分子醫(yī)學(xué)技能：酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISPOT)技術(shù)

1、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISPOT)(ELISPOT)技術(shù)技術(shù)一、ELISPOT檢測(cè)細(xì)胞因子實(shí)驗(yàn)技術(shù)vELISPOT檢測(cè)方法特點(diǎn) 通過(guò)兩種高親和力的特異性抗細(xì)胞因子抗體來(lái)檢測(cè)淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子情況 在分泌細(xì)胞原處捕獲該細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子 斑點(diǎn)的生成屬于一種顯色反應(yīng)：SPOT=細(xì)胞印跡 斑點(diǎn)可持久保存并進(jìn)行計(jì)數(shù)分析v可在單細(xì)胞水平檢測(cè)淋巴細(xì)胞對(duì)特異性抗原的反應(yīng)能力v計(jì)數(shù)特異性抗原刺激下分泌性淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的比例v有效、快速、靈敏度高 使用高吸附性的專用ELISPOT培養(yǎng)板 細(xì)胞因子的檢測(cè)不易受非分泌細(xì)胞的干擾 比傳統(tǒng)的ELISA和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法敏感20-200倍v易操作v樣本量大的情

2、況下實(shí)驗(yàn)結(jié)果可用計(jì)算機(jī)圖象分析系統(tǒng)進(jìn)行快速、客觀的分析106抗原呈遞細(xì)胞（APC）中混入特定數(shù)量的IFN-+ +的T淋巴細(xì)胞 ，經(jīng)下列方法檢測(cè)： ELISPOT 細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色（FACS） ELISAX X坐標(biāo)：坐標(biāo)： 10106 6 APCAPC中實(shí)際中實(shí)際IFN-IFN-+ +T T細(xì)胞數(shù)量細(xì)胞數(shù)量Y Y坐標(biāo)：坐標(biāo)： 各檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果各檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果 ELISPOT/FACS/ELISA ELISPOT/FACS/ELISA 檢測(cè)精確度比較Coating Ab 包被培養(yǎng)孔并經(jīng)BSA阻斷根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入淋巴細(xì)胞及含或不含刺激因子的培養(yǎng)液孵育v 基 本 原 理活化的淋巴細(xì)胞可分泌細(xì)

3、胞因子與Coating Ab結(jié)合洗除細(xì)胞，依次加入生物素標(biāo)記的抗細(xì)胞因子抗體及酶標(biāo)抗生物素抗體進(jìn)行反應(yīng)加入酶底物顯色形成斑點(diǎn)（SPOT） B細(xì)胞雜交瘤的篩選 化合物和藥物免疫學(xué)反應(yīng)的檢測(cè) 優(yōu)化樹(shù)突細(xì)胞和T細(xì)胞的抗腫瘤活性 靶向疫苗的質(zhì)控 自身免疫疾病的診斷和預(yù)后分析 自身免疫疾病免疫治療的監(jiān)控 過(guò)敏性疾病的脫敏治療的監(jiān)測(cè) 器官移植中排斥反應(yīng)的預(yù)測(cè) 微量組織、腫瘤和免疫細(xì)胞分泌譜的分析 結(jié)核病的診斷 ELISPOT方法主要用途Coating Ab包被培養(yǎng)板0.05%PBS-Tween20(PBST)洗板5次每孔加入1%BSA阻斷按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入含或不含刺激劑的培養(yǎng)液及一定數(shù)目細(xì)胞孵育5-24小時(shí)4

4、0C過(guò)夜370C孵育1小時(shí)取外周血單核細(xì)胞或脾淋巴細(xì)胞根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，培養(yǎng)液中加入所需刺激物，預(yù)先將所檢測(cè)細(xì)胞孵育24-42小時(shí)無(wú)菌直接取外周血單核細(xì)胞或脾淋巴細(xì)胞或者去除細(xì)胞，加入冰凍去離子水200ul/孔，培養(yǎng)板置冰上10分鐘 加入生物素標(biāo)記的detector Ab加入酶標(biāo)抗生物素抗體(GABA)40C暗處混合顯色劑I和II, 加入顯色劑I/II,暗處室溫孵育20-30分鐘 PBST洗板10次370C孵育1小時(shí)后，PBST洗板5次370C孵育1小時(shí)后，PBST洗板5次顯微鏡下觀察至斑點(diǎn)形成，去離子水清洗培養(yǎng)板 室溫干燥后在倒置顯微鏡下觀察結(jié)果非無(wú)菌v 技 術(shù) 要 點(diǎn) 預(yù)孵育的淋巴細(xì)胞若有壞死/凋亡（培養(yǎng)液過(guò)黃）會(huì)影響斑點(diǎn)的形成 提取淋巴細(xì)胞時(shí)應(yīng)盡量去除紅細(xì)胞的干擾 入ELISPOT培養(yǎng)孔的細(xì)胞須為單細(xì)胞懸液 細(xì)胞孵育過(guò)程應(yīng)保證ELISPOT培養(yǎng)板靜置，CO2培養(yǎng)箱應(yīng)保證穩(wěn)定，避免震蕩 稀釋抗體及GABA凍干粉時(shí)