生物化學(xué)第15章核酸的理化性質(zhì)

1、第15章 核酸的理化性質(zhì)核酸的理化性質(zhì)一般物理性質(zhì)DNADNA為白色纖維狀固體，為白色纖維狀固體，RNARNA為白色粉末狀固體。為白色粉末狀固體。都微溶于水，其鈉鹽在水中的溶解度較大。但不溶于都微溶于水，其鈉鹽在水中的溶解度較大。但不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般有機(jī)溶劑乙醇、乙醚和氯仿等一般有機(jī)溶劑。DNADNA和和RNARNA在細(xì)胞中常以核酸在細(xì)胞中常以核酸蛋白復(fù)合體（核蛋白）蛋白復(fù)合體（核蛋白）形式存在，兩種核蛋白在鹽溶液中的溶解度不同。形式存在，兩種核蛋白在鹽溶液中的溶解度不同。 DNADNA核蛋白核蛋白 RNARNA核蛋白核蛋白 0.14mol/LNaCl - +0.14mol/LNaC

2、l - + 1-2mol/LNaCl + - 1-2mol/LNaCl + -DNADNA溶液的粘度很大，而溶液的粘度很大，而RNARNA溶液的粘度小得多。核酸溶液的粘度小得多。核酸發(fā)生變性或降解后其粘度降低。發(fā)生變性或降解后其粘度降低。核酸受到強(qiáng)大離心力的作用時(shí)，可從溶液中沉降下來，核酸受到強(qiáng)大離心力的作用時(shí)，可從溶液中沉降下來，其沉降速度與核酸的大小和密度有關(guān)。其沉降速度與核酸的大小和密度有關(guān)。 與蛋白質(zhì)相似，與蛋白質(zhì)相似，RNARNA分子中既含有酸性基團(tuán)分子中既含有酸性基團(tuán)（磷酸基）也含有弱堿性堿基基團(tuán)，因而（磷酸基）也含有弱堿性堿基基團(tuán)，因而RNARNA也具有兩性性質(zhì)。也具有兩性性質(zhì)。

3、 由于由于RNARNA分子中的磷酸是一個(gè)中等強(qiáng)度的酸，分子中的磷酸是一個(gè)中等強(qiáng)度的酸，而堿基呈現(xiàn)弱堿性，所以而堿基呈現(xiàn)弱堿性，所以RNARNA的等電點(diǎn)比較低。的等電點(diǎn)比較低。（當(dāng)核酸分子內(nèi)的酸性解離和堿性解離相等，（當(dāng)核酸分子內(nèi)的酸性解離和堿性解離相等，本身所帶的正電荷與負(fù)電荷相等時(shí)，此時(shí)核酸本身所帶的正電荷與負(fù)電荷相等時(shí)，此時(shí)核酸溶液的溶液的pHpH值即為核酸的等電點(diǎn)值即為核酸的等電點(diǎn)pIpI）RNARNA在其等在其等電點(diǎn)時(shí)溶解度最小。電點(diǎn)時(shí)溶解度最小。 RNARNA的等電點(diǎn)比較低的原因，是的等電點(diǎn)比較低的原因，是RNARNA分子中核糖分子中核糖基基2-OH2-OH通過氫鍵促進(jìn)了磷酸基上質(zhì)子

4、的解離。通過氫鍵促進(jìn)了磷酸基上質(zhì)子的解離。核酸的理化性質(zhì)核酸的兩性性質(zhì)一、核酸的理化性質(zhì)核酸的水解1、酸水解 核苷酸的糖苷鍵和磷酸二酯鍵均可被酸水解，但糖苷核苷酸的糖苷鍵和磷酸二酯鍵均可被酸水解，但糖苷鍵比磷酸二酯鍵更易被酸水解。鍵比磷酸二酯鍵更易被酸水解。 水解水解核酸的理化性質(zhì)核酸的水解2、堿水解 RNA的磷酸鍵易被堿水解，產(chǎn)生核苷酸，DNA的磷酸鍵則不易水解，因?yàn)镽NA上2-OH基，在堿作用下易形成磷酸三酯而易水解。 水解核酸的理化性質(zhì)核酸的水解2、堿水解 核酸的理化性質(zhì)核酸的水解2、堿水解 核酸的理化性質(zhì)核酸的水解2、堿水解 核酸的理化性質(zhì)核酸的水解3、酶水解 非特異性水解多聚核苷酸鏈

