脊髓損傷基因治療的研究進(jìn)展

1、脊髓損傷基因治療的研究進(jìn)展    關(guān)鍵詞： 脊髓損傷 基因治療 1990年美國(guó)首次成功地進(jìn)行腺苷脫胺酸（ adenosine deam inase， aDA）缺乏的基因治療（ gene therapy）以來(lái)，基因治療已成為當(dāng)前生物醫(yī)學(xué)中進(jìn)展最快的領(lǐng)域之一1?；蛑委熢诩顾钃p傷（ spinal cordIn-jury， sCI）后軸突再生中亦可望成為有效的手段之一25。利用外源基因在靶細(xì)胞（包括神經(jīng)元）中的表達(dá)，以改變神經(jīng)元某些內(nèi)在特性，從而進(jìn)一步探索 sCI后神經(jīng)元的存活能力，再生特性和功能恢復(fù)的分子機(jī)理，最終為 sCI的治療探討新途徑是目前治療 sCI

2、的研究方向。它有助于把 sCI治療提到一個(gè)新的水平。值得我們進(jìn)一步研究。一、 sCI基因治療有關(guān)分子生物學(xué)基礎(chǔ)基因轉(zhuǎn)移（ gene transrer）是實(shí)現(xiàn)基因治療的關(guān)鍵技術(shù)6。因此，基因治療的首要步驟是轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的分子構(gòu)建。一般轉(zhuǎn)導(dǎo)基因由目的基因 cDNA，啟動(dòng)子增強(qiáng)子和載體三部分組成。目的基因重組時(shí)除本身特有的（ cD-NA）序列外，通常還需進(jìn)行必要的修飾，如轉(zhuǎn)錄起始修飾，翻譯起始，內(nèi)含子和聚腺苷酸化信號(hào)等的修飾。用于重組的啟動(dòng)子增強(qiáng)子，一般有三種：強(qiáng)組成型（ strongconstita-tive），管家型（ housekeeping），及組織持異型啟動(dòng)子（ tissuesepcific）

3、，其中最常用為第一型7。理想的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移載體要求：轉(zhuǎn)移具有細(xì)胞靶向性，導(dǎo)入基因的表達(dá)可調(diào)控，而且轉(zhuǎn)移的方法簡(jiǎn)便易行。用于 sCI的基因轉(zhuǎn)移載體主要是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（ retroviralvector），即乳腺病毒、莫羅尼小鼠白血病病毒和勞斯肉瘤病毒等。構(gòu)建轉(zhuǎn)錄病毒載體的基本原理是：病毒的長(zhǎng)末端重復(fù)序列（ longterrminalrepeat， lTR）可以對(duì)插入的外源基因進(jìn)行有效轉(zhuǎn)錄，這樣先在體外構(gòu)建反轉(zhuǎn)錄病毒前病毒 dNA載體，即酶切去除基因組中的反式作用區(qū)域（ gag， polenv基因區(qū)域），產(chǎn)生缺陷型的反轉(zhuǎn)錄病毒，這種病毒只具有控制感染和整合的序列（即順式作用區(qū)域）。缺陷型病毒載體

4、必須依賴包裝細(xì)胞提供的蛋白質(zhì)才能完成包裝，產(chǎn)生帶有外源基因的偽病毒。它能感染受體細(xì)胞，載體 dNA將依靠其 lTR整合入受體細(xì)胞染色體基因組，這樣外源基因被帶入宿主細(xì)胞并得以表達(dá)2、3、6、7。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染率高，最常用于體外間接基因治療，其缺點(diǎn)是要求靶細(xì)胞必須有增殖和分裂特性8。此外， cao（1995）9等研究用陽(yáng)離子脂質(zhì)體直接注入 cNS作基因轉(zhuǎn)移獲得成功。但因陽(yáng)離子脂質(zhì)體對(duì) cNS有毒性，故目前致力于發(fā)展非病毒技術(shù)，一種陽(yáng)離子多聚體一聚乙烯亞胺（ polyetnyl enimine）業(yè)已用于基因轉(zhuǎn)移10。另有 selle6（1993）等報(bào)道的復(fù)制缺陷腺病毒也是一種適用于神經(jīng)系統(tǒng)的理

5、想載體。在 sCI治療中，由于受體細(xì)胞要植入脊髓內(nèi)，因此所用受體細(xì)胞應(yīng)當(dāng)符合一定的標(biāo)準(zhǔn)4、6：容易獲取和繁殖；移植后能長(zhǎng)期存活且能繼續(xù)分裂和具有活力。無(wú)免疫源性及形成腫瘤的危險(xiǎn)。目前已用于 sCI試驗(yàn)有雪旺氏細(xì)胞（ schwann cell， sC）和成纖維細(xì)胞2、3、11。此外，肌母細(xì)胞也是具有應(yīng)用前景的較好受體細(xì)胞，研究表明肌母細(xì)胞轉(zhuǎn)移至 cNS至少可活6個(gè)月，且無(wú)腫瘤源性12?；蛑委煹膶?shí)施，有賴于將目的基因準(zhǔn)確、高效地轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞，并使之安全，高效和可控地表達(dá)?；蛑委熤谢蜣D(zhuǎn)移的策略主要有兩種，即活體外法（ exvivo approach）和在體法（ invivo approach）。

