否在技術(shù)檢測目的基因是否在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯細胞中轉(zhuǎn)基因馬鈴薯細胞中表達表達。如圖表示轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的培育過程，請回答相關(guān)問題：如圖表示轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的培育過程，請回答相關(guān)問題：DNA分子雜交分子雜交抗原抗原-抗體雜交抗體

31、雜交三、習題反饋三、習題反饋1下圖為下圖為DNA分子在不同酶的作用下所發(fā)生的變分子在不同酶的作用下所發(fā)生的變化，圖中依次表示限制性核酸內(nèi)切酶、化，圖中依次表示限制性核酸內(nèi)切酶、DNA聚合酶、聚合酶、DNA連接酶、解旋酶作用的正確順序是連接酶、解旋酶作用的正確順序是 ()A BC DC2下圖表示一項重要的生物技術(shù)，對下圖表示一項重要的生物技術(shù)，對圖中物質(zhì)圖中物質(zhì)a、b、c、d的描述，正確的是的描述，正確的是Aa的基本骨架是磷酸和核糖交替連接而成的結(jié)構(gòu)的基本骨架是磷酸和核糖交替連接而成的結(jié)構(gòu)B要獲得相同的黏性末端，可以用不同種要獲得相同的黏性末端，可以用不同種b切割切割a和和dCc連接雙鏈間的連接

32、雙鏈間的A和和T，使黏性末端處堿基互補配對，使黏性末端處堿基互補配對D若要獲得原核生物的若要獲得原核生物的d，則一般采用人工合成方法，則一般采用人工合成方法B3.(2010年高考天津理綜年高考天津理綜)下圖是培育表達人乳鐵蛋白的乳下圖是培育表達人乳鐵蛋白的乳腺生物反應(yīng)器的技術(shù)路線。圖中腺生物反應(yīng)器的技術(shù)路線。圖中tetR表示四環(huán)素抗性基表示四環(huán)素抗性基因，因，ampR表示氨芐青霉素抗性基因，表示氨芐青霉素抗性基因，BamH、Hind、Sma直線所示為三種限制酶的酶切位點。直線所示為三種限制酶的酶切位點。(1)圖中將人乳鐵蛋白基因插入載體，需用圖中將人乳鐵蛋白基因插入載體，需用_限制酶同時酶切載

33、體和人乳鐵蛋白基因。篩選含有重組載限制酶同時酶切載體和人乳鐵蛋白基因。篩選含有重組載體的大腸桿菌首先需要在含體的大腸桿菌首先需要在含_的培養(yǎng)基上進的培養(yǎng)基上進行。行。Hind 和和BamH 氨芐青霉素氨芐青霉素 3.(2010年高考天津理綜年高考天津理綜)下圖是培育表達人乳鐵蛋白的乳下圖是培育表達人乳鐵蛋白的乳腺生物反應(yīng)器的技術(shù)路線。圖中腺生物反應(yīng)器的技術(shù)路線。圖中tetR表示四環(huán)素抗性基表示四環(huán)素抗性基因，因，ampR表示氨芐青霉素抗性基因，表示氨芐青霉素抗性基因，BamH、Hind、Sma直線所示為三種限制酶的酶切位點。直線所示為三種限制酶的酶切位點。(2)能使人乳鐵蛋白基因在乳腺細胞中特

34、異性表達的調(diào)控能使人乳鐵蛋白基因在乳腺細胞中特異性表達的調(diào)控序列是序列是_(填字母代號填字母代號)。A啟動子啟動子BtetRC復(fù)制原點復(fù)制原點DampRA 3.(2010年高考天津理綜年高考天津理綜)下圖是培育表達人乳鐵蛋白的乳下圖是培育表達人乳鐵蛋白的乳腺生物反應(yīng)器的技術(shù)路線。圖中腺生物反應(yīng)器的技術(shù)路線。圖中tetR表示四環(huán)素抗性基表示四環(huán)素抗性基因，因，ampR表示氨芐青霉素抗性基因，表示氨芐青霉素抗性基因，BamH、Hind、Sma直線所示為三種限制酶的酶切位點。直線所示為三種限制酶的酶切位點。(3)過程過程可采用的操作方法是可采用的操作方法是_(填字母代號填字母代號)。A農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化農(nóng)桿

35、菌轉(zhuǎn)化B大腸桿菌轉(zhuǎn)化大腸桿菌轉(zhuǎn)化C顯微注射顯微注射 D細胞融合細胞融合c 3.(2010年高考天津理綜年高考天津理綜)下圖是培育表達人乳鐵蛋白的乳下圖是培育表達人乳鐵蛋白的乳腺生物反應(yīng)器的技術(shù)路線。圖中腺生物反應(yīng)器的技術(shù)路線。圖中tetR表示四環(huán)素抗性基表示四環(huán)素抗性基因，因，ampR表示氨芐青霉素抗性基因，表示氨芐青霉素抗性基因，BamH、Hind、Sma直線所示為三種限制酶的酶切位點。直線所示為三種限制酶的酶切位點。(4)為檢測人乳鐵蛋白是否成功表達，可采用為檢測人乳鐵蛋白是否成功表達，可采用_技技術(shù)。術(shù)。A核酸分子雜交核酸分子雜交 B基因序列分析基因序列分析C抗原抗原抗體雜交抗體雜交 D