5、中磷酸二酯鍵的酶稱為非特異性水解多聚核苷酸鏈中磷酸二酯鍵的酶稱為磷酸二酯磷酸二酯酶，酶，特異性水解核酸的磷酸二酯酶稱為特異性水解核酸的磷酸二酯酶稱為核酸酶核酸酶DNADNA水解酶水解酶（DNasesDNases）以）以DNADNA為底物，為底物，RNARNA水解酶水解酶（RNasesRNases）以）以RNARNA為底物。為底物。根據(jù)作用方式又分作兩類：根據(jù)作用方式又分作兩類：核酸外切酶核酸外切酶和和核酸內(nèi)切酶核酸內(nèi)切酶。核酸外切酶的作用方式是從多聚核苷酸鏈的一端（核酸外切酶的作用方式是從多聚核苷酸鏈的一端（3-3-端或端或5-5-端）開始，逐個(gè)水解切除核苷酸；核酸內(nèi)切酶的作用方端）開始，逐個(gè)

6、水解切除核苷酸；核酸內(nèi)切酶的作用方式剛好和外切酶相反，它從多聚核苷酸鏈中間開始，在某個(gè)式剛好和外切酶相反，它從多聚核苷酸鏈中間開始，在某個(gè)位點(diǎn)切斷磷酸二酯鍵。位點(diǎn)切斷磷酸二酯鍵。在分子生物學(xué)研究中最有應(yīng)用價(jià)值的是在分子生物學(xué)研究中最有應(yīng)用價(jià)值的是限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶。這種酶可以特異性的水解核酸中某些特定堿基順序部位。這種酶可以特異性的水解核酸中某些特定堿基順序部位。核酸的理化性質(zhì)核酸的水解3、酶水解 蛇毒磷酸二酯酶和牛脾磷酸二酯酶是從不同末端降解多聚核苷酸的核酸外切酶3、酶水解 核酸的理化性質(zhì)核酸的水解牛胰核糖核酸酶（RNase I）作用位點(diǎn)為嘧啶核苷-3-磷酸與其它核苷酸之間的連

7、鍵，產(chǎn)物為3-嘧啶核苷酸；或以3-嘧啶核苷酸結(jié)尾的寡核苷酸。核酸的理化性質(zhì)核酸的水解3、酶水解 限制性內(nèi)切酶是一類重要的作用于DNA的內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶識(shí)別部位一般都是由4-8個(gè)堿基對(duì)組成的一段序列，而且有一個(gè)二重對(duì)稱軸，即5-3方向殘基序列在DNA的兩條鏈上是一樣的，這樣的序列稱為回文結(jié)構(gòu)。E. CoR I是一個(gè)重要的限制性內(nèi)切酶，它識(shí)別由6個(gè)堿基對(duì)組成的特殊序列（每條鏈上是GAATTC）。大多數(shù)限制性內(nèi)切酶都是將雙鏈DNA切開，形成兩個(gè)粘性末端（帶有與另一末端互補(bǔ)的單鏈）限制性內(nèi)切酶往往與一種甲基化酶同時(shí)成對(duì)的存在，它們具有相同的底物專一性，具有識(shí)別相同堿基序列的能力。核酸的理化性質(zhì)核酸的

8、水解3、酶水解 5NNNNGAATTCNNNN33NNNNCTTAAGNNNN55NNNNG AATTCNNNN33NNNNCTTAA GNNNN5E. coR I核酸的理化性質(zhì)核酸的水解3、酶水解 5NNNNG33NNNNCTTAA55AATTCNNNN3 3GNNNN55NNNNGAATTCNNNN33NNNNCTTAAGNNNN5二、核酸的理化性質(zhì)核酸的紫外吸收1、紫外吸收 DNA和RNA的堿基有共軛雙鍵，而使核酸在240290nm有光吸收，最大吸收在260nm附近。 可用紫外分光光度法進(jìn)行核酸純度鑒定。 純DNA樣品：A260/A2801.8 純RNA樣品：A260/A2802.0 對(duì)

