觀察GDM小鼠模型老年期的糖代謝水平及其胰島的形態(tài)學(xué)改變

1、觀察GDM小鼠模型老年期的糖代謝水平及其胰島的形態(tài)學(xué)改變   本文關(guān)鍵詞：    本文簡介：摘要：目的：探討妊娠期糖尿?。╣estationaldiabetesmellitus,GDM）小鼠模型老年期糖代謝特點(diǎn)及孕期二甲雙胍治療對GDM小鼠胰島素抵抗和胰島功能的遠(yuǎn)期影響。方法：將小鼠隨機(jī)分成對照組（n=6）、GDM組（n=6）、治療組（n=6），采用高脂飲食誘導(dǎo)建立GDM動物模型，治療組于    本文內(nèi)容：               

2、妊娠期糖尿?。╣estational diabetes mellitus,GDM）是指妊娠期首次發(fā)生或者發(fā)現(xiàn)的不同程度的糖代謝水平異常，是一種多基因遺傳的代謝性疾病。近年來，GDM發(fā)病率不斷升高，嚴(yán)重危害母嬰健康，增加妊娠期高血壓疾病、早產(chǎn)、巨大兒、新生兒呼吸窘迫綜合征等疾病的發(fā)病率1-3,同時(shí)還會對母親及其子代產(chǎn)生遠(yuǎn)期危害。有研究發(fā)現(xiàn)，患有GDM的母親，產(chǎn)后發(fā)生2型糖尿病4、心血管疾病5、代謝綜合征6的風(fēng)險(xiǎn)也明顯增加。因此，孕期控制血糖同時(shí)改善糖代謝是減少不良結(jié)局的關(guān)鍵。二甲雙胍（metformin）是常用的口服降糖藥物7-8.但因其可通過胎盤屏障，故在GDM中應(yīng)用的安全性一直存在爭議。本研

3、究旨在探討GDM小鼠模型老年期糖代謝特點(diǎn)及孕期二甲雙胍治療對其胰島素抵抗和胰島功能的遠(yuǎn)期影響。         1.1 材料      實(shí)驗(yàn)動物：68周健康雌性C57小鼠40只，68周健康雄性C57小鼠20只，本研究符合作者所在單位實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會所制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。動物飼料：高脂飼料（Research Diets D12451），含45%脂肪，20%蛋白質(zhì)，35%碳水化合物；低脂飼料（Research Diets AIN-93G），含15.8%脂肪，20.3%蛋白質(zhì)，63.9%碳水化合物。主

4、要試劑：二甲雙胍及葡萄糖（美國Sigma公司），胰島素注射液（江蘇萬邦），Ki67抗體（Proteintech）。主要儀器：血糖儀及試紙（美國強(qiáng)生）。      1.2 GDM動物模型的建立      健康成年的雌鼠隨機(jī)分為2組，模型組（n=8）和正常組（n=8）。模型組高脂飼料喂養(yǎng)1周后與雄鼠按21比例合籠，次日清晨檢查陰栓，若檢測到陰栓則標(biāo)記為妊娠0.5 d,整個(gè)孕期持續(xù)高脂飲食。正常組孕前1周及孕期給予低脂飼料，其余同模型組。于孕16.5 d行葡萄糖耐量試驗(yàn)，若模型組糖代謝明顯異常，則造模成功。  

5、    1.3 實(shí)驗(yàn)分組      所有實(shí)驗(yàn)小鼠普通飲食適應(yīng)性喂養(yǎng)2周，隨機(jī)分為3組：對照組（n=6）、GDM組（n=6）、治療組（n=6）。GDM及治療組孕前1周及孕期給予高脂飲食喂養(yǎng)，對照組孕前1周及孕期給予低脂飲食喂養(yǎng)。于孕11.517.5 d,治療組給予300 mg/（kg×d）二甲雙胍溶液灌胃，GDM及對照組則給予相同劑量的PBS灌胃。2組孕鼠分娩后均給予普通維持飼料，喂養(yǎng)至12月齡。      1.4 檢測指標(biāo)      1