36、PCRc 4、知識框架（概念圖）、知識框架（概念圖）目的基因插入細胞質(zhì)、插入細胞核問題目的基因插入細胞質(zhì)、插入細胞核問題黏性末端的確定問題黏性末端的確定問題切口問題切口問題基因治療基因治療1、如果用同一種限制酶切割目的基、如果用同一種限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，再用因和質(zhì)粒，再用DNA連接酶連接會連接酶連接會有怎樣的連接情況？有怎樣的連接情況？2、如果用雙酶切目的基因和質(zhì)、如果用雙酶切目的基因和質(zhì)粒會怎樣？粒會怎樣？ 圖為某種質(zhì)粒表達載體簡圖，小箭頭所指分別為圖為某種質(zhì)粒表達載體簡圖，小箭頭所指分別為限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶EcoR、BamH的酶切位點，的酶切位點，ampR為青霉素抗性基因，為青

37、霉素抗性基因，tctR為四環(huán)素抗性基因，為四環(huán)素抗性基因，P為啟動子，為啟動子，T為終止子，為終止子，ori為復(fù)制原點。已知目為復(fù)制原點。已知目的基因的兩端分別有包括的基因的兩端分別有包括EcoR、BamH在內(nèi)在內(nèi)的多種的酶切位點。的多種的酶切位點。（1）將含有目的基因的）將含有目的基因的DNA與質(zhì)粒表達載體分別與質(zhì)粒表達載體分別用用EcoR酶切，酶切產(chǎn)物用酶切，酶切產(chǎn)物用DNA連接酶進行連接連接酶進行連接后，其中由兩個后，其中由兩個DNA片段之間連接形成的產(chǎn)物片段之間連接形成的產(chǎn)物有有 、 、 三種。若要從這些連接產(chǎn)物中分三種。若要從這些連接產(chǎn)物中分離出重組質(zhì)粒，需要對這些連接產(chǎn)物進行分離純

38、離出重組質(zhì)粒，需要對這些連接產(chǎn)物進行分離純化化 。目的基因與載體連接物目的基因與載體連接物目的基因自連物目的基因自連物載體自連物載體自連物（2）用上述）用上述3種連接產(chǎn)物與無任何抗藥性的原核種連接產(chǎn)物與無任何抗藥性的原核宿主細胞進行轉(zhuǎn)化實驗。之后將這些宿主細胞接宿主細胞進行轉(zhuǎn)化實驗。之后將這些宿主細胞接種到含四環(huán)素的培養(yǎng)基中，能生長的原核宿主細種到含四環(huán)素的培養(yǎng)基中，能生長的原核宿主細胞所含有的連接產(chǎn)物是胞所含有的連接產(chǎn)物是 ；若接；若接種到含青霉素的培養(yǎng)基中，能生長的原核宿主細種到含青霉素的培養(yǎng)基中，能生長的原核宿主細胞所含有的連接產(chǎn)物是胞所含有的連接產(chǎn)物是 。載體自連物載體自連物目的基因與

39、載體連接物、載體自連物目的基因與載體連接物、載體自連物（3）目的基因表達時，）目的基因表達時，RNA聚合酶識別和結(jié)合的聚合酶識別和結(jié)合的位點是位點是 ，其合成的產(chǎn)物是，其合成的產(chǎn)物是 。（4）在上述實驗中，為了防止目的基因和質(zhì)粒表）在上述實驗中，為了防止目的基因和質(zhì)粒表達載體在酶切后產(chǎn)生的末端發(fā)生任意連接，酶切達載體在酶切后產(chǎn)生的末端發(fā)生任意連接，酶切時應(yīng)選用的酶是時應(yīng)選用的酶是 。啟動子啟動子mRNAEcoR、BamH為擴大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量黃河三角洲為擴大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注。我國科學(xué)家應(yīng)用等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注。我國科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育