9、純樣品：A=1.0相當(dāng)于50ug/mL雙鏈DNA或40ug/mL單鏈DNA或20ug/mL寡核苷酸。核酸的理化性質(zhì)核酸的紫外吸收2、增色效應(yīng)與減色效應(yīng)核酸的理化性質(zhì)核酸的紫外吸收2、增色效應(yīng)與減色效應(yīng) 有時(shí)核酸溶液的紫外吸收用摩爾磷吸光度表示，根據(jù)磷含量及紫外吸收值然后算出摩爾磷吸光系數(shù)。 (P)=A/cL =30.98A/WL 一般天然DNA的(P)為6600，RNA為77007800。由于單鏈核苷酸的(P)比雙鏈的要高，所以核酸發(fā)生變性時(shí)， (P)升高，故稱增色效應(yīng)；復(fù)性時(shí)(P)降低，稱為減色效應(yīng)。三、核酸的理化性質(zhì)核酸的變性、復(fù)性與雜交1 1、核酸的變性（、核酸的變性（denaturat

10、iondenaturation） 是指核酸的雙螺旋區(qū)的氫鍵斷裂，變成單鏈，并不涉及共價(jià)鍵的斷裂。 變性因素：酸堿、熱、尿素等； DNA熱變性后一些理化性質(zhì)改變： 260nm紫外區(qū)吸收值升高； 粘度降低； 浮力密度升高； 雙折射現(xiàn)象消失； 核酸的理化性質(zhì)核酸的變性、復(fù)性與雜交1 1、核酸的變性（、核酸的變性（denaturationdenaturation）核酸的理化性質(zhì)核酸的變性、復(fù)性與雜交1 1、核酸的變性（、核酸的變性（denaturationdenaturation）用加熱的方法使用加熱的方法使DNADNA變性叫變性叫做做熱變性熱變性DNADNA的變性過程是爆發(fā)性的，的變性過程是爆發(fā)性的

11、，它在很窄的溫度區(qū)間內(nèi)完成。它在很窄的溫度區(qū)間內(nèi)完成。因此，因此，通常將通常將DNADNA的變性達(dá)的變性達(dá)到到50%50%時(shí)，即增色效應(yīng)達(dá)到時(shí)，即增色效應(yīng)達(dá)到一半時(shí)的溫度稱為一半時(shí)的溫度稱為DNADNA的解的解鏈溫度（鏈溫度（melting melting temperature,Tmtemperature,Tm）,Tm,Tm也稱也稱熔解溫度或熔解溫度或DNADNA的熔點(diǎn)。的熔點(diǎn)。一般一般DNADNA的的T Tm m值在值在70-8570-85 C C之間之間核酸的理化性質(zhì)核酸的變性、復(fù)性與雜交1 1、核酸的變性（、核酸的變性（denaturationdenaturation）Tm與下列因素有

12、關(guān)：1）DNA的均一性： 均質(zhì)DNA的熔解過程發(fā)生在一個(gè)較小的溫度范圍內(nèi)；異質(zhì)DNA的熔解過程發(fā)生在一個(gè)較寬的溫度范圍內(nèi)。2）G-C的含量：含量越高，Tm越高； 經(jīng)驗(yàn)公式：G-C%=（Tm-69.3）*2.443）離子強(qiáng)度：I越高，Tm越大，DNA宜保存在高濃度鹽中。核酸的理化性質(zhì)核酸的變性、復(fù)性與雜交1 1、核酸的變性（、核酸的變性（denaturationdenaturation）核酸的理化性質(zhì)核酸的變性、復(fù)性與雜交2、核酸的復(fù)性（Renaturation）變性變性DNADNA在適當(dāng)?shù)臈l件下在適當(dāng)?shù)臈l件下，兩條彼此分開的單鏈可以，兩條彼此分開的單鏈可以重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一過程稱為重