6、.4.1 OGTT和ITT      檢測小鼠12月齡時(shí)的口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（oral glucose tolerance test,OGTT）水平。首先將小鼠禁食6 h,按禁食后的體質(zhì)量，以2 g/kg的量經(jīng)口腔灌注20%的葡萄糖溶液，由尾靜脈采血，用血糖儀檢測灌注前，灌注后30、60、90、120 min的血糖水平，繪制OGTT曲線并計(jì)算曲線下面積（AUC）。檢測小鼠12月齡時(shí)的胰島素耐量試驗(yàn)（insulin tolerance test,ITT）水平。首先將小鼠禁食6 h,按禁食后的體質(zhì)量，以2.5 U/kg的量經(jīng)腹腔注射0.25 U/mL的胰島素

7、溶液，由尾靜脈采血，用血糖儀檢測注射前、注射后15、30、60、120 min的血糖水平，繪制ITT曲線并計(jì)算AUC.      1.4.2 胰腺組織HE染色      所有12月齡的小鼠禁食6 h后，戊巴比妥鈉溶液腹腔麻醉后，快速分離胰腺組織。4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅染色后于光鏡下觀察胰腺組織的形態(tài)學(xué)變化。      1.4.3 免疫組化法檢測胰腺組織Ki67蛋白的表達(dá)      胰腺組織4%多聚甲醛溶液固

8、定，常規(guī)石蠟包埋切片，免疫組化法檢測Ki67的表達(dá)。脫蠟；微波修復(fù)法抗原修復(fù)，PBS沖洗，5 min?1次；3%過氧化氫溶液孵育10 min,PBS沖洗，3 min?3次；非免疫山羊血清室溫封閉30 min;滴加一抗，4 過夜，PBS沖洗，10 min?3次；滴加二抗，室溫孵育1 h,PBS沖洗，10 min?3次；DAB顯色；蘇木精復(fù)染；脫水封片。顯微鏡下采集圖片，利用Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算平均光密度。      1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理      采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以

9、均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)進(jìn)行2組間比較；采用單因素方差分析進(jìn)行多組比較，事后進(jìn)行LSD檢驗(yàn)分析2組間的差異；模型建立中的OGTT結(jié)果先進(jìn)行重復(fù)測量方差分析，后應(yīng)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析同一時(shí)間點(diǎn)2組間的血糖差異及曲線下面積差異；檢驗(yàn)水準(zhǔn)=0.05.         2.1 高脂飲食誘導(dǎo)妊娠期糖尿病小鼠模型建立      為了評價(jià)建模效果，我們對妊娠期16.5 d的OGTT結(jié)果進(jìn)行了重復(fù)測量方差分析，結(jié)果顯示分組主效應(yīng)（F=107.379,P=0.000），時(shí)間主效應(yīng)（F

10、=1187.974,P=0.000）及兩者交互效應(yīng)（F=40.621,P=0.000）均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說明血糖值有隨時(shí)間因素變化的趨勢，且時(shí)間對血糖的影響會隨著分組的不同而變化。接下來我們對同一時(shí)間點(diǎn)不同分組間的血糖值進(jìn)行了比較（表1）。與正常組相比，模型組空腹血糖偏高（t=2.485,P=0.026）；給予葡萄糖灌胃后，模型組血糖下降緩慢，與正常組相比，其灌注后30 min（t=18.756,P=0.000）、60 min（t=7.766,P=0.000）、90 min（t=3.452,P=0.004）的血糖水平明顯升高；通過AUC分析也發(fā)現(xiàn)，模型組較正常組有升高的趨勢（t=10.926,