6、活體外法就是在體外先對(duì)適當(dāng)細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾，使其表達(dá)和分泌特定的重組蛋白，然后將修飾細(xì)胞移植入活體神經(jīng)組織，通過(guò)神經(jīng)遞質(zhì)替代或神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（ neurotrophic factor， nTF）和其它治療因子的引入恢復(fù)正常的神經(jīng)功能。這種方法尤其適于因缺乏 nTF或神經(jīng)遞質(zhì)前體分子等可擴(kuò)散物質(zhì)所致的 cNS疾病。如帕金森氏?。?parkinson s diesease， pD）及 cNS損傷。在體法是利用適當(dāng)?shù)闹亟M病毒或化學(xué)基因轉(zhuǎn)移載體將目的基因及有治療作用的重組蛋白直接轉(zhuǎn)移，效率較低，故較少采用。此外，活體外法可采用自體的工程細(xì)胞移植，在體外可對(duì)高表達(dá)細(xì)胞克隆進(jìn)行篩選，有效的控制移植細(xì)胞的數(shù)量

7、和質(zhì)量，應(yīng)用立體定位和成像技術(shù)可以將工程細(xì)胞十分準(zhǔn)確地移植到 cNS特定的區(qū)域內(nèi)，以保證在局部產(chǎn)生高濃度的治療因子。二、基因治療 sCI的現(xiàn)狀和展望基因治療 sCI尚處于實(shí)驗(yàn)探索階段。目前，主要是采用 nTF基因修飾雪旺氏細(xì)胞（ sC）或成纖維細(xì)胞后再將其植入鼠的脊髓損傷區(qū)，觀察其軸突再生的情況2、3、11。 tuszyski（1994）11將 nGF基因?qū)肱囵B(yǎng)的 sC內(nèi)，再將 sC移植到損傷的脊髓，發(fā)現(xiàn) sC在體內(nèi)能穩(wěn)定地表達(dá) nGF并促進(jìn)軸突的再生。同年 tuszynski等2利用來(lái)源于莫洛氏鼠白血病的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，將人的 nGF基因?qū)胧蟪衫w維細(xì)胞中，再將成纖維細(xì)胞移植到半橫貫損傷的

8、鼠脊髓中（ t7平面）。1年后成纖維細(xì)胞仍能表達(dá) nGF，電鏡及免疫組化（ cGRP）檢查，發(fā)現(xiàn)有大量的脊髓軸突再生（感覺(jué)纖維）。1996年， tuszynski等3采用同樣方法，又將 nGF基因?qū)氤衫w維細(xì)胞中，并將其移植到半橫斷損傷的鼠脊髓中（ t7平面），14月后，通過(guò) rT pCR技術(shù)鑒定成纖維細(xì)胞仍表達(dá) nGF。電鏡、免疫組化（ gFAP、 cHAT、 tH、5 hT， cGRP）檢查發(fā)現(xiàn)有大量的（感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)）軸突再生。作者在國(guó)際上首次構(gòu)造 po5 flanking介導(dǎo)的21.5KD髓鞘堿性蛋白微基因（暫命名為 pSVPoMcat）的基礎(chǔ)上，通過(guò)陽(yáng)離子脂質(zhì)體導(dǎo)入 sC中，然后再將基因

9、修飾的 sC移植入成鼠半橫斷損傷脊髓，觀察其對(duì) sCI的再生修復(fù)作用，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn) pSVPoMcat微基因修飾 sC對(duì) sCI后細(xì)胞凋亡有抑制作用13。當(dāng)然利用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)治療 sCI，目前還存在一些尚待解決的問(wèn)題，第一是免疫排斥反應(yīng)6，即宿主移植細(xì)胞的免疫排斥。因?yàn)楸M管 cNS的免疫應(yīng)答能力微弱，但對(duì)抗原較強(qiáng)的或種屬相關(guān)較遠(yuǎn)的受體細(xì)胞，仍具有免疫排斥反應(yīng)，因此，在細(xì)胞移植時(shí)應(yīng)給予免疫抑制劑，最好使用自體工程細(xì)胞移植。亦可采用免疫隔離（ immuno isolation）法即使用微囊包膜（ mincroencapsulat）的工程細(xì)胞14。第二是移植細(xì)胞的長(zhǎng)時(shí)間存活問(wèn)題。因?yàn)樵诩?xì)胞移植部位，宿主

10、內(nèi)源性細(xì)胞系統(tǒng)對(duì)局部組織損傷的病理生理反應(yīng)過(guò)程可能使部分移植細(xì)胞死亡。如果移植入外來(lái)組織細(xì)胞的體積較大，還可能對(duì)宿主組織及細(xì)胞產(chǎn)生機(jī)械性擠壓，從而影響其結(jié)構(gòu)與功能的完整性，因此，在移植方式上應(yīng)該使用微移植（ microtransplantation， mit）技術(shù)。 nikknak（1994）15曾采用外徑僅5070 m微管的點(diǎn)移植量為0.2 l，而細(xì)胞密度很大（每微升達(dá)125.0個(gè)），達(dá)到以盡可能小的量，移植盡可能多的細(xì)胞則對(duì)宿主造成的創(chuàng)傷亦小。第三是遺傳修飾細(xì)胞移植后轉(zhuǎn)移基因的表達(dá)可能會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降，以致失去治療作用。故而利用內(nèi)源性或外源性調(diào)節(jié)因子主動(dòng)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移基因的表達(dá)極為重要15。綜上所述，在 sCI的再生修復(fù)治療中，盡管基因轉(zhuǎn)移所取得的結(jié)果均來(lái)自實(shí)驗(yàn)報(bào)告，但卻具有十分誘人的臨床應(yīng)用前景。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，我們可以把有絲分裂促進(jìn)劑的基因插入在成熟神經(jīng)元的基因組、成熟神經(jīng)元便有可能一改不能分裂