13、新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一過程稱為復(fù)性復(fù)性。DNADNA復(fù)復(fù)性后，一系列物理、化學(xué)性質(zhì)將得到恢復(fù)。性后，一系列物理、化學(xué)性質(zhì)將得到恢復(fù)。DNADNA復(fù)性的復(fù)性的程度、速率與復(fù)性過程的條件有關(guān)。程度、速率與復(fù)性過程的條件有關(guān)。將熱變性的將熱變性的DNADNA驟然冷卻至低溫時(shí)，驟然冷卻至低溫時(shí)，DNADNA不可能復(fù)性。不可能復(fù)性。但是將變性的但是將變性的DNADNA緩慢冷卻時(shí)，可以復(fù)性，這一過程也緩慢冷卻時(shí)，可以復(fù)性，這一過程也叫退火（叫退火（annealing)annealing)。分子量越大復(fù)性越難。濃度越分子量越大復(fù)性越難。濃度越大，復(fù)性越容易。此外，大，復(fù)性越容易。此外，DNADNA的復(fù)性

14、也與它本身的組成的復(fù)性也與它本身的組成和結(jié)構(gòu)有關(guān)。和結(jié)構(gòu)有關(guān)。復(fù)性反應(yīng)的速度用復(fù)性反應(yīng)的速度用CotCot1/21/2衡量。衡量。CoCo為變性為變性DNADNA復(fù)性時(shí)復(fù)性時(shí)的濃度，的濃度，t t為時(shí)間，以秒表示。為時(shí)間，以秒表示。 CotCot1/21/2衡量表示復(fù)性一衡量表示復(fù)性一半時(shí)的半時(shí)的CotCot值。值。2、核酸的復(fù)性核酸的理化性質(zhì)核酸的變性、復(fù)性與雜交核酸的理化性質(zhì)核酸的變性、復(fù)性與雜交2、核酸的復(fù)性核酸的理化性質(zhì)核酸的變性、復(fù)性與雜交3 3、核酸的分子雜交（、核酸的分子雜交（ hybridizationhybridization） 將不同來源的DNA放在試管里，經(jīng)熱變性后，慢慢

15、冷卻，讓其復(fù)性。若這些異源DNA在某些區(qū)斷內(nèi)有相同的序列，則復(fù)性時(shí)，會(huì)形成雜交DNA分子，且DNA與互補(bǔ)的RNA之間也可發(fā)生雜交。核酸的理化性質(zhì)核酸的變性、復(fù)性與雜交3 3、核酸的分子雜交、核酸的分子雜交3 3、核酸的分子雜交、核酸的分子雜交核酸的理化性質(zhì)核酸的變性、復(fù)性與雜交SouthernSouthern印跡雜交（印跡雜交（Southern blotSouthern blot）。是研究DNA圖譜的基本技術(shù)，在遺傳病診斷、DNA圖譜分析及PCR產(chǎn)物分析等方面有重要價(jià)值。Southern印跡雜交的基本方法是將DNA標(biāo)本用限制性內(nèi)切酶消化后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離各酶解片段，然后經(jīng)堿變性，Tris

16、緩沖液中和和高鹽下通過毛細(xì)作用將DNA從凝膠中轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上、烘干固定后即可用于雜交。凝膠中DNA片段的相對(duì)位置在DNA片段轉(zhuǎn)移到濾膜的過程中繼續(xù)保持著，附著在濾膜上的DNA與32P標(biāo)記的探針雜交，利用放射自顯影術(shù)確立探針互補(bǔ)的每一條DNA帶的位置，從而可以確定在眾多消化產(chǎn)物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。核酸的理化性質(zhì)核酸的變性、復(fù)性與雜交3 3、核酸的分子雜交、核酸的分子雜交核酸的理化性質(zhì)核酸的變性、復(fù)性與雜交3 3、核酸的分子雜交、核酸的分子雜交NorthernNorthern印跡雜交（印跡雜交（Northern blotNorthern blot）。）。這是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上的方法。因RNA印跡技術(shù)正好與DNA相對(duì)應(yīng)，故被稱為Northern印跡雜交。Northern印跡雜交的RNA吸印與Southern印跡雜交的DNA吸印方法類似，只是在進(jìn)樣前用乙二醛或甲醛使RNA變性，而不用NaOH，因?yàn)樗鼤?huì)水解RNA的2-羥基基團(tuán)。基因芯片（gene chip）是指將現(xiàn)代探針固相原位合成技術(shù)、照相平板印刷技術(shù)、高分子合成技術(shù)等微電子技術(shù)與分子生物學(xué)技術(shù)