11、P=0.000）。綜上所述，模型組OGTT結(jié)果明顯異常，調(diào)節(jié)葡萄糖的能力下降，高脂飲食誘導(dǎo)妊娠期糖尿病小鼠模型建模成功。      2.2 分娩后小鼠體質(zhì)量增長趨勢      3組小鼠分娩后均轉(zhuǎn)普通飼料喂養(yǎng)。在分娩2個(gè)月后，3組小鼠體質(zhì)量具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=3.875,P=0.044）。與對照組相比，GDM組（P=0.028）及治療組（P=0.031）的小鼠體質(zhì)量持續(xù)升高。分娩5個(gè)月后，雖然治療組的體質(zhì)量增長速度較GDM組有所減慢，但2組間仍無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.097）。   

12、60; 2.3 GDM小鼠分娩后對葡萄糖的調(diào)節(jié)能力基本恢復(fù)正常但出現(xiàn)胰島素抵抗      OGTT結(jié)果及曲線下面積（AUC）分析顯示，葡萄糖灌注前，3組小鼠血糖值無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=2.009,P=0.169），灌注后2 h GDM組較對照組血糖值高（P=0.002），但3組的AUC并無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=1.624,P=0.230）。說明與對照組相比，GDM組調(diào)節(jié)葡萄糖的能力無明顯差異（圖2A、B）。ITT結(jié)果及AUC分析顯示，與對照組相比，GDM組腹腔注射胰島素后30 min（P=0.000）、60 min（P=0.008）血糖下降緩慢，

13、其AUC明顯升高（P=0.004），說明GDM組老年小鼠存在明顯胰島素抵抗。與GDM組相比，治療組小鼠注射胰島素后30 min（P=0.009）、60 min（P=0.026）血糖降低較快，AUC有降低的趨勢，說明孕期二甲雙胍治療存在提高胰島素敏感性的作用（圖2C、D）。      2.4 進(jìn)入老年期，GDM小鼠胰島出現(xiàn)病理學(xué)改變，孕期二甲雙胍治療可以改善      3組小鼠的胰腺組織經(jīng)HE染色后光鏡下觀察。對照組小鼠胰島數(shù)量較多，面積大小不等，形態(tài)規(guī)則邊界清楚。GDM組小鼠胰島數(shù)量明顯減少，胰島面積萎縮，形態(tài)不一

14、。治療組小鼠胰島數(shù)量較高脂組增多，胰島面積與正常組類似，形態(tài)較規(guī)則，邊界欠清（圖3）。         2.5 Ki67在胰腺組織的表達(dá)      通過免疫組化染色，可以看到細(xì)胞增殖標(biāo)記物Ki67主要定位于胰島的細(xì)胞核（圖4）。對照組胰島部著色較深，而GDM組及治療組染色較淺，其平均光密度分別為對照組0.149±0.109、GDM組0.006±0.003、治療組0.016±0.0030.3組之間比較雖然無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=4.791,P=0.057），但兩兩比較發(fā)

15、現(xiàn)，對照組較GDM組（P=0.032）和治療組（P=0.042）Ki67的表達(dá)量升高。            GDM是一種以代謝異常為主要表現(xiàn)的妊娠期并發(fā)癥，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，主要涉及2個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，即胰島素抵抗、胰島細(xì)胞分泌相對不足。妊娠中后期生理性血容量增加，胰島素濃度降低，同時(shí)孕期增加的雌孕激素及胎盤激素具有拮抗胰島素的作用，外周組織對胰島素的敏感性下降，胰島素需求增大。如果此時(shí)胰島細(xì)胞分泌的胰島素不能代償胰島素抵抗的部分，糖代謝就會發(fā)生紊亂，進(jìn)而發(fā)展為GDM.      

