觀察GDM小鼠模型老年期的糖代謝水平及其胰島的形態(tài)學(xué)改變

1、觀察GDM小鼠模型老年期的糖代謝水平及其胰島的形態(tài)學(xué)改變   本文關(guān)鍵詞：    本文簡介：摘要：目的：探討妊娠期糖尿?。╣estationaldiabetesmellitus,GDM）小鼠模型老年期糖代謝特點及孕期二甲雙胍治療對GDM小鼠胰島素抵抗和胰島功能的遠期影響。方法：將小鼠隨機分成對照組（n=6）、GDM組（n=6）、治療組（n=6），采用高脂飲食誘導(dǎo)建立GDM動物模型，治療組于    本文內(nèi)容：               

2、妊娠期糖尿?。╣estational diabetes mellitus,GDM）是指妊娠期首次發(fā)生或者發(fā)現(xiàn)的不同程度的糖代謝水平異常，是一種多基因遺傳的代謝性疾病。近年來，GDM發(fā)病率不斷升高，嚴(yán)重危害母嬰健康，增加妊娠期高血壓疾病、早產(chǎn)、巨大兒、新生兒呼吸窘迫綜合征等疾病的發(fā)病率1-3,同時還會對母親及其子代產(chǎn)生遠期危害。有研究發(fā)現(xiàn)，患有GDM的母親，產(chǎn)后發(fā)生2型糖尿病4、心血管疾病5、代謝綜合征6的風(fēng)險也明顯增加。因此，孕期控制血糖同時改善糖代謝是減少不良結(jié)局的關(guān)鍵。二甲雙胍（metformin）是常用的口服降糖藥物7-8.但因其可通過胎盤屏障，故在GDM中應(yīng)用的安全性一直存在爭議。本研

3、究旨在探討GDM小鼠模型老年期糖代謝特點及孕期二甲雙胍治療對其胰島素抵抗和胰島功能的遠期影響。         1.1 材料      實驗動物：68周健康雌性C57小鼠40只，68周健康雄性C57小鼠20只，本研究符合作者所在單位實驗動物倫理委員會所制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。動物飼料：高脂飼料（Research Diets D12451），含45%脂肪，20%蛋白質(zhì)，35%碳水化合物；低脂飼料（Research Diets AIN-93G），含15.8%脂肪，20.3%蛋白質(zhì)，63.9%碳水化合物。主

4、要試劑：二甲雙胍及葡萄糖（美國Sigma公司），胰島素注射液（江蘇萬邦），Ki67抗體（Proteintech）。主要儀器：血糖儀及試紙（美國強生）。      1.2 GDM動物模型的建立      健康成年的雌鼠隨機分為2組，模型組（n=8）和正常組（n=8）。模型組高脂飼料喂養(yǎng)1周后與雄鼠按21比例合籠，次日清晨檢查陰栓，若檢測到陰栓則標(biāo)記為妊娠0.5 d,整個孕期持續(xù)高脂飲食。正常組孕前1周及孕期給予低脂飼料，其余同模型組。于孕16.5 d行葡萄糖耐量試驗，若模型組糖代謝明顯異常，則造模成功。  

5、    1.3 實驗分組      所有實驗小鼠普通飲食適應(yīng)性喂養(yǎng)2周，隨機分為3組：對照組（n=6）、GDM組（n=6）、治療組（n=6）。GDM及治療組孕前1周及孕期給予高脂飲食喂養(yǎng)，對照組孕前1周及孕期給予低脂飲食喂養(yǎng)。于孕11.517.5 d,治療組給予300 mg/（kg×d）二甲雙胍溶液灌胃，GDM及對照組則給予相同劑量的PBS灌胃。2組孕鼠分娩后均給予普通維持飼料，喂養(yǎng)至12月齡。      1.4 檢測指標(biāo)      1

6、.4.1 OGTT和ITT      檢測小鼠12月齡時的口服葡萄糖耐量試驗（oral glucose tolerance test,OGTT）水平。首先將小鼠禁食6 h,按禁食后的體質(zhì)量，以2 g/kg的量經(jīng)口腔灌注20%的葡萄糖溶液，由尾靜脈采血，用血糖儀檢測灌注前，灌注后30、60、90、120 min的血糖水平，繪制OGTT曲線并計算曲線下面積（AUC）。檢測小鼠12月齡時的胰島素耐量試驗（insulin tolerance test,ITT）水平。首先將小鼠禁食6 h,按禁食后的體質(zhì)量，以2.5 U/kg的量經(jīng)腹腔注射0.25 U/mL的胰島素

7、溶液，由尾靜脈采血，用血糖儀檢測注射前、注射后15、30、60、120 min的血糖水平，繪制ITT曲線并計算AUC.      1.4.2 胰腺組織HE染色      所有12月齡的小鼠禁食6 h后，戊巴比妥鈉溶液腹腔麻醉后，快速分離胰腺組織。4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅染色后于光鏡下觀察胰腺組織的形態(tài)學(xué)變化。      1.4.3 免疫組化法檢測胰腺組織Ki67蛋白的表達      胰腺組織4%多聚甲醛溶液固