40、出了耐鹽水稻新品系。耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。(1)獲得耐鹽基因后，構(gòu)建重組獲得耐鹽基因后，構(gòu)建重組DNA 分子所用的限分子所用的限制性內(nèi)切酶作用于圖中的制性內(nèi)切酶作用于圖中的 處，處，DNA 連接酶作連接酶作用于用于 處。（填處。（填“a”或或“b ” ) ( 2 )將重組將重組DNA分子導(dǎo)入水稻受體細胞的常用方法分子導(dǎo)入水稻受體細胞的常用方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和 法。法。aa基因槍法（花粉管通道法）基因槍法（花粉管通道法）( 3 )由導(dǎo)入目的基因的水稻細胞培養(yǎng)成植株需要利由導(dǎo)入目的基因的水稻細胞培養(yǎng)成植株需要利用用 技術(shù)，技術(shù)， 說明植物細胞具有說明植物細胞具有 性，性，

41、該過程（是該過程（是/否）否） 涉及堿基互補配對原則。涉及堿基互補配對原則。( 4 )為了確定耐鹽轉(zhuǎn)基因水稻是否培育成功，既要為了確定耐鹽轉(zhuǎn)基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素標記的用放射性同位素標記的 作探針進行作探針進行分子雜交檢測，又要用分子雜交檢測，又要用 方法方法從個體水平鑒定水稻植株的耐鹽性。從個體水平鑒定水稻植株的耐鹽性。植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)耐鹽基因（目的基因）耐鹽基因（目的基因）一定濃度鹽水澆灌（移栽到鹽堿地中）一定濃度鹽水澆灌（移栽到鹽堿地中）全能全能否否14.科學(xué)家將人的生長激素基因與大腸桿菌的科學(xué)家將人的生長激素基因與大腸桿菌的DNA分子進行重組，并成功地在大腸桿

42、菌中得以表達。分子進行重組，并成功地在大腸桿菌中得以表達。但在進行基因工程的操作過程中，但在進行基因工程的操作過程中，需使用特定的需使用特定的限制酶切割限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，便于重組和篩選。目的基因和質(zhì)粒，便于重組和篩選。已知限制酶已知限制酶I的識別序列和切點是一的識別序列和切點是一GGATCC一，一，限制酶限制酶II的識別序列和切點是一的識別序列和切點是一GATC一一 ，據(jù)圖，據(jù)圖回答：回答： (1)過程過程表示的是采取表示的是采取 的方法來獲的方法來獲取目的基因。取目的基因。反轉(zhuǎn)錄法反轉(zhuǎn)錄法（2）根據(jù)圖示分析，在構(gòu)建基因表達載體過程中，）根據(jù)圖示分析，在構(gòu)建基因表達載體過程中，應(yīng)用限制

43、酶應(yīng)用限制酶 切割質(zhì)粒，用限制酶切割質(zhì)粒，用限制酶 切割目切割目的基因，。用限制酶切割目的基因和運載體后形的基因，。用限制酶切割目的基因和運載體后形成的黏性末端通過成的黏性末端通過 原則進行連接。原則進行連接。堿基互補配對堿基互補配對(3)人的基因之所以能與大腸桿菌的人的基因之所以能與大腸桿菌的DNA分子進行分子進行重組，原因是重組，原因是 。人的基因與大腸桿菌人的基因與大腸桿菌DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)相同的雙螺旋結(jié)構(gòu)相同(4)人體的生長激素基因能在細菌體內(nèi)成功表達是人體的生長激素基因能在細菌體內(nèi)成功表達是因為因為 。寫出目的基因?qū)爰毦斜磉_的過程寫出目的基因?qū)爰毦斜磉_的過程 。共用一套密碼子

44、共用一套密碼子生長激素基因生長激素基因 mRNA 生長激素生長激素轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄翻譯翻譯(5)將得到的大腸桿菌將得到的大腸桿菌B涂布在一個含有氨芐青霉素涂布在一個含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上，能夠生長的，說明已導(dǎo)入的培養(yǎng)基上，能夠生長的，說明已導(dǎo)入了了 ，反之則沒有導(dǎo)入。，反之則沒有導(dǎo)入。普通質(zhì)粒或重組質(zhì)粒普通質(zhì)?；蛑亟M質(zhì)粒一種新發(fā)現(xiàn)的細菌質(zhì)粒中有一種新發(fā)現(xiàn)的細菌質(zhì)粒中有a、b、c等基因，下圖等基因，下圖表示用限制性內(nèi)節(jié)酶處理后得到的表示用限制性內(nèi)節(jié)酶處理后得到的DNA片斷。下片斷。下列有關(guān)敘述中不正確的是列有關(guān)敘述中不正確的是 A 質(zhì)粒有多個限制酶切點質(zhì)粒有多個限制酶切點B 在完整的質(zhì)粒中，若利用某藥物阻止基因在完整的質(zhì)粒中，若利用某藥物阻止基因a的表的表達，則基因達，則基因bc也不能表達也不能表達C 基因基因a控制合成的蛋白質(zhì)含有控制合成的蛋白質(zhì)含有m個氨基酸，比水個氨基酸，比水稻中控制合成含有稻中控制合成含有m個氨基酸的蛋白質(zhì)的基因長度