16、雖然大多數(shù)患有GDM的女性在產(chǎn)后血糖值可以恢復(fù)正常水平。但是大量的研究4-6,9發(fā)現(xiàn)，這部分女性產(chǎn)后發(fā)生2型糖尿病、心血管疾病、代謝綜合征的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加。說明雖然血糖值恢復(fù)了正常，但其體內(nèi)的代謝紊亂并未完全消除。國內(nèi)外的一部分臨床研究10-12發(fā)現(xiàn)，GDM的產(chǎn)婦在分娩后依然表現(xiàn)出慢性胰島素抵抗的狀態(tài)。本研究也發(fā)現(xiàn)，GDM組的小鼠在分娩后體質(zhì)量增長迅速；進(jìn)入老年期后，雖然葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)正常，但其胰島已經(jīng)發(fā)生了萎縮，數(shù)量減少等病理學(xué)改變，且胰島素敏感性下降，出現(xiàn)胰島素抵抗。1995年Stern13提出的“共同土壤學(xué)說”認(rèn)為胰島素抵抗是糖尿病和心血管疾病的共同危險(xiǎn)因素，同時(shí)，也有研究證明了代謝綜

17、合征、肥胖等代謝性疾病與胰島素抵抗的相關(guān)性13-15.因此，產(chǎn)后持續(xù)的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)很可能是GDM遠(yuǎn)期危害的主要原因之一。      二甲雙胍是常用的口服降糖藥，其降血糖的機(jī)制主要包括7減少腸道對葡萄糖的吸收、抑制肝臟的糖異生及提高外周組織對葡萄糖的敏感性。同時(shí)，二甲雙胍不通過刺激胰島細(xì)胞分泌胰島素來維持血糖，由此可較好地保護(hù)受損胰島功能，因此被廣泛應(yīng)用于糖尿病的治療。但由于二甲雙胍可通過胎盤屏障16,故其應(yīng)用于GDM治療的安全性一直備受爭議。目前一部分臨床研究17-18已證明妊娠期應(yīng)用二甲雙胍可有效控制血糖，減少不良妊娠結(jié)局。然而，二甲雙胍對母嬰的遠(yuǎn)期

18、影響仍知之甚少。本研究發(fā)現(xiàn)，孕期應(yīng)用二甲雙胍治療GDM可減緩產(chǎn)后體質(zhì)量增長速度。進(jìn)入老年期后，其對胰島素敏感性有保護(hù)作用，且對胰島的病理學(xué)改變也有改善。      綜上所述，我們通過高脂飲食建立了GDM的動物模型，旨在觀察GDM小鼠模型老年期的糖代謝水平，胰島的形態(tài)學(xué)改變以及孕期二甲雙胍治療對母體的遠(yuǎn)期療效。通過本研究證實(shí)GDM組的小鼠在產(chǎn)后血糖水平雖然可以恢復(fù)正常，但其胰島素抵抗的狀態(tài)持續(xù)存在。同時(shí)，老年期GDM組小鼠更容易發(fā)生肥胖、胰島萎縮、數(shù)量減少、增殖能力降低。孕期應(yīng)用二甲雙胍可以有效改善小鼠胰島素抵抗的狀態(tài)，減慢體質(zhì)量增加及胰島的病理學(xué)改變，但

19、是并不能增強(qiáng)胰島的增殖能力。在后續(xù)研究中，我們將進(jìn)一步探究二甲雙胍在改善GDM遠(yuǎn)期預(yù)后中的作用機(jī)制，為GDM遠(yuǎn)期并發(fā)癥的防治及二甲雙胍的應(yīng)用提供新的理論依據(jù)。         1 Schneider S, Freerksen N, R?hrig S, et al. Gestational diabetes and preeclampsia-similar risk factor profiles?J. Early Human Development, 2012, 88（3）：179-184.   2 ?stlund I, Haglund B, Hanson U. Gestational diabetes and preeclampsiaJ. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol, 2004, 113（1）： 12-16.   3 Kc K, Shakya S, Zhang H. Gestational diabetes mellitus and macrosomia: a literature reviewJ. Ann Nutr Metab, 2015, 66（S2）： 14-20.