8、定，常規(guī)石蠟包埋切片，免疫組化法檢測Ki67的表達。脫蠟；微波修復(fù)法抗原修復(fù)，PBS沖洗，5 min?1次；3%過氧化氫溶液孵育10 min,PBS沖洗，3 min?3次；非免疫山羊血清室溫封閉30 min;滴加一抗，4 過夜，PBS沖洗，10 min?3次；滴加二抗，室溫孵育1 h,PBS沖洗，10 min?3次；DAB顯色；蘇木精復(fù)染；脫水封片。顯微鏡下采集圖片，利用Image-Pro Plus 6.0軟件計算平均光密度。      1.5 統(tǒng)計學(xué)處理      采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果以

9、均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。采用獨立樣本的t檢驗進行2組間比較；采用單因素方差分析進行多組比較，事后進行LSD檢驗分析2組間的差異；模型建立中的OGTT結(jié)果先進行重復(fù)測量方差分析，后應(yīng)用獨立樣本t檢驗分析同一時間點2組間的血糖差異及曲線下面積差異；檢驗水準(zhǔn)=0.05.         2.1 高脂飲食誘導(dǎo)妊娠期糖尿病小鼠模型建立      為了評價建模效果，我們對妊娠期16.5 d的OGTT結(jié)果進行了重復(fù)測量方差分析，結(jié)果顯示分組主效應(yīng)（F=107.379,P=0.000），時間主效應(yīng)（F

10、=1187.974,P=0.000）及兩者交互效應(yīng)（F=40.621,P=0.000）均具有統(tǒng)計學(xué)差異。說明血糖值有隨時間因素變化的趨勢，且時間對血糖的影響會隨著分組的不同而變化。接下來我們對同一時間點不同分組間的血糖值進行了比較（表1）。與正常組相比，模型組空腹血糖偏高（t=2.485,P=0.026）；給予葡萄糖灌胃后，模型組血糖下降緩慢，與正常組相比，其灌注后30 min（t=18.756,P=0.000）、60 min（t=7.766,P=0.000）、90 min（t=3.452,P=0.004）的血糖水平明顯升高；通過AUC分析也發(fā)現(xiàn)，模型組較正常組有升高的趨勢（t=10.926,

11、P=0.000）。綜上所述，模型組OGTT結(jié)果明顯異常，調(diào)節(jié)葡萄糖的能力下降，高脂飲食誘導(dǎo)妊娠期糖尿病小鼠模型建模成功。      2.2 分娩后小鼠體質(zhì)量增長趨勢      3組小鼠分娩后均轉(zhuǎn)普通飼料喂養(yǎng)。在分娩2個月后，3組小鼠體質(zhì)量具有明顯統(tǒng)計學(xué)差異（F=3.875,P=0.044）。與對照組相比，GDM組（P=0.028）及治療組（P=0.031）的小鼠體質(zhì)量持續(xù)升高。分娩5個月后，雖然治療組的體質(zhì)量增長速度較GDM組有所減慢，但2組間仍無明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.097）。   

12、60; 2.3 GDM小鼠分娩后對葡萄糖的調(diào)節(jié)能力基本恢復(fù)正常但出現(xiàn)胰島素抵抗      OGTT結(jié)果及曲線下面積（AUC）分析顯示，葡萄糖灌注前，3組小鼠血糖值無明顯統(tǒng)計學(xué)差異（F=2.009,P=0.169），灌注后2 h GDM組較對照組血糖值高（P=0.002），但3組的AUC并無明顯統(tǒng)計學(xué)差異（F=1.624,P=0.230）。說明與對照組相比，GDM組調(diào)節(jié)葡萄糖的能力無明顯差異（圖2A、B）。ITT結(jié)果及AUC分析顯示，與對照組相比，GDM組腹腔注射胰島素后30 min（P=0.000）、60 min（P=0.008）血糖下降緩慢，

13、其AUC明顯升高（P=0.004），說明GDM組老年小鼠存在明顯胰島素抵抗。與GDM組相比，治療組小鼠注射胰島素后30 min（P=0.009）、60 min（P=0.026）血糖降低較快，AUC有降低的趨勢，說明孕期二甲雙胍治療存在提高胰島素敏感性的作用（圖2C、D）。      2.4 進入老年期，GDM小鼠胰島出現(xiàn)病理學(xué)改變，孕期二甲雙胍治療可以改善      3組小鼠的胰腺組織經(jīng)HE染色后光鏡下觀察。對照組小鼠胰島數(shù)量較多，面積大小不等，形態(tài)規(guī)則邊界清楚。GDM組小鼠胰島數(shù)量明顯減少，胰島面積萎縮，形態(tài)不一

14、。治療組小鼠胰島數(shù)量較高脂組增多，胰島面積與正常組類似，形態(tài)較規(guī)則，邊界欠清（圖3）。         2.5 Ki67在胰腺組織的表達      通過免疫組化染色，可以看到細胞增殖標(biāo)記物Ki67主要定位于胰島的細胞核（圖4）。對照組胰島部著色較深，而GDM組及治療組染色較淺，其平均光密度分別為對照組0.149±0.109、GDM組0.006±0.003、治療組0.016±0.0030.3組之間比較雖然無明顯統(tǒng)計學(xué)差異（F=4.791,P=0.057），但兩兩比較發(fā)

15、現(xiàn)，對照組較GDM組（P=0.032）和治療組（P=0.042）Ki67的表達量升高。            GDM是一種以代謝異常為主要表現(xiàn)的妊娠期并發(fā)癥，其發(fā)病機制復(fù)雜，主要涉及2個關(guān)鍵環(huán)節(jié)，即胰島素抵抗、胰島細胞分泌相對不足。妊娠中后期生理性血容量增加，胰島素濃度降低，同時孕期增加的雌孕激素及胎盤激素具有拮抗胰島素的作用，外周組織對胰島素的敏感性下降，胰島素需求增大。如果此時胰島細胞分泌的胰島素不能代償胰島素抵抗的部分，糖代謝就會發(fā)生紊亂，進而發(fā)展為GDM.      

16、雖然大多數(shù)患有GDM的女性在產(chǎn)后血糖值可以恢復(fù)正常水平。但是大量的研究4-6,9發(fā)現(xiàn)，這部分女性產(chǎn)后發(fā)生2型糖尿病、心血管疾病、代謝綜合征的風(fēng)險明顯增加。說明雖然血糖值恢復(fù)了正常，但其體內(nèi)的代謝紊亂并未完全消除。國內(nèi)外的一部分臨床研究10-12發(fā)現(xiàn)，GDM的產(chǎn)婦在分娩后依然表現(xiàn)出慢性胰島素抵抗的狀態(tài)。本研究也發(fā)現(xiàn)，GDM組的小鼠在分娩后體質(zhì)量增長迅速；進入老年期后，雖然葡萄糖耐量實驗表現(xiàn)正常，但其胰島已經(jīng)發(fā)生了萎縮，數(shù)量減少等病理學(xué)改變，且胰島素敏感性下降，出現(xiàn)胰島素抵抗。1995年Stern13提出的“共同土壤學(xué)說”認為胰島素抵抗是糖尿病和心血管疾病的共同危險因素，同時，也有研究證明了代謝綜

17、合征、肥胖等代謝性疾病與胰島素抵抗的相關(guān)性13-15.因此，產(chǎn)后持續(xù)的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)很可能是GDM遠期危害的主要原因之一。      二甲雙胍是常用的口服降糖藥，其降血糖的機制主要包括7減少腸道對葡萄糖的吸收、抑制肝臟的糖異生及提高外周組織對葡萄糖的敏感性。同時，二甲雙胍不通過刺激胰島細胞分泌胰島素來維持血糖，由此可較好地保護受損胰島功能，因此被廣泛應(yīng)用于糖尿病的治療。但由于二甲雙胍可通過胎盤屏障16,故其應(yīng)用于GDM治療的安全性一直備受爭議。目前一部分臨床研究17-18已證明妊娠期應(yīng)用二甲雙胍可有效控制血糖，減少不良妊娠結(jié)局。然而，二甲雙胍對母嬰的遠期

18、影響仍知之甚少。本研究發(fā)現(xiàn)，孕期應(yīng)用二甲雙胍治療GDM可減緩產(chǎn)后體質(zhì)量增長速度。進入老年期后，其對胰島素敏感性有保護作用，且對胰島的病理學(xué)改變也有改善。      綜上所述，我們通過高脂飲食建立了GDM的動物模型，旨在觀察GDM小鼠模型老年期的糖代謝水平，胰島的形態(tài)學(xué)改變以及孕期二甲雙胍治療對母體的遠期療效。通過本研究證實GDM組的小鼠在產(chǎn)后血糖水平雖然可以恢復(fù)正常，但其胰島素抵抗的狀態(tài)持續(xù)存在。同時，老年期GDM組小鼠更容易發(fā)生肥胖、胰島萎縮、數(shù)量減少、增殖能力降低。孕期應(yīng)用二甲雙胍可以有效改善小鼠胰島素抵抗的狀態(tài)，減慢體質(zhì)量增加及胰島的病理學(xué)改變，但

19、是并不能增強胰島的增殖能力。在后續(xù)研究中，我們將進一步探究二甲雙胍在改善GDM遠期預(yù)后中的作用機制，為GDM遠期并發(fā)癥的防治及二甲雙胍的應(yīng)用提供新的理論依據(jù)。         1 Schneider S, Freerksen N, R?hrig S, et al. Gestational diabetes and preeclampsia-similar risk factor profiles?J. Early Human Development, 2012, 88（3）：179-184.   2 ?stlund I, Haglund B, Hanson U. Gestational diabetes and preeclampsiaJ. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol, 2004, 113（1）： 12-16.   3 Kc K, Shakya S, Zhang H. Gestational diabetes mellitus and macrosomia: a literature reviewJ. Ann Nutr Metab, 2015, 66（S2）： 